跨越大鼠血脑屏障FITC加载铁蛋白体外渗透:一个模型来研究Nanoformulated分子的交付

摘要

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

摘要

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

引言

中枢神经系统（CNS）的疾病（ 即肿瘤，癫痫症，抑郁症，精神分裂症和HIV相关的神经障碍）耐药物疗法是由于各种不同的机制，包括跨越血脑屏障艰巨药物渗透（BBB） 。血脑屏障是隔离在血液中循环的物质的脑组织的边界。在这个障碍，脑微血管内皮细胞（BMECs），通过周细胞和星形胶质细胞endfeet支持层，是负责对血脑屏障的高选择性的那些水溶性药物的分子量高于400达^1。另一个与药物有关的耐药机制被链接到上BMECs存在药物外排转运（P-糖蛋白和多药耐药蛋白），其共同操作以减少药物渗透到中枢神经系统和从大脑²促进其挤出。

在过去十年中，大量的纳米技术的方法已被开发，以满足穿过BBB ^3-6递送药物的临床和生物学的挑战。在此背景下，铁蛋白纳米球（FNN）代表一种完全创新的和可行的解决方案。 FNN是24自组装铁蛋白（FN）单体，其被布置在8nm的内径的中空球状结构12纳米球体。铁蛋白亚基可以在酸性pH下被拆卸并通过使pH值至中性，允许被包封各种有机分子中的形状记忆的方式重新组合。因此，FNN代表多功能药物递送系统^7,8的发展的一个有趣的模型。此外，FNN可以与BMECs由于转铁蛋白受体（铁蛋白）1，这是对这些细胞⁹的管腔膜表达的特异性识别相互作用。

到目前为止， 在血脑屏障的体外模型不同已在奥德开发R以阐明反式BBB通透性对各种药物，毒性朝向血脑屏障，或流出转运分子的相互作用。的确，这些模型被认为是体外有效与体内研究在继续之前接近为活性分子的快速筛选。这些模型由BMECs或共培养BMECs和星形胶质细胞（更罕见周细胞）的单个内皮细胞层，从动物（大鼠，小鼠，猪和牛），或人细胞系^10,11,12得到的。的跨内皮电阻（TEER），并具有限定分子量示踪剂的表观渗透率（P _应用 ）表示用于确定在体外模型的质量的两个关键参数。在这里，我们描述了就业BBB 体外模型的基础上，大鼠BMECs（RBMECs）的共同的文化和大鼠皮层星形胶质细胞（合会）研究纳米笼铁的跨BBB渗透封装荧光isothiocyanate（FITC）。

