超声心动图方法和协议心脏瓣膜疾病的综合表型特征小鼠

摘要

This protocol provides a detailed description of the echocardiographic approach for comprehensive phenotyping of heart and heart valve function in mice.

摘要

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in rodents, with detailed descriptions of the appropriate methods for anesthesia, the echocardiographic windows used, the imaging planes and probe orientations for image acquisition, the methods for data analysis, and the limitations of emerging technologies for the evaluation of cardiac and valvular function. Importantly, we also highlight several future areas of research in cardiac and heart valve imaging that may be leveraged to gain insights into the pathogenesis of valve disease in preclinical animal models. We propose that using a systematic approach to evaluating cardiac and heart valve function in mice can result in more robust and reproducible data, as well as facilitate the discovery of previously underappreciated phenotypes in genetically-altered and/or physiologically-stressed mice.

引言

衰老与心血管钙化¹逐步增加有关。血液动力学显著主动脉瓣狭窄影响了人口的65 ²岁以上的3％，而患者甚至中度主动脉瓣狭窄（3-4米/秒峰值速度）小于40％，5年无事件生存率^3。目前，有减缓主动脉瓣钙化的进展没有有效的治疗，和手术主动脉瓣置换为先进主动脉瓣狭窄⁴唯一可用的治疗方法。

旨在获得有助于启动和主动脉瓣钙化进展的机制有更深的了解研究是在走向药理和非手术方法来管理主动脉瓣狭窄^5,6的关键的第一步。遗传学LY-改造的小鼠都起到了我们的开发有助于各种疾病，现在即将旨在了解主动脉瓣狭窄^6，7，8的生物学机理研究的最前沿机制的理解了重大作用。不像其他心血管疾病如动脉粥样硬化和心脏衰竭，其中用于评估血管和心室功能标准协议是行之有效的，存在与小鼠心脏瓣膜功能的体内表型相关的独特的挑战的大部分。虽然最近的评论已提供了有关的优点和缺点，以众多的成像和用于评估在啮齿类动物中^9，10，11阀功能侵入性的方式充分的讨论，到今天为止，我们不知道它提供了一个COMPRE出版物的hensive，一步一步在小鼠表型心脏瓣膜功能的协议。

本手稿的目的是描述该方法和协议，以表型心脏瓣膜功能的小鼠。所有的方法和程序，已通过梅奥诊所的机构动物护理和使用委员会。该协议的主要内容包括麻醉深度，心功能的评价，和心脏瓣膜功能的评价。我们希望这份报告不仅有利于引导有兴趣在心脏瓣膜病领域追求研究调查，但也将启动相关协议标准化，以确保在这一快速增长的领域数据的重现性和有效性的国家和国际对话。重要的是，采用高分辨率超声系统成功成像需要的超声（和术语在超声常用）的原理的工作知识，基本的原理与的理解心脏生理学，并用超声显著经验的莱斯以允许在啮齿类动物心脏功能的准确时间效率的评估。

研究方案

1.准备材料和设备（表1和图1）

1. 打开超声机上。输入动物ID，日期和时间（串行成像实验）及其他相关信息。
2. 使用高频超声换能器，40兆赫成像小鼠小于约20 g或小鼠大于约20 g以上30兆赫。
3. 该平台连接到心电图（ECG）监测成像心电门控的某些方式。
   注:重要的是，这也允许对心脏心率（HR），它可以用作麻醉的适当深度的多个索引中的一个的瞬时计算。
4. 预加热平台至37℃。
   注:所有市售的超声设备有一个控制面板，提供图像采集控制和研究管理控制为B型，M型和多普勒超声心动图。一种心测量工具嵌入在机器的自动测量和心脏瓣膜和常见功能超声心动图参数计算。

