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Method Article
In this manuscript, periodate oxidation and glutaraldehyde cross-linking methods for covalent immobilization of antibodies on paper discs are presented. The binding activity of immobilized antibodies was evaluated. Based on these results, a glutaraldehyde cross-linking method was used to develop a novel paper-based immunoassay for immunoglobulin G (IgG) detection.
该报告提出了捕获抗体对纤维素滤纸级第1号(中流动滤纸)光盘和品位第113号(快流过滤纸)盘共价固定两种方法。这些纤维素纸圆片通过硅烷偶联技术与胺官能团接枝分别固定在它们之前的抗体。高碘酸盐氧化和戊二醛交联方法被用来接枝的纤维素纸光盘捕获抗体。为了确保捕获抗体与固定后其目标的最大结合容量,不同浓度的高碘酸钠,戊二醛,和纸张的盘的表面上的捕获抗体的效果进行了研究。相比于高碘酸氧化法时通过戊二醛交联剂涂布在胺官能化的纤维素纸的光盘,该抗体显示增强对目标结合活性。 IgG抗体(小鼠参考血清)用作参考目标在这项研究中,通过戊二醛测试共价固定化抗体的应用。一种新的纸质,酶联免疫吸附测定(ELISA)已成功开发和验证用于检测IgG抗体。此方法不需要设备,它可以检测100纳克/毫升的IgG。快速流滤纸比介质流滤纸更敏感。这个实验的潜伏期很短,所需的小样本量。这种裸眼,比色免疫测定可以扩展,以检测与常规的ELISA确定的其他目标。
在床边血糖检测(POCT)诊断性研究是对新战略的发展疗法,个性化医疗和家庭护理1重要。纤维素论文被广泛应用于免疫作为平台,因为它们价格便宜,方便,并为用户所熟悉2。此外,纤维素纸的多孔结构具有以驱动液体流动没有额外的能量冲击力。纸基生物分析的记录可早在20 世纪 ,当纸层析最初发明于1952年,最普遍的例子是免疫测试3,如妊娠糖尿病试纸发现。这些测试提供了相对快速的检测时间和廉价的分析4。由于其简单性,这些常规纸带试验已广泛应用于POCT诊断5。
检测方法包括色度6,电化学7,和电化学发光8的方法已被报道用于测量生物样品中的目标。除了这些定量方法,用于固定在纤维素纸的抗体的可靠方法也是诊断设备的开发非常重要。具体的非吸附是用于修改纸基装置9,10的表面上的抗体,以确保固定后最大结合容量到其目标的主要策略。然而,先前的研究中 表明,被吸附到纤维素纸抗体可以通过40%从纤维11解吸。因此,直接吸附抗体的纤维素上可能不会提供可重复的结果12。被纸张表面上的接枝的抗体的共价固定是开发有效的纸基生物分析13的另一种方法。各种方法已被报道用于纤维素14,15的变形。理想情况下,抗体应该保持固定12日后其原有功能。羰基与1-氰基-4- dimethylaminopyridinium四氟硼酸16相结合;通过紫外线基于激活策略17,18 1-氟-2-硝基-4- azidobenzene;基于木聚糖改性19酶法战略; 1,4- phenylenediisothiocyanate连接剂20;杂氧化21点击化学22;和阳离子卟啉23已被用于共价固定在纤维素纸的生物分子。脱乙酰壳多糖改性的纸张已被用于开发基于纸张immunodevices 24-26,因为它是丰富的,生物相容的27。壳聚糖是阳离子,并强烈坚持的阴离子纤维素27。捕捉抗体被固定在通过壳聚糖涂层和戊二醛交联的纸。碘酸氧化是嫁接上尉的另一种方法在纤维素纸28 URE抗体。在该方法中,高碘酸钠点样在纸上直接转换1,2-二羟基(乙二醇)基团在纤维素到醛基。然后醛基被用于形成多糖和抗体28之间形成共价键。虽然制造很简单,它是很难完全洗出高碘酸钠。未洗涤的高碘酸钠可引起该被固定在纤维素纸的抗体的进一步氧化,影响抗体的活性和稳定性N - (3-二甲氨基丙基) - N -ethylcarbodiimide盐酸盐和N-羟基交联剂也可用于共价固定化于基于纳米纤维的测定29的显影静电纺丝聚L-乳酸和醋酸纤维素纳米纤维的抗体。