研究方案

1.建立血脑屏障模型

注意:对于建立血脑屏障模型，我们建议您使用市售的主RBMECs和RCA接头。所有步骤都必须用无菌的试剂和耗材，在层流罩处理来执行。

1. 细胞培养
   1. 用聚L-赖氨酸100微克/毫升（在RT 1小时）或纤连蛋白50微克/毫升（在37℃下1小时）的外套细胞培养烧瓶，以促进合会或RBMECs的附件，分别。然后，解冻1×10 ^6个 RCA接头和5×10 ⁵ RBMECs在内皮细胞培养基，补充有5％胎牛血清，1％的内皮细胞生长补充和1％青霉素/链霉素（SECM）。种子合会在在10毫升SECM在20ml SECM和RBMECs在T75烧瓶中T175烧瓶中。
      注意:解冻和RCA接头和RBMECs的播种通道必须进行调整，在培养细胞密度和时间方面，根据与血脑屏障模型被测试的实验条件的数目。通过启动用1瓶1×10 ^6个 RCA接头和5×10 ⁵ RBMECs 1小瓶ING，有可能获得高达20承载血脑屏障插入。
   2. 保持在37℃和5％的CO ₂在大约6天潮湿气氛的细胞，直到大约80％汇合为RCA接头和用于RBMECs超过90％汇合。分离使用胰蛋白酶-EDTA溶液（胰蛋白酶1:250）的细胞5分钟（1 ml胰蛋白酶为T75烧瓶和2ml为T175烧瓶）。停止与SECM胰蛋白酶活性（2:1），在750×g下5分钟离心细胞悬浮液和悬浮颗粒在60ml SECM。
   3. 播种到插入之前拆分成RBMECs 3 T175瓶和文化SECM另外3天。计数活RCA接头，通过观察稀释1细胞悬浮液的总数量:在Burker室中在光学显微镜下1用锥虫蓝。
2. 细胞种植到刀片
   1. 6多井transpar的对待聚对苯二甲酸的一侧（PET）膜用聚L-赖氨酸100微克/毫升，而另一侧与纤连蛋白50微克/毫升，耳鼻喉科插入以允许RCA接头和BMECs的附着。处理与镊子插入件，以避免与PET膜接触。
      1. 放置插入到一个6孔板中并添加纤连蛋白溶液（最小500微升）到上部室中。在37℃孵育1小时后，取出纤维连接蛋白的解决方案，脱下多孔板嵌件，并把它们倒挂在150 ^平方厘米的培养皿底部，这是这里用作无菌支持已经涂层刀片。
      2. 轻轻添加800微升多聚-L-赖氨酸的上刀片的底侧（如在图1A中示出;称为RCA接头播种），并保持在插入的溶液在室温1小时。
      3. 吸出溶液，并让插入在RT干燥15-30分钟。插入件现在已准备好细胞接种，但也可以存储在多孔板数天在4℃，用血脑屏障结构，然后再继续。
         注:记住要保持至少3涂层刀片不含细胞，用作控制由FD40通量测量，以验证BBB建立。
   2. 种子合会（35,000 /厘米^2）到聚-L-赖氨酸包被的插入物的底侧，滴加800微升细胞悬液到倒置插入物（ 图1A）。留在插入RCA的悬浮液在室温4小时，以便使细胞的膜的有效附着。
   3. 吸出残留溶液，插入件放入含2ml SECM的井和在湿润的气氛中保持在37℃和5％的CO ₂的多井板，改变SECM每2天。
   4. 在3天之后，当合会已涂覆的刀片的下表面，种子RBMECs到插入件的上侧，以下步骤:
      1. 从T175瓶分离RBMECs和计数总活细胞，据报道在步骤1.1.2和1.1.3。
      2. 种子RBMECs（60,000 /厘米^2）到所述插入件的中SECM（1,000微升）（ 图1B）的上表面上，留下3插入仅与星形胶质细胞，也可以用作TEER背景。放置在标准培养条件下的多孔板。维护系统来培养至少3天，改变SECM在内侧和下部腔室，每2天。

2. BBB验证

1. TEER测量
   1. 上共培养的^第 3天，通过将承载血脑屏障插入到一个适当的腔室检查TEER（具有盖和其中两个腔室和盖包含一对电压感测和电流电极的），填充有4 SECM毫升的。连接到上皮组织伏特/欧姆表。
   2. 连同细胞血脑屏障的系统的TEER测量，记录3插入轴承合会第的TEER值在将从与商务改善局获得的值中减去。通过插入（4.2厘米^2）的表面上，以表达结果作为ΩX招商局²相乘所得的TEER值。
   3. 从联合培养的^第 3天，每天测量TEER。注意:一个初始阶段，其中TEER增加后，所记录的值应为连续至少两天保持稳定（通常为5 ^个和共培养的^第 7天之间）。在该点所述BBB准备验证（第2.2节）和/或用于反式血脑屏障实验的第二步骤。
      注意:在2.1节中描述的过程可以在专门用于以下渗透性实验（第3节）相同的BBB系统来执行。在无菌条件下进行操作。
2. 反式BBB助焊剂FITC右旋糖酐40（FD40）
   1. 测量从上部的FD40通量相比，在3个空的嵌入式BBB模型的下腔根据下列步骤（见本说明部分1.2.1）:
      1. 加入1毫克/毫升FD40（在SECM稀释）插入商务改善局的上隔室和后1,2和3小时从下室撤回200微升SECM和由分光光度计测量的荧光强度_（λEX 488纳米，λ _青霉 515纳米，狭缝5）。
      2. 获得SECM背景值fluorescenceby使用相同的分析参数测量500微升处女介质。减去所有FD40荧光值的SECM背景荧光。
      3. 通过与溶于500微升SECM的荧光示踪剂的已知浓度（ 即 0.312，0.625，1.25,2.5微克/毫升）所产生的校准曲线所观察到的荧光值的比较确定渗透FD40的量。
      4. 计算从根据平均通量值的表观渗透系数（P _应用 ）:
         P = _应用焦耳/ AC
         其中J是分子（摩尔/秒）的通量，A是渗透面积（cm ^2）和C是在上隔室（摩尔/厘米^3）的分子的浓度。
         注:三个或更多个已达到适当的TEER值血脑屏障的系统中，必须将专门讨论此验证过程，并且不应当被用于以下渗透性实验（第3节）。育不是强制性的。