2.准备鼠标麻醉的成像和感应

1. 轻轻拿起它的尾巴鼠标，并在其颈背牢牢占据动物。
2. 引导动物的鼻子到鼻锥。开始在1％异氟烷麻醉流动。确保动物在3-5敞口之气镇静。
3. 快速，准确地躺在平台上的动物仰卧位，确保前肢和后肢足趴在平台上的心电图传感器。
4. 轻轻地用固定在四肢胶带动物，轻轻敷胶纸以稳定鼻锥装置中的头，并应用胶带以稳定尾巴。这两个后脚和前脚应平放，确保生理成像系统稳定和清晰的ECG信号采集。
5. 检查人力资源。这种使用IMA做更改平台心电图功能，或者与外部ECG设备。确保基础心率是700 BPM 600之间。确保HR不低于450 BPM在任何情况下。
   注:在实验过程中，人力资源可能会降低略微由于麻醉，但应高于在大多数情况下500 BPM。
6. 调节由相应小增量（〜0.1％的增量每隔15秒，直到达到麻醉的稳定状态）的麻醉流动。
   注:麻醉的稳定状态，是指上述的心脏参数被保持（参见步骤2.5）和动物没有公开响应从各种成像窗口探针的放置对刺激的条件。重要的是，这是不麻醉的手术平面，这导致显着的心脏抑制小鼠。在长时间成像会议，建议兽医软膏眼睛防止干燥的应用。
7. 检查使用直肠温度计体温。保持36.5℃，38℃之间的温度。
   注意:在一个适当的环境受控室和在加热的平台，体温（直肠测量）保持在整个过程中恒定，因此，是不随时间影响心血管血液动力学一个混杂因素。
8. 剃掉使用电剪设计用于与细发用从胸口发。擦拭胸部用湿纸巾。动物准备成像。
   注意:虽然也可以执行化学去除的毛发，避免使用这样的化合物，因为它们可以通过在长期实验时间引起显著皮肤刺激。此外，适当的应用程序和去除这种化学基脱毛产品可以通过2-3分钟（〜10-20％）延长麻醉曝光的持续时间。从麻醉诱导皮肤准备完成的总时间应小于3分钟。

_title"> 3。按照基本原则和准则获取心脏超声图像

注意:有在获取图像使用了三个超声模式:B型/ 2-D，M型和多普勒（光谱的脉冲波的多普勒和彩色血流多普勒成像）。有用于获取心脏和心脏瓣膜的图像两个基本传感器的位置:胸骨旁和心尖窗口（ 图2）。

1. 从每个换能器的位置，通过手动旋转和调角传感器获得相对其长轴和短轴的心脏的多个断层图像。
   注:旋转指枢转或扭转从胸壁的固定位置的传感器，而角是指换能器的一侧到另一侧的运动从胸壁的固定点。所有超声换能器具有一个凹槽（凹口），外部肋条，或按钮形式的图像索引标记。
2. 确保超声SIG纳尔是通过相应地调整换能器的位置在垂直于靶结构。
3. 通过超声波束平行于流动所发送的对准优化彩色流动和峰值速度信号。超声波束和流之间的角度应小于60°。
4. 优化使用控制面板控制图像质量。只有审讯的区域应填补的图像显示。
   注:在传感器和平台位置精确调整几乎总是必要的，以获得清晰的图像。即使在最佳条件下，呼吸运动，胸壁解剖（ 例如小间距肋骨），和变化内部解剖（包括内在的和疾病引起的）可以限制声窗，使图像采集非常具有挑战性。
5. 当测量M型和2-D / B模式左心室尺寸，放置在测量卡尺在最连续回波线。
6. 调整彩色多普勒部门的通过调整扇区控制，这是在面板上发现D采样体积询问的面积。
   注:在多普勒研究中的颜色编码方案表示的速度和血液流动的方向性。是红色多普勒信号指示朝向传感器层的血流。这是蓝色的多普勒信号表明层流从传感器路程。 A"马赛克"的彩色图案表示动荡或者非层血流量（这通常发生在瓣膜狭窄或瓣膜返流）的地区。
7. 记录最少两个5秒条（或100帧）的实时B-模式/ 2D从离线分析每个成像窗口呼应。
   注:市售的回声机器具有图像获取的设置，捕捉帧或电影圈尺寸的预先设定的次数。图像获取的设置可以被修改，使得较长的电影循环可以获取。高品质的图像采集需要丰富的经验和实验。 Investigators必须找到探头的位置和角度的平台的正确组合，从许多意见和隔声窗获取图像。

