マウスの弁膜症の包括的表現型の特徴のための心エコーアプローチとプロトコル

要約

This protocol provides a detailed description of the echocardiographic approach for comprehensive phenotyping of heart and heart valve function in mice.

要約

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in rodents, with detailed descriptions of the appropriate methods for anesthesia, the echocardiographic windows used, the imaging planes and probe orientations for image acquisition, the methods for data analysis, and the limitations of emerging technologies for the evaluation of cardiac and valvular function. Importantly, we also highlight several future areas of research in cardiac and heart valve imaging that may be leveraged to gain insights into the pathogenesis of valve disease in preclinical animal models. We propose that using a systematic approach to evaluating cardiac and heart valve function in mice can result in more robust and reproducible data, as well as facilitate the discovery of previously underappreciated phenotypes in genetically-altered and/or physiologically-stressed mice.

概要

エージングは、心血管石灰化¹の漸進的増加と関連しています。血行動態的に重要な大動脈弁狭窄症は、65 ²歳以上の人口の3％に影響を及ぼし、さらには中程度の大動脈弁狭窄（3-4メートル/秒のピーク速度）を有する患者は、40％未満の5年無イベント生存率を持っています^3。現在、そこに大動脈弁の石灰化の進行を遅らせるために有効な治療法はなく、外科的大動脈弁置換術は、高度な大動脈弁狭窄⁴のための唯一の可能な治療です。

大動脈弁石灰化の開始および進行に寄与するメカニズムのより深い理解を得ることを目的とした研究は、大動脈弁狭窄^5、6を管理するため^の薬理学的および非外科的方法に向かって移動中の重要な最初のステップです。遺伝学的なLY-変更されたマウスは、種々の疾患に貢献し、今大動脈弁狭窄^6、7、8の生物学を理解することを目的とした機構研究の最前線に来ているメカニズムの理解を開発する上で大きな役割を果たしてきました。アテローム性動脈硬化症や心不全、血管および心室機能を評価するための標準プロトコルは大部分がされているような他の心血管疾患とは異なり、マウスにおける心臓弁の機能のin vivoでの表現型に関連付けられている固有の課題は、十分に確立された-があります。最近のレビューは、多数のイメージングおよびげっ歯類^9、10、11における弁の機能を評価するために使用侵襲的モダリティの長所と短所についての徹底的な議論を提供してきたが、今日まで、私たちはCOMPREを提供する出版物を認識していませんhensive、マウスでは心臓弁の機能を表現型のためのステップバイステップのプロトコル。

本稿の目的は、マウスにおける心臓弁の機能を表現型にする方法およびプロトコルを記述することです。すべての方法及び手順は、メイヨークリニック制度動物実験委員会によって承認されています。このプロトコルの主な構成要素は、麻酔の深さ、心機能の評価、および心臓弁の機能の評価を含みます。我々は、この報告書は、心臓弁疾患の分野の研究を追求に興味を持って研究者を案内するのに役立つだけでなく、この急速に成長している分野で、データの再現性と妥当性を確保するためのプロトコル標準化に関連する国内および国際的な対話を開始することを願っています。重要なことには、高解像度の超音波システムを使用して成功したイメージングは​​、基本Principでの理解を加工超音波検査の原理の知識（及び一般的に超音波検査で使用される用語）を必要とレ心臓生理学、およびげっ歯類における心機能の正確かつ時間効率の評価を可能にするために超音波検査での豊富な経験の。

