Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

要約

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

要約

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

概要

薬理学的治療に対する中枢神経系（CNS）の疾患（ すなわち 、癌、てんかん、うつ病、統合失調症およびHIV関連神経障害）の抵抗は、血液脳関門（BBB）を横切る困難な薬物透過を含む様々な異なるメカニズムによるものです。 BBBは、血液中を循環する物質から脳組織を分離する境界です。この障壁の中で、周皮細胞およびアストロサイトエンドフィートでサポートされている脳微小血管内皮細胞（BMECs）の層が、ダ¹ 400よりも高い分子量を有するものを水溶性の薬剤に対するBBBの高い選択性に責任があります。他の薬物関連耐性機構は、CNSへの薬物の浸透を減少させ、脳²から自分の押し出しを容易にするために、協働薬物排出トランスポーター（P-糖タンパク質及び多剤耐性タンパク質）のBMECsの存在にリンクされています。

過去十年間で、ナノテクノロジーの手法の多くは、BBB ^3-6にわたって薬物を送達するの臨床的および生物学的な課題に応えるために開発されてきました。この文脈では、フェリチンナノスフィア（FNN）は、完全に革新的かつ有望なソリューションを表しています。 FNNは8nmで内径の中空球状構造で配置されている24の自己集合フェリチン（FN）モノマーの12 nmの球体です。フェリチンサブユニットは、酸性pHで分解し、種々の有機分子をカプセル化することができるように、中性のpHをもたらすことにより、形状記憶様式で再構築することができます。したがって、FNNは、多機能性薬物送達システム^7,8の開発のための興味深いモデルを表します。また、FNNは、これらの細胞⁹の管腔側膜上に発現されるトランスフェリン受容体（TfRと）1、の特異的認識にBMECsのおかげと相互作用することができます。

これまで、BBBのin vitroモデルで異なるがオード開発されていますrは、様々な薬物、BBBに向かって毒性、または排出トランスポーターとの分子の相互作用にトランスBBBの透過性を解明します。確かに、これらのモデルは、 インビトロで有効であると考えているin vivo試験に進む前に、活性分子の迅速なスクリーニングのために近づきます。これらのモデルは、動物（ラット、マウス、ブタおよびウシ）またはヒト細胞株^10,11,12から得られたBMECsまたは共培養BMECsとアストロサイト（まれ周皮細胞）の単一内皮層、から構成されています。経内皮電気抵抗（TEER）と定義された分子量を有するトレーサーの見かけの透過性（P _{アプリ ）は、in} vitroモデルの品質を決定するために使用される2つの重要なパラメータを表します。ここでは、フルオレセインisothiを内包フェリチンナノケージのトランスBBB透過を研究するためにラットBMECs（RBMECs）およびラット皮質アストロサイト（RCAS）の共培養に基づいて、BBB のin vitroモデルの雇用を記述するocyanate（FITC）。

プロトコル

1. BBBモデルの確立

注意：BBBモデルを確立するために我々は、市販の一次RBMECsとRCASを使用して示唆しています。すべてのステップは、無菌試薬および消耗品を用いて行わ層流フード内で処理する必要があります。