4.主动脉瓣的评估（AV）功能

注意:主动脉瓣膜功能的评估包括所述阀的定性评价（ 例如，感知尖厚度，增加的回声由于瓣膜钙化，以及存在或不存在使用彩色多普勒返流喷射）和阀功能的定量测量（ 例如，峰值瓣速度和尖点的间隔距离）。

1. 开始图像通过选择B模式图像采集的主动脉瓣。
2. 与牢固地固定在平台和背离研究者远离头部上的动物，倾斜表15-20°到左边。这将促进心脏和向左，更贴近胸壁。在一个应用上的超声波换能器凝胶慷慨金额或直接nimal的胸部。
3. parasternally传感器，约90°与心脏的长轴垂直，与转换向后指向（ 图2）的图像索引标记的位置。而在2D / B模式，直到AV映入眼帘的滑动传感器头侧。这是在主动脉瓣的"短轴"图。
   注:正常主动脉瓣具有三个薄尖即在心脏收缩期打开广泛和舒张期间充分关闭，以便不存在的血液返流回到左心室。尖点非常薄，移动非常迅速，而且可以经常有挑战性的可视化。
4. 换能器旋转，直至尾侧图像索引标记点旋转。观察主动脉根部，主动脉瓣，左心室流出道，二尖瓣，左心房，并在图像显示器上的右心室流出道的一部分。
   注:这是AV的"胸骨旁长轴"的说法。超声检查应确定有贯穿在B模式图像中的心脏周期，这将允许为随后M-模式成像和分析（见下文）可见2主动脉瓣尖。
5. 评价这种观点主动脉根部。小心来回扫使得主动脉根部图像包含主动脉根的最大尺寸。测量使用具有嵌入在设备中的测量工具关联的电子卡尺主动脉的最大前 - 后尺寸。
6. 定位在长轴主动脉瓣。使得仅在主动脉瓣是在图像显示上通过在控制面板调节图像宽度按钮缩小图像宽度。审讯的M型线在那里相交的主动脉瓣的提示，以准确评估主动脉瓣尖分离位置。
7. 在主动脉瓣的M模式显示，测量使用与测量电相关联的电子卡尺尖间隔距离（盒状外观的收缩）嵌在机键相工具。
   注:M型成像的最大优点是非常高的时间分辨率，这对于主动脉瓣膜功能的评价是至关重要的。而在AV的M型图像可以在短期和长轴视图被收购，胸骨旁长轴观一般优选的，因为成象平面允许声谱仪来容易地识别的尖端的方向和位置收缩期尖。
8. 尽管仍然在主动脉瓣的胸骨旁长轴观，按控制面板上的彩色多普勒控制键。应用颜色多普勒到主动脉瓣的区域。
   注意:从左心室通过主动脉瓣收缩期间正常流量是朝向换能器，因而被编码的红色。
9. 记录主动脉瓣关闭不全的存在或不存在。
   注:主动脉瓣关闭不全是舒张期间发生并且被引导从transduc远的异常流量ER;因此，它被编码为蓝色。
10. 按脉冲多普勒控制键。使用位于控制面板轨迹球，将脉冲波的样品体积在近端升主动脉，只是主动脉瓣以上，确保超声波束和血流之间的角度小于60°倾斜的平台和/或换能器。如果可能的话，获得从胸骨上切迹窗口跨主动脉瓣的峰值速度。
11. 测量从光谱显示使用具有嵌入在所述机器（ 图3C和3F）测量工具关联的电子卡尺峰值速度。
    注:马赛克色彩代表高流速是可能包含非层流模式。