プロトコル

1.材料および装置（表1、図1）を準備

1. 超音波装置の電源をオンにします。動物のID、日付、および時刻（シリアルイメージング実験用）、およびその他の関連情報を入力します。
2. 高周波超音波トランスデューサー、〜20グラムまたは20グラム〜より大きいマウスについての30 MHzのより小さいイメージングマウス用の40MHzを使用してください。
3. 特定のモダリティのためのイメージングのECGゲーティングを監視心電図（ECG）にプラットフォームを接続します。
   注：批判的に、これはまた、麻酔の適切な深さのいくつかの指標の一つとして用いることができる心拍数（HR）の瞬間的な計算を可能にします。
4. 37°Cのプラットフォームを事前に加熱します。
   注：すべての市販の超音波機器は、Bモード、Mモード、ドップラー心エコー検査のための画像取得を制御し、試験管理制御を提供する制御パネルを有しています。心臓測定ツールは、自動測定用のマシンに埋め込まれています心臓や弁膜機能の一般的な心エコーパラメータの計算。

2.イメージングと麻酔の誘導のためにマウスを準備

1. そっと尻尾によるマウスをピックアップし、しっかりと首のうなじに動物を保持します。
2. ノーズコーンに動物の鼻を導きます。 1％のイソフルランで麻酔の流れを開始します。動物がガスへの曝露の3〜5秒以内に鎮静剤を投与されていることを確認してください。
3. 迅速かつ正確に前足と後足がプラットフォームのECGセンサ上に存在することを確認し、仰臥位でプラットフォームに動物を置きます。
4. 穏やかにノーズコーン装置ヘッドを安定化し、尾を安定化させるために接着テープを適用するために接着テープを適用軽く、すべての四肢の粘着テープで動物を固定します。後足と前足の両方が生理的イメージングシステムにより、安定したクリアなECG信号の取得を確実にするために平らになるように置いてください。
5. HRを確認してください。 IMAを使用してこれを行ってくださいECG機能を持つ、または外部ECGデバイスとプラットフォームを銀杏。ベースラインのHRは600〜700 bpmの間にあることを確認してください。 HRはどのような状況の下で450 BPMを下回らないことを確認してください。
   注：手順の間、HRが原因麻酔に若干低下することがありますが、それはほとんどの場合で500拍以上である必要があります。
6. （麻酔の安定状態に達するまで〜0.1％ずつ15秒毎）に応じて少しずつ麻酔の流れを調整します。
   注：麻酔の安定状態は、上述した心臓パラメータが維持されている（ステップ2.5を参照）、動物が公然と様々な撮像ウインドウ上のプローブの配置からの刺激に応答しない状態です。重要なことは、これは、マウスでマークされたcardiodepressionになり、麻酔の外科的平面ではありません。長時間のイメージングセッションでは、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏の適用が推奨されます。
7. 直腸体温計を使用して体温をチェックしてください。 36.5°Cと38°Cの間の温度にしてください。
   注：適切に環境制御室では、加熱プラットフォーム上で、体温（直腸に測定されたが）結果的に、時間をかけて心血管血行動態に影響を与える交絡因子ではない、全体の手順の間に一定のままと。
8. 細かい毛で使用するために設計された電気バリカンを使用して、胸から毛を剃り落とします。湿らせたペーパータオルできれいな胸を拭いてください。動物は、イメージングのための準備ができています。
   注：これらは、長期実験で経時的に有意な皮膚刺激を引き起こすことができるように毛の化学的除去はまた、そのような化合物の使用を回避するため、実行することができるが。さらに、そのような化学ベースの脱毛製品の適切な適用および除去は、2~3分（〜10〜20％）により麻酔曝露の持続時間を延長することができます。麻酔導入から皮膚の準備が完了するまでの合計時間は3分未満を取る必要があります。

_title "> 3。心臓超音波画像を取得する際に基本原則とガイドラインに従ってください

注：Bモード/ 2-D、Mモード、ドプラ（スペクトルパルス波ドップラーおよびカラーフロードップラー画像）の3つの画像を取得する際に使用される超音波モダリティがあります。胸骨傍と頂端の窓（ 図2）心臓及び心臓弁の画像を取得するために使用される二つの基本的なトランスデューサの位置があります。