1. 細胞培養
   1. ポリ-L-リジンは100μg/ mlで（RTで1時間）、またはフィブロネクチンを50μg/ mlの（37℃で1時間）で被覆細胞培養フラスコは、それぞれ、RCASまたはRBMECsの付着を促進します。そして、5％ウシ胎児血清、1％の内皮細胞増殖サプリメントおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン（SECM）を補充した1×10 ⁶ RCASと内皮細胞培地中で5×10 ⁵ RBMECs、解凍。 10ミリリットルSECMでT75フラスコ中で20ミリリットルSECMとRBMECsでT175フラスコ中の種子RCAS。
      注：解凍し、RCASとRBMECsの播種通路が培養中の細胞密度と時間的に調整されなければならない、BBBモデルを用いて試験する実験条件の数に応じました。スタートにより、1×10 ⁶ RCASと5×10 ⁵ RBMECsの1バイアルの1バイアルでる、20 BBB-ベアリングインサートまで得ることが可能です。
   2. RCASのための約80％コンフルエンスになるまで、37℃、5％、約6日間、加湿大気中のCO ₂で細胞を維持し、RBMECsのための90％コンフルエンス。 5分（T75フラスコのための1 mlのトリプシンおよびT175フラスコ用2ミリリットル）のために：トリプシン-EDTA溶液（250トリプシン1）を用いて細胞を切り離します。 SECMでトリプシン活性を停止させる（2：1）、5分間750×gで遠心分離細胞懸濁液を60 mlのSECMにペレットを再懸濁します。
   3. インサート上に播種する前に、別の3日間、SECMの3 T175フラスコや文化にRBMECsを分割します。 Burkerチャンバ内で光学顕微鏡下でトリパンブルーで1：1に希釈した細胞懸濁液を観察することによって、RCAS生体の総数を数えます。
2. インサート上に細胞播種
   1. 6マルチウェルtransparのポリエチレンテレフタレート（PET）膜の一方の側を治療します100μg/ mlのポリ-L-リジンおよびフィブロネクチンを50μg/ mlのと反対側、と耳鼻咽喉科インサートはRCASとBMECsの結合を可能にします。 PET膜との接触を避けるために、ピンセットで挿入を扱います。
      1. 6ウェルプレートへの挿入を置き、上部チャンバーにフィブロネクチン溶液（最小500μl）を追加します。 37℃でのインキュベーションの1時間後、フィブロネクチン溶液を除去マルチウェルプレートからのインサートを取るとするための無菌のサポートとして、ここで使用される150cm ²のペトリ皿の底に逆さまに置きますすでに被覆インサート。
      2. 優しく（ 図1（a）に示すように 、RCASシーディングと呼ばれる）、インサートの底面側にポリ-L-リジンの800μlを添加し、室温で1時間インサート上で解決策を続けます。
      3. ソリューションを吸引し、インサートは15​​-30分間、室温で乾燥してみましょう。インサートは、現在、細胞播種のために準備ができているだけでなく、いくつかのためのマルチウェルプレートに保存することができますBBBの建設を進める前に4℃で日、。
         注：FD40フラックス測定によりBBBの確立を検証するためのコントロールとして使用されるように、細胞から自由に少なくとも3被覆インサートを維持することを忘れないでください。
   2. シードRCAS挿入（ 図1A）逆さまに細胞懸濁液800μLを滴下することにより、ポリ-L-リジンでコーティングされたインサートの底部側に（35,000 / cm ²で）。膜への細胞の効率的な結合を可能にするために、室温で4時間、インサート上のRCAのサスペンションを残します。
   3. 吸引残留溶液を、2日毎SECMを変え、加湿雰囲気中SECMの2 mlを含有するウェルに挿入物を配置し、37℃でのマルチウェルプレートを維持し、5％CO _2。
   4. RCASは、以下の手順に従って、インサートの上側にインサートの下面、シードRBMECsをコーティングしてきた3日、後：
      1. T175フラスコからRBMECsを外し、カウント総生細胞、ステップ1.1.2および1.1.3で報告されているよう。
      2. アストロサイトのみで3インサートを残しSECM（千μL）（ 図1B）内のインサートの上面にシードRBMECs（60,000 / ^{cm 2）}を、TEERの背景として使用されます。標準的な培養条件でマルチウェルプレートを置きます。 2日ごとに、内側と下部チャンバーにSECMを変え、少なくとも3日間培養し、システムを維持します。

2. BBB検証

1. TEERの測定
   1. 共培養の³日^目には、適切なチャンバー内にBBB-ベアリングインサートを挿入することにより、TEERを確認します（つまり、キャップを有しており、チャンバとキャップの両方は、電圧検知および現在の一対の電極含む場合）4が充填されたが、 SECMのミリリットル。上皮組織のボルト/オーム計に接続します。
   2. 一緒に細胞BBB-システムのTEER測定と、RCAS番目の軸受3のインサートのTEER値を記録でBBBsで得られた値から差し引かれます。 ΩX cm ²でその結果を表現するために、インサート（4.2 cm ^2）での表面で得られたTEER値を乗算します。
   3. 共培養の³日^目からは、毎日TEERを測定します。注：TEERが増える初期期間の後、記録された値は、少なくとも2日間連続して安定したままであるべきである（通常、5 ^番目との共培養の7日^目の間）。その時点でBBBは、検証（セクション2.2）および/またはトランスBBB実験のための第二段階の準備ができています。
      注：2.1節で説明する手順は、以下の透過性実験（セクション3）に専念同じBBB-システム上で実行することができます。無菌条件下で操作してください。
2. FITCデキストラン40のトランスBBBフラックス（FD40）
   1. 3空のインサート全体のそれと比較BBBモデルの下部チャンバーに上部からFD40フラックスを測定します以下の手順に従って、（セクション1.2.1の注を参照してください）​​：
      1. _EMは BBBsの上部コンパートメントに1mg / mlのFD40（SECM中に希釈）を追加し、1の後、2、3時間下室から200μLのSECMを撤回し、分光蛍光光度計により蛍光強度を測定する（λの_元 488nmで、λ 515 nmの）5スリット。
      2. 同じ分析パラメータを使用して処女培地500μlを測定fluorescenceby SECMの背景の値を取得します。すべてのFD40の蛍光値からSECMのバックグラウンド蛍光を引きます。
      3. 既知濃度（ すなわち 。0.312、0.625、1.25、2.5μgの/ ml）のSECMを500μlに溶解した蛍光トレーサーので作成した検量線で観察された蛍光値の比較が浸透FD40の量を決定します。
      4. に従って平均フラックス値から見かけの透過係数（P _{アプリ）を}計算します。
         P _アプリ = J / AC 、Aは透過面積（cm ^2）であり、Cは、上部区画（モル/ cm ^3）を、分子の濃度です。
         注：適切なTEER値に達している3つ以上のBBB-システムは、もっぱらこの検証手順に専念しなければならない、と次の浸透性実験（セクション3）のために使用すべきではありません。無菌性は必須ではありません。