3.跨BBB FITC加载铁蛋白渗透（FNN）

注:人类铁蛋白的重组变异体（FN），在大肠杆菌中产生并聚集在纳米笼（FNN）针对不同的荧光分子的封装，可提供从Prosperi教授的NanoBioLab（大学米兰比可卡，意大利）。 FNN装载用FITC，根据先前描述的方案¹³和Fn和加载的分子的浓度准确determin编辑。

1. FITC的跨BBB通量和FITC-FNN
   1. 测量从上所述的FITC FNN助熔剂验证BBB模型（通常是在第5 ^次 -共培养的^第 7天）的下室中，相对于该后孵化的7和24小时的自由染料，根据以下步骤:
      1. 添加FITC标记FNN（50微克/毫升FNN，1.1μM，FITC）或等量的游离的FITC成每个制剂至少6血脑屏障系统的上腔室，以便从下部腔室退出的2ml SECM溶液至少3插入后7小时，并从其他3插入物24小时后的下腔室。
      2. 通过分光光度计测量的500微升收集的样品的荧光强度_（λEX 488纳米_，λEM 515纳米，狭缝5）。
      3. 通过使用相同的分析参数测定500μl的培养基中获得的SECM背景荧光。减去SECM背景荧光所有FITC或FITC-FNN荧光值。
      4. 通过将得到的荧光值与溶解在500微升SECM游离或nanoformulated染料已知浓度（ 即 6.87，13.75，27.5，55纳米）产生两种不同的校准曲线比较确定渗透的FITC或FITC-FNN的浓度。
2. FITC-FNN本土化RBMECs
   1. 从血脑屏障系统的上腔室中移除SECM，用PBS洗，插入和通过在上隔室中加入500μl的多聚甲醛（于磷酸盐缓冲液盐水PBS中的4％）10固定在至少两个插入每个实验组的RBMECs分钟在室温。
   2. 用PBS洗插入三次以除去残余的多聚甲醛。
      注意:从此时起，不育是没有必要的。
   3. 切割在PET膜的合适的片，并且具有根据以下步骤的单元的immunodecoration继续:
      1. Permeabi丽泽RBMECs用0.1％的Triton X-100的PBS 10分钟。在RT进行1小时封闭步骤用含2％牛血清白蛋白（BSA），2％山羊血清的PBS溶液中。在1:20稀释孵育与抗血管性血友病因子（vWF）的样品中，在室温下2小时。
      2. 在用PBS洗涤三次后，在室温下暴露在细胞2小时至2％的BSA，含有适当的二级抗体以1 2％山羊血清溶液:300稀释以揭示抗VWR，和DAPI在一个1:1500稀释的核检测。
   4. 安装插片上使用防褪色安装解决方案（每插入片段一滴）显微镜玻片，然后用盖玻片关闭样品。使用油浸镜头放大40倍，1.5变焦和1024x1024个像素分辨率的激光共聚焦显微镜分析。

结果

在建立血脑屏障模型，细胞附着和生长的插入物可以使用光学显微镜由于在PET膜的透明性进行监测。合会，在35,000个细胞/ cm ²时，有效地连接到所述插入件的底侧之后在RT（ 图2A）孵育4小时的密度接种并生长到覆盖膜表面在3天，采取纺锤形的形态（ 图2B）。 RBMECs，在60,000个细胞/ cm ²的密度接种，在37℃下（ 图2C）明?...

讨论

此处描述的体外方法是一项有用的验证方法来研究在nanoformulation与纳米颗粒的荧光分子中的反式血脑屏障输送。在这里，我们使用FNN，它代表一个很好的候选来研究穿过BBB货物分子的易位。 FNN被认为是金nanovector为反式血脑屏障递送药物/剂的，因为它是专门通过TFR1受体，这是在BMECs的管腔膜表达并介导使用受体介导的内化途径中的纳米颗粒的摄取识别。此外，模糊神经网络是一种天?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000