1. 各トランスデューサの位置からは、手動で変換器を回転させるとangulatingによってその長軸と短軸に、心臓の相対的な複数の断層画像を得ます。
   注：アンギュレーションが胸壁上の固定点からトランスデューサの端から端まで移動することをいうながら回転は、ピボットまたは胸壁上の固定位置からトランスデューサをねじることをいいます。全ての超音波トランスデューサは、溝（ノッチ）、外部リブ、またはボタンの形で画像インデックスマーカーを持っています。
2. ことを確認した超音波SIGNALは、それに応じてトランスデューサの位置を調整することによって、標的構造に対して垂直です。
3. フローに送信された超音波ビームを平行に整列させることによってカラーフローおよびピーク速度信号を最適化します。超音波ビームと流れとの間の角度は60°未満であるべきです。
4. コントロールパネルのコントロールを使用して、画質を最適化します。取り調べの領域のみが画像表示を埋める必要があります。
   注：トランスデューサとプラットフォームの位置の微調整はほとんど常に鮮明な画像を得るために必要です。でも内部の解剖学で最適な条件、呼吸運動、胸壁の解剖学（ 例えば、小リブの間隔）、および変形中に（固有および疾患誘発性の両方）は、音響窓を制限し、画像取得が非常に困難にすることができます。
5. Mモードと2-D / Bモードでの左心室の寸法を測定する場合、ほとんどの連続エコーラインで測定キャリパーを配置します。
6. カラードップラーセクターANを調整パネル上で検出されたセクタの制御を調整することによって質問の面積Dサンプル体積。
   注：ドップラー研究で色符号化方式は、血流の速度及び方向性を示しています。赤ドップラー信号は、変換器に向かって層状の血流を示しています。青色であるドップラー信号は、トランスデューサから離れる層流を示しています。 「モザイク」カラーパターンは、（一般的に弁膜狭窄症または弁膜逆流で発生する）乱流または非層の血流の領域を示しています。
7. オフライン分析のための各撮像窓からのリアルタイムのBモード/ 2Dエコーの2つの5秒のストリップ（または100フレーム）の最小値を記録します。
   注：市販のエコーマシンがフレームまたはシネループサイズの予め設定された番号をキャプチャ画像取得の設定を持っています。長いシネループを取得することができるように、画像収集の設定を変更することができます。高品質な画像の取得は、豊富な経験と実験が必要です。 Investigatorsは、多くのビューや音響窓から画像を取得するために、トランスデューサの配置とプラットフォームの角度の適切な組み合わせを見つける必要があります。

4.大動脈弁の評価（AV）機能

注：大動脈弁機能のアセスメントは、バルブの定性評価（ 例えば、知覚されるカスプ厚増加による弁石灰化にエコー輝度、およびプレゼンスやカラードプラを用いて、逆流ジェットの不在）とバルブ機能の定量的尺度を含む（ 例えば、ピークtransvalvular速度およびカスプ分離距離）。