3.トランスBBB FITC-ロードフェリチンの浸透（FNN）

注：ヒトフェリチン（FN）の組換え変異体、 大腸菌で産生され、ナノケージで組み立て（FNN）異なる蛍光分子のカプセル化のためには、教授プロスペリ（ミラノビコッカ大学、イタリア）のNanoBioLabから入手可能です。 FNNは、FITCをロードし、以前に記載されたプロトコル¹³との両方のFnとロードされた分子の濃度に応じて正確にdeterminされていますエド。

1. FITCのトランスBBBフラックスとFITC-FNN
   1. によると、インキュベーションの7および24時間後の遊離色素のそれと比較して、 - （共培養の7 ^日目 、通常、5 ^回目で）検証BBBモデルの下部チャンバーに上部からFITC-FNNのフラックスを測定します次の手順：
      1. FITC-FNN（50μg/ mlのFNN、1.1μMFITC）または各製剤について少なくとも6 BBBシステムの上室に無料のFITCの等しい量は、の下室からSECM溶液2mlを撤回するために追加します7時間後、および24時間後に、他の3のインサートの下室から少なくとも3を挿入。
      2. 蛍光分光計によって収集されたサンプルを500μlの蛍光強度を測定する（λ _元の_488nm、λEM 515nmで、スリット5）。
      3. 同じ分析パラメータを用いて、培地500μlを測定することにより、SECMのバックグラウンド蛍光を取得します。 SECMのバックグラウンド蛍光を引きすべてのFITCまたはFITC-FNN蛍光値から。
      4. 500μlのSECMに溶解し、無料またはnanoformulated染料の既知濃度（ すなわち 。6.87、13.75、27.5、55 nM）を用いて生成される2つの異なる検量線を用いて得られた蛍光値を比較することにより、透過FITCまたはFITC-FNNの濃度を決定します。
2. RBMECsにおけるFITC-FNNローカリゼーション
   1. 、BBBシステムの上部チャンバーからSECMを削除するPBSでインサートを洗浄し、10のための上部コンパートメントに500μlのパラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水、PBS中4％）を加えることによって、各実験群について少なくとも2つのインサートにRBMECsを修正RTで分。
   2. 残留パラホルムアルデヒドを除去するためにPBSでインサートを3回洗浄します。
      注：この時点から、無菌性は必要ありません。
   3. PET膜の適切な部分をカットして、次の手順に従って細胞のimmunodecorationを進めます。
      1. Permeabi10分間、PBS中0.1％トリトンX-100と平安大町RBMECs。 2％ウシ血清アルブミン（BSA）、PBS中の2％ヤギ血清を含む溶液で、室温で1時間ブロッキング工程を行います。 RTで2時間、1：20希釈で抗フォン・ヴィレブランド因子（VWF）でサンプルをインキュベートします。
      2. PBSで3回洗浄した後、2％BSA、1で適切な二次抗体を含む2％ヤギ血清溶液に、室温で2時間細胞をさらす抗VWRを明らかにするために300希釈、およびDAPI Aで1：核検出のための1500希釈。
   4. 退色防止マウントソリューション（挿入断片につき1滴）を使用して、顕微鏡スライド上に挿入片をマウントし、その後、カバースリップでサンプルを閉じます。 40X倍率、1.5ズーム、1,024×1024ピクセルの解像度で油浸レンズを用いた共焦点顕微鏡によって分析します。

結果

インサートのBBBモデル、細胞の付着および増殖の確立中にPET膜の透明性のために光学顕微鏡のおかげを使用してモニターすることができます。 35,000細胞/ cm ²の密度で播種RCASは、RT（ 図2A）でのインキュベーションの4時間後に、インサートの底側に効率的に付着し、3日後に膜表面を覆うように成長し、紡錘状の形態をとります（ 図2B）。

ディスカッション

ここに記載のin vitroの方法は、ナノ粒子とナノ製剤の際に蛍光分子のトランスBBBの配信を研究するための有用な検証アプローチを表します。ここでは、BBBを通過カーゴ分子の転座を研究するための良好な候補を表しFNNを、使用しています。それは、特にBMECsの管腔膜上に発現し、受容体媒介インターナリゼーション経路を使用してナノ粒子の取り込みを媒介するTfR1受容体によって認識?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000