5.评估二尖瓣（MV）功能

注意:二尖瓣功能的评价包括阀的定性评价（ 例如，每可察觉风口浪尖的厚度，回声增强，由于瓣膜钙化，有无彩色多普勒）反流喷气机和瓣膜功能的定量措施。

1. 放置换能器在B模式心尖的位置。使得其朝向鼠标（ 图2C）的头部倾斜的换能器的位置。观察图像显示右心室（RV），左心室（LV），右心房（RA）和左心房（LA）。手动倾斜平台稍稍使动物处于"头下"位置，因为它通到低压形象化二尖瓣。
   注:心尖四腔心切面是整个二尖瓣和三尖瓣，以及二尖瓣环的组织速度检查血速度的最佳视图。这也是评估RV及室间隔运动和大小美景。
2. 从心尖四腔视图，通过降低图像宽度带来二尖瓣聚焦。观察到二尖瓣瓣叶出现两个薄，移动细丝打开和每个心动周期中关闭。
   注:"正常"小鼠的二尖瓣小叶可以是困难的，如果成像是在生理HR（ 即 > 450 BPM）进行可视化。
3. 将M型光标跨二尖瓣评估小叶的厚度。
   注:前小叶在收缩最好显现时，它是在垂直于超声波束（ 图4）。
4. 使用心尖四腔心切面，舒张期通过二尖瓣应用彩色多普勒成像从左心房流。观察二尖瓣关闭不全。
   注:流量朝向换能器，因而被编码的红色。反流将被编码的蓝色和收缩（ 图5）的过程中发生。
5. 使用心尖长轴视图，切换到脉冲波模式。移动多普勒取样容积的提示二尖瓣瓣叶。注意二尖瓣血流频谱显示的两个峰。如果传单没有充分显现，用彩色多普勒有鲜红或镶嵌彩色图案识别区，并放置在该点的样品体积。
   注:二尖瓣血流频谱显示在慢小时（<450 BPM）两个峰。在正常小时（> 450 BPM），早发的（E）和晚期填充（A）流融合。跨二尖瓣血流的频谱多普勒显示左室舒张功能用于评估（见步骤7.5）。

6.右心瓣膜功能评价

注:三尖瓣和肺动脉瓣组成右路心脏瓣膜。三尖瓣可容易地显现在心尖长轴视图，而肺动脉瓣可以在两个胸骨旁长期和短轴视图来可视化。

1. 从心尖长轴观，倾斜或点传感器尖端ü唱摇摆运动，使得右心室是在图像显示的中心。这样只有右心室是在图象显示可见降低图像宽度。
2. 在同一图像平面，可视化的三尖瓣瓣叶，这似乎右心房和右心室，而开放和关闭在每个心动周期的过程之间的薄，移动细丝。
3. 在三尖瓣区应用彩色多普勒。注意三尖瓣关闭不全。
   注:舒张期间发生正常流动，朝向换能器，因而被编码的红色。发生异常返流收缩期间，是针对从换能器远离，因此，被编码的蓝色。该反流束的峰值速度来估计右心室收缩压。
4. 移动换能器到胸骨旁短轴位置在主动脉瓣的级别。上面的主动脉瓣是右心室OUTF低道，肺瓣，近端主肺动脉，右和左肺动脉（ 图6）。
5. 换能器顺时针改性胸骨旁长轴位置转动。然后倾斜传感器稍微向上以获得肺动脉瓣的短轴图。
6. 在此视图中，应用M型成像来评估肺瓣尖（ 图7）的分离距离。
7. 应用颜色多普勒在肺动脉瓣的区域，以评估瓣膜反流（舒张期间一个马赛克图案，高速喷射）和狭窄（心脏收缩期间一个马赛克图案，高速喷射）。
8. 按脉冲波控制键，然后将样品体积只是肺动脉瓣后。
   注:流的频谱多普勒显示的分析被用于估计肺动脉压（ 图8）。

7.心脏功能评价

注意:心脏功能的评价包括左心室收缩的定性评价（ 例如，射血分数，区域壁运动异常，和壁的感知厚度的视觉估计）和左心室的定量测量功能（ 例如，射血分数，左室质量，左室舒张功能，心肌性能指标）。