1. Bモード画像の取得を選択して画像に大動脈弁を始めます。
2. しっかりプラットフォームと離れた研究者から直面して頭の上に固定した動物では、左側のテーブル15-20°を傾けます。これは、胸壁に近い、前方心と左方向をもたらすでしょう。 Aの上に直接変換器に超音波ゲルの寛大な量を適用しますか、ニマルの胸。
3. 後方に向いてトランスデューサ（ 図2）の画像インデックスマーカーを有する心臓の長軸と約90°垂直parasternallyトランスデューサを、置きます。 AVが見えてくるまで、2D / Bモードにある間、トランスデューサ頭をスライドさせます。これは、大動脈弁の「短軸」の図です。
   注：通常の大動脈弁は、収縮期に広く開いて、血液のない逆流が戻って左心室に存在しないように、拡張期に十分に閉じて3薄い尖を持っています。カスプは非常に急速に移動し、非常に薄く、そして多くの場合、視覚化するために挑戦することができます。
4. 画像インデックスマーカーポイントの尾側までトランスデューサを時計回りに回転させます。大動脈基部、大動脈弁、左心室流出路、僧帽弁、左心房、および画像表示上の右心室流出路の一部を観察します。
   注：これはAVの「傍胸骨長軸」の図です。音波検査すべきその後のMモード画像および分析（下記参照）を可能にするBモード画像で心臓サイクル全体を通して見える2大動脈弁尖があることを確かめます。
5. このビューで大動脈根を評価します。大動脈基部の画像は大動脈基部の最大寸法が含まれるように慎重に前後に掃引。マシンに埋め込まれた測定ツールに関連する電子キャリパーを使用して、大動脈の最大の前後寸法を測定します。
6. 長軸で大動脈弁の位置を確認します。唯一の大動脈弁は、コントロールパネルの画像の幅ボタンを調整することにより、画像表示になるように画像の幅を減らします。それは正確に大動脈弁尖の分離を評価するために大動脈弁の先端と交差尋問のMモードラインを配置します。
7. 大動脈弁のMモード表示では、measurに関連する電子キャリパーを使用して、カスプ分離距離（収縮期中の箱のような外観）を測定マシンに埋め込まementツール。
   注：Mモード画像の最大の利点は、大動脈弁の機能を評価するために必須である非常に高い時間分解能です。 AVのMモード画像は、短期および長期軸ビューの両方で取得することができるが、撮像面は検査技師が容易に先端の向きと位置を識別することができるので、胸骨傍長軸図が一般的に好ましいです収縮期に尖。
8. まだ大動脈弁の傍胸骨長軸ビューで、コントロールパネルのカラードプラコントロールキーを押しながら。大動脈弁の領域にカラードップラーを適用します。
   注：収縮期に大動脈弁を通して左心室からの通常の流れは、トランスデューサに向かっているので、赤の符号化されています。
9. 大動脈弁逆流の有無を文書化します。
   注：大動脈弁逆流は、拡張期に発生した異常な流れであるとtransducから離れて向けられていますえー。したがって、青色符号化されます。
10. パルス波ドップラーコントロールキーを押してください。コントロールパネルにあるトラックボールを使用して、超音波ビームと血流との間の角度が傾斜させることにより60°未満であることを確認して、ちょうど大動脈弁上に、近位上行大動脈にパルス状波サンプルボリュームを配置プラットフォームおよび/またはトランスデューサ。可能な場合は、胸骨上切痕ウィンドウから大動脈弁全体のピーク速度を得ます。
11. マシン（ 図3Cおよび3F）に埋め込まれた測定ツールに関連する電子カリパスを用いてスペクトル表示のピーク速度を測定します。
    注：モザイクカラーは、非層流パターンを含む可能性がある高流速を示しています。

僧帽弁（MV）関数の5評価

注：僧帽弁機能の評価は、バルブの定性的な評価を（ 例えば、当たりceivedカスプ厚起因弁石灰化、カラードップラーを用いて、逆流ジェットの存在または非存在）とバルブ機能の定量的な対策にエコー源性を増加させました。