在这项研究中,硅烷耦合技术用于嫁接cellulos胺官能团Ë纸片。这种技术有助于保留原孔隙尺寸,芯吸和纤维素滤纸的过滤速度,从而最大垂直流过在免疫测定。硅烷偶技术已广泛应用于生物传感器官能与仲胺基基材表面,接着进一步修饰使用的生物分子。胺基的基质表面上接枝包括有机官能硅烷试剂的-OH基团和矩阵基板30之间的缩合反应。纤维素纸圆片至3-丙基三甲氧基硅烷(APS)31与由硅烷偶胺基官能化。其次,通过使用两种不同的方法共价固定化的捕获抗体。第一种方法涉及到胺功能纤维素纸碟碘酸氧化捕获抗体结合。第二种方法使用戊二醛作为交联剂附着捕获antibodi下载到胺基团官能化的纤维素纸的光盘。捕获抗体的存在用兔抗人IgG-异硫氰酸荧光素(FITC)证实,使用荧光分子成像仪。到山羊抗兔IgG兔抗人IgG-FITC的结合活性也通过过氧化物酶底物进行评价。各种浓度的高碘酸钠,戊二醛,和捕捉抗体的效果进行了研究。通过检测的IgG血清的混合物成功地进行了固定的捕获抗体的应用试验。
1.纤维素纸片嫁接胺功能团
抗体对胺官能化纤维素纸影碟2.共价固定化
由两种不同的方法图1.抗体的共价固定。一,固定在通过高碘酸氧化胺官能化的纤维素纸碟抗体。所述碳水化合物残基被高碘酸钠氧化,产生醛官能团。然后,被氧化的抗体加载到胺官能纤维素纸盘; B。然后将抗体固定于通过戊二醛胺官能纤维素纸光盘。该胺官能化纤维素纸圆片浸入0.05%戊二醛溶液引入醛基,以在纸的光盘。清洗后,抗体抬上醛功能化的纸片。 请点击此处查看该图的放大版本。
3.纸张为基础的ELISA IgG的检测
图2.纸张基于ELISA FO的示意图řIgG的检测。捕获抗体共价固定在通过戊二醛的醛官能纤维素纸光盘。纤维素纸圆片用封闭缓冲液。然后目标的IgG加入到该光盘,随后HRP-缀合的信号的抗体的加载。最后,TMB和过氧化氢混合溶液装入每个纸片的颜色显示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 傅立叶变换未处理和APS处理的介质流过滤器正方形纸(A)和快速流过滤器正方形纸(B)A的红外(FTIR)光谱 。对于未处理的介质流过滤器正方形纸谱是相似的APS处理介质流过滤器正方形纸。在902-1,170 -1和1,210-1,500厘米-1为APS处理方纸乐队中强度的增加分别属于SiO...
进行亲和纯化的山羊抗小鼠IgG-Fc的捕获上未修饰的纤维素纸光盘抗体的直接涂覆,以检测的IgG的浓度。结果表明,在捕捉抗体的进一步固定需要重复性。硅烷技术被成功地用于引入胺官能团的纤维素纸的光盘34。 APS的浓度会影响抗体的固定。因此,APS的丙酮的量也进行了优化。在10ml丙酮1毫升的APS是用于通过戊二醛交联剂接枝抗体的固定化的胺基团的最佳浓度。抗体嫁接用高碘酸氧化和戊...
The authors have nothing to disclose.
This work was financially supported by the Ministry of Education, Singapore through the Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cellulose filter paper, Grade 1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
Cellulose filter paper, Grade 113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
Tris base | Promega | H5135 | |
Sodium periodate | Merck | 106597 | |
Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
KH2PO4 | Merck | 104873 | |
NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
NaOH | Merck | 106462 | |
HCl | Merck | 100317 | |
phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/ml |
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
Equipment | |||
Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
Oven | NUVE FN500 | N/A | |
Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
ImageJ | RGB, free download | N/A |
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