1. 获得在2D / B模式的LV短轴视图，在乳头肌水平胸骨旁短轴位置换能器。移动所述转换器的上下，从基部到顶点扫描的LV。请遵守室壁运动异常。
2. 从左心室的胸骨旁短轴观，按M模式按钮，位于控制面板。使用跟踪球，定位M型光标在左心室腔的中心在乳头肌和obtai的水平N个M模式的图像。
3. 测量舒张末期，其中前壁和后壁之间的距离是最大的，并在结束收缩，其中两个前壁和后壁的内运动是最大（ 图9）的左心室腔尺寸。
4. 在测量结束舒张和收缩末期的前后壁的厚度。
   注意:当乳头肌是确保正确的成像面的重要地标，注意不要将其包含在任何测量。
5. 移动换能器的顶端的窗口。请参阅步骤5.1。评估使用跨二尖瓣血流脉冲多普勒在心尖长轴观的左室舒张功能。
6. 发生在二尖瓣瓣叶尖端的样本量。测量从脉冲波的多普勒速度的跨二尖瓣频谱显示峰值二尖瓣流入速度。
7. LV INFL之间的样本容量位置流和外流。注意二尖瓣和主动脉瓣关闭和开启的信号。测量容舒张时间，等容收缩时间，和左心室射血时间（ 图10）。
8. 在心尖长轴视图下进行二尖瓣环组织多普勒成像（TDI）。按TDI控制键和放置样品体积在二尖瓣环的内侧面。确保样本量不会对二尖瓣瓣叶染指。保持0.21毫米和0.27毫米的多普勒取样容积大小。测量二尖瓣环（ 图11）的舒张早期速度（E'）。

8.最后的步骤

1. 查看获得的图像。确定该获得所有必需的图像。
2. 从鼠标的胸部取出多余的超声凝胶，轻轻地取下胶带固定到位的动物。关闭麻醉。
3. 放置动物上的吸收性纸巾（未寝具，其可以被吸入或能阻断恢复期间的气道）。观察动物的胸骨斜卧直至达到。如果麻醉适当的管理，恢复应在30秒到60秒发生。

结果

该例行从动物心脏超声成像获得的图像的示例包括在本手稿。传感器安置在动物的胸部一个例证是提供给读者的，其中传感器被定位为，从而获得图像清晰的认识。也包括在超声实验室的建立的照片强调适当的设备，特别是超声换能器中使用和麻醉的方法的重要性。的2D / B模式，M模式，并且正常和异常阀，左，右心室，和主动脉根部的颜色和多普勒显示器被适当标记。虽...

讨论

麻醉诱导

适当的麻醉诱导和维持是在心脏瓣膜小鼠变化的准确评估和心脏功能的关键。由于麻醉的快速诱导异氟醚和以下深度麻醉这一麻醉药的相对较长的洗出时间引起的，我们不使用一个独立的腔麻醉诱导。相反，如在详细说明以上，动物被直接引导至麻醉锥，其允许在相对较低的浓度的麻醉剂的麻醉的快速和受控诱导。

小鼠大多数菌株在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
High resolution ultrasound machine	VisualSonics, Fujifilm	Vevo 2100
Isoflurane diffuser (capable of delivering 1 % to 1.5 % isoflurane mixed with 1 L/min 100% O2	VisualSonics, Fujifilm	N/A
Transducers for small mice (550D) or larger mice (400)	MicroScan, VisualSonics, Fujifilm	MS 550D, MS 400
Animal platform	VisualSonics, Fujifilm	11503
Advanced physiological monitoring unit	VisualSonics, Fujifilm	N/A
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-019-10
Nose cone and tubing connected to isoflurane diffuser and 100% O2	Custom Engineered in-house	--
Hair razor	Andis Super AGR+ vet pack clipper	AD65340
Ultrasound gel	Parker Laboratories	REF 01-08
Electrode gel	Parker Laboratories	REF 15-25
Adhesive tapes	Fisher Laboratories	1590120B
Paper towels