1. Bモードでの頂端の位置に変換器を配置します。それはマウス（ 図2C）の頭部に向かって傾斜しているように、変換器を配置します。右心室（RV）を観察し、左心室（LV）、右心房（RA）、および画像ディスプレイ上心房（LA）を残しました。動物は、それはLVに開くと僧帽弁を視覚化する「ヘッド・ダウン」の位置にあるように、手動で少しプラットフォームを傾けます。
   注：頂端4室ビューが僧帽弁と三尖弁のほか、僧帽弁輪の組織速度を横切って血流速度を調べるための最適な図です。これはまた、RVおよび心室中隔の動きや大きさを評価するための良い図です。
2. 心尖部4腔像からは、画像の幅を減少させることによって、焦点の僧帽弁をもたらします。僧帽弁尖が2つの薄い、モバイルフィラメントが開き、各心周期中に閉鎖として表示されていることを確認します。
   注：「ノーマル」マウスの僧帽弁リーフレットは、イメージングは、生理学的HR（ すなわち、> 450 BPM）で行われた場合に可視化することは困難です。
3. リーフレットの厚さを評価するために、僧帽弁全体でMモードカーソルを置きます。
   注：それは超音波ビーム（ 図4）に垂直であるとき、前尖が最高の収縮期に可視化されます。
4. 心尖部4腔像を使用して、拡張期僧帽弁を介して画像を左心房からの流れをカラードップラーを適用します。僧帽弁逆流のために確認します。
   注：フローは、トランスデューサに向けられているため、赤色の符号化されています。逆流の流れは青エンコードされ、収縮期（ 図5）の間に発生します。
5. 頂端長軸ビューを使用して、パルス波モードに切り替えます。の先端にドプラサンプルボリュームを移動僧帽弁尖。僧帽弁流入スペクトル表示の2つのピークを注意してください。リーフレットはよく可視化されていない場合は、明るい赤またはモザイク色のパターンで領域を識別し、その時点でサンプルボリュームを配置するカラードップラーを使用しています。
   注：僧帽弁の流れのスペクトル表示が遅いのHR（<450 BPM）で2つのピークを有しています。通常の時間で（> 450 BPM）、早期（E）および後期充填は、（A）フローが融合しています。僧帽弁を横切る流れのスペクトルドップラ表示は、左心室拡張期機能（ステップ7.5参照）の評価に使用されます。

右側心臓弁の機能の6評価

注：三尖弁及び肺動脈弁は、右側心臓弁を備えます。肺動脈弁は胸骨傍の長短軸の両方のビューにおいて可視化することができるが三尖弁を容易に、頂端の長軸像で可視化することができます。

1. 頂端長軸から見ると、トランスデューサの先端のuを傾けたりポイント右心室は、画像表示の中心になるように揺動運動を歌います。唯一の右心室を画像表示に表示されるように画像の幅を減らします。
2. 同じ画像面では、右心房と右心室の間に、各心周期にわたって開閉と薄く、モバイルフィラメントを表示さ三尖弁リーフレットを、可視化します。
3. 三尖弁の領域でカラードプラを適用します。三尖弁逆流のために注意してください。
   注記：通常のフローが拡張期中に発生し、変換器に向けられ、したがって赤色符号化されます。異常な逆流フローは収縮期の間に起こる、離れトランスデューサから導かれ、従って青色符号化されます。逆流ジェットのピーク速度は、右心室収縮期圧を推定するために使用されます。
4. 大動脈弁のレベルで傍胸骨短軸の位置にトランスデューサを移動します。大動脈弁の上に右心室OUTFです低管、肺動脈弁、近位主肺動脈、左右の肺動脈（ 図6）。
5. 修正された胸骨傍長軸位置にトランスデューサを時計回りに回転させます。その後、肺動脈弁の短軸像を得るために、やや上向き変換器を傾けます。
6. このビューでは、肺動脈弁尖（ 図7）の分離距離を評価するために、Mモード画像を適用します。
7. 弁閉鎖不全（拡張期にモザイクパターン化、高速のジェット）及び狭窄症（収縮期のモザイク柄、高速のジェット）のために評価するために、肺動脈弁の領域においてカラードップラーを適用します。
8. パルス波制御キーを押して、ちょうど肺動脈弁の後にサンプルボリュームを配置します。
   注記：流れのスペクトルドップラ表示の分析は、肺動脈圧（ 図8）を推定するために使用されます。

心機能の7評価

注：心機能の評価は、左心室の収縮性の定性的な評価を（ 例えば、駆出率、局所壁運動異常、および壁の知覚される厚さの目測）と左心室の定量的尺度機能（ 例えば、駆出率、左心室重量、左心室の拡張機能、および心筋性能の指標）。

1. 乳頭筋のレベルで傍胸骨短軸位置トランスデューサと、2D / BモードでLVの短軸ビューを取得します。トランスデューサを上下に移動し、頂点にベースからLVをスキャンします。壁運動異常を観察します。
2. 左心室の胸骨傍短軸から見ると、コントロールパネルにあるMモードボタンを押してください。トラックボールを使用して、乳頭筋とobtaiのレベルで左心室腔の中心にMモードカーソルを合わせnはMモード画像。
3. 拡張末期における左心室腔の寸法を測定し、ここで前壁と後壁との間の距離が最も大きい、との両方の前部と後部の壁の内側への動きが最大であるにおける収縮末期、（ 図9）です。
4. 拡張末期と収縮末期に前部と後部壁の厚さを測定します。
   注：乳頭筋が正しい撮像面を確保するために不可欠なランドマークであるが、いずれの測定に含めないように注意してください。
5. 頂端ウィンドウにトランスデューサを移動します。ステップ5.1を参照してください。頂端長軸ビューで僧帽弁全体の血流のパルス波ドップラーを使用して、左心室拡張期機能を評価します。
6. 僧帽弁尖の先端にサンプルボリュームを配置します。僧帽弁全体のパルス波ドップラー速度のスペクトル表示からのピーク僧帽弁流入速度を測定します。
7. LV INFL間のサンプル容量を置きOWと流出。僧帽弁と大動脈弁の開閉信号に注意してください。等容性弛緩時間、等容性収縮時間、および左心室駆出時間（ 図10）を測定します 。
8. 頂端長軸ビューで僧帽弁輪の組織ドプライメージング（TDI）を実行します。 TDIコントロールキーを押して、僧帽弁輪の内側面にサンプルボリュームを配置します。サンプル容量が僧帽弁尖を侵害していないことを確認してください。 0.21ミリメートルと0.27ミリメートルの間のドップラーサンプルボリュームのサイズを保ちます。僧帽弁輪（ 図11）の早期拡張期速度（E '）を測定します。

8.最終手順

1. 取得した画像を確認します。すべての必要な画像が得られたことを確認。
2. マウスの胸から余分な超音波ゲルを外し、静かに所定の位置に動物を固定テープを外します。麻酔をオフにします。
3. 吸収紙タオルで動物を置きます（吸引することができますまたは復元中に気道をブロックすることができない寝具、）。胸骨の横臥位になるまで動物を観察します。麻酔が適切に投与された場合、回復は30〜60秒以内に発生する必要があります。

結果

日常的に動物の心臓の超音波画像から得られる画像の例は、この原稿に含まれています。動物の胸にトランスデューサ配置の図が読者に変換器が記載されているように画像を取得するように配置されるの明確な理解を与えるために設けられています。超音波実験室セットアップの写真はまた、適切な装置、特に、使用される超音波トランスデューサと麻酔の方法の重?...

ディスカッション

麻酔導入

適切な麻酔の導入および保守は、マウスの心臓弁の変化の正確な評価や心機能のために重要です。イソフルランによって誘発される麻酔の迅速な誘導と深い麻酔後にこの麻酔薬の比較的長いウォッシュアウト時間を考えると、我々は誘導のために、スタンドアロンの麻酔室を使用しないでください。上記で詳細に述べたように代わりに、動物を麻酔?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
High resolution ultrasound machine	VisualSonics, Fujifilm	Vevo 2100
Isoflurane diffuser (capable of delivering 1 % to 1.5 % isoflurane mixed with 1 L/min 100% O2	VisualSonics, Fujifilm	N/A
Transducers for small mice (550D) or larger mice (400)	MicroScan, VisualSonics, Fujifilm	MS 550D, MS 400
Animal platform	VisualSonics, Fujifilm	11503
Advanced physiological monitoring unit	VisualSonics, Fujifilm	N/A
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-019-10
Nose cone and tubing connected to isoflurane diffuser and 100% O2	Custom Engineered in-house	--
Hair razor	Andis Super AGR+ vet pack clipper	AD65340
Ultrasound gel	Parker Laboratories	REF 01-08
Electrode gel	Parker Laboratories	REF 15-25
Adhesive tapes	Fisher Laboratories	1590120B
Paper towels