Bir Sıçan Kan beyin bariyeri karşısında FITC yüklü ferritinin İn Vitro Geçirgenlik: Bir Model Nanoformulated Moleküllerin Teslim Eğitim için

Özet

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Özet

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Giriş

Farmakolojik tedavilere merkezi sinir sistemi direnci (merkezi sinir sistemi) hastalıkları (örn., Kanser, epilepsi, depresyon, şizofreni, HIV ile ilişkili nörolojik bir bozukluk) nedeniyle, kan-beyin bariyeri boyunca zorlu ilaç nüfuz dahil olmak üzere çeşitli farklı mekanizmalarla için (BBB) . BBB kanda dolaşan maddelerden beyin dokuları izole eder sınırıdır. Bu bariyer içinde, perisitler ve astrositler endfeet tarafından desteklenen beyin mikrovasküler endotelyal hücreler (BMECs) 'in bir tabakası, bir molekül ağırlığı daha yüksek 400 da ¹ olan suda çözülebilen ilaçlara BBB yüksek seçicilik sorumludur. Başka bir ilaç ile ilişkili dirençli mekanizması CNS'ye madde girişini engellemek ve beyin ² ekstrüzyonu kolaylaştırmak için işbirliği ilaç akış taşıyıcı (P-glikoprotein ve çoklu ilaç direnci proteini), bir BMECs ilgili varlığı ile bağlantılıdır.

Son on yılda, Nanoteknolojik yaklaşımlar çok sayıda BBB ^3-6 genelinde uyuşturucu teslim klinik ve biyolojik zorluğu aşmak için geliştirilmiştir. Bu bağlamda, ferritin nanosferler (FNN) tamamen yenilikçi ve gelecek vaat eden bir çözüm oluşturmaktadır. FNN 8 mil iç çapa sahip olan bir içi boş bir küre yapısında düzenlenmiş 24 kendinden montaj ferritin (FN) monomerler, 12 mil kürelerdir. Ferritin alt-birimleri, asidik pH değerinde demonte ve çeşitli organik moleküller kapsüllenecek sağlayan nötr pH getirerek şekil hafızalı bir şekilde kurulabilir. Bu nedenle, FNN çok fonksiyonlu bir ilaç verme sistemleri ^7,8 geliştirilmesi için ilginç bir modeli temsil eder. Ayrıca, FNN bu hücrelerin ⁹ lüminal zarı üzerinde ifade edilen transferin reseptörü (TfR), 1, spesifik tanıma BMECs teşekkür ile etkileşime girebilir.

Şimdiye kadar, BBB in vitro modellerde farklı accueillante geliştirilmiştirr çeşitli ilaçlar, BBB doğru toksisite, ya da akış nakliyeci ile moleküllerin etkileşimi trans-BBB geçirgenliği aydınlatmak için. Gerçekten de, bu modelleri, in vivo çalışmalar ile devam etmeden önce, aktif moleküllerin hızlı taranması için yaklaşımlar, in vitro olarak geçerli kabul edilir. Bu modeller, hayvan (fare, fare, domuz ve dana) veya insan hücre çizgileri ^10,11,12 elde BMECs ya da ko-kültür BMECs ve astrositler (nadiren perisitler) tek bir endotel tabaka oluşur. Transendotelyal elektrik direnç (TEER) ve belli bir molekül ağırlığına sahip izleyicilerin belirgin geçirgenlik _(Papp) in vitro modelin kalitesini belirlemek için kullanılan iki önemli parametreler temsil etmektedir. Burada sıçan BMECs (RBMECs) bir ko-kültür dayalı bir BBB in vitro modelin istihdam, açıklamak ve sıçan kortikal astrositler (RCAs) floresein isothi encapsulating ferritin nanocages trans-BBB nüfuz incelemek içinocyanate (FITC).

Protokol

1. BBB Modeli Kurulması

Not: piyasada mevcut birincil RBMECs ve RCAS kullanmanızı öneririz BBB modeli oluşturmak için. Tüm adımlar, bir laminar akış başlığı içinde ele steril reaktifler ve tek kullanımlık ile gerçekleştirilmelidir.

1. Hücre kültürü
   1. poli-L-lisin, 100 ug / ml (1 saat oda sıcaklığında) veya fibronektin 50 ug / ml (37 ° C de 1 saat) ile kaplayın hücre kültürü şişeleri sırasıyla RCAS veya RBMECs yapışmasını teşvik etmek. Daha sonra,% 5 fetal sığır serumu,% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ve% 1 penisilin / streptomisin (SECM) ile desteklenmiş 1 x 10 ⁶ RCA'ların ve endotel hücre ortamında 5 x 10 ⁵ RBMECs, çözülme. 10 mi SECM bir T75 şişesi içinde 20 mL SECM ve RBMECs bir T175 şişesi içinde tohum RCAs.
      Not: çözülme ve RCA'ların ve RBMECs tohumlama geçitleri kültüründe, hücre yoğunluğu ve zaman açısından ayarlanması gerekir BBB modeli ile test edilecek olan deneysel koşullar sayısına göre yöntem. başlangıç ​​tarafından1 x 10 ⁶ RCA'ların 1 flakon ve 5 x 10 ⁵ RBMECs 1 flakon ile ing, 20 BBB taşıyan ekler kadar elde etmek mümkündür.
   2. RCA'ların için yaklaşık% 80 konflüense kadar 37 ° C'de ve% 5, yaklaşık 6 gün boyunca nemli bir atmosferde _CO2 hücreleri korumak ve RBMECs için% 90 üzerinde birleşir. 5 dakika (T75 balonlarına 1 mi tripsin ve T175 şişelerinden 2 mi): Tripsin-EDTA çözeltisi (250 tripsin 1) kullanarak hücreleri ayırın. SECM tripsin aktivitesi durdurun (2: 1), 5 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj hücre süspansiyonları, 60 mi SECM pelet tekrar süspansiyon.
   3. ekler üzerine ekim önce başka bir 3 gün SECM 3 T175 şişeler ve kültürün içine RBMECs Böl. bir Bürker odasında bir optik mikroskop altında tripan mavisi ile 1: 1 seyreltilmiş, bir hücre süspansiyonu gözlemleyerek, RCAS yaşam sayısı.
2. Eklemeler üzerine Hücre Yayımlama
   1. 6 çoklu-çukurlu transpar polietilen tereftalatın bir tarafına işlenir (PET) membran100 ug / ml poli-L-lisin ve fibronektin 50 ug / ml diğer tarafta, KBB uçlar RCA'ların ve BMECs bağlanmasına izin vermek. PET membranı ile temasını engellemek için cımbız ile ekler anlaştım.
      1. Üst bölme içine fibronektin çözeltisi (en az 500 ul), bir 6 yuvalı plaka içine giren yerleştirin ve ekleyin. 37 ° C'de inkübasyondan 1 saat sonra, fibronektin çözüm kaldırmak çok kuyucuklu plaka kapalı uçlar bir sürede ve steril bir destek olarak kullanılır 150 ^cm2 Petri kabı alt ters koydu zaten ekler kaplı.
      2. Yavaşça (Şekil 1A 'de gösterildiği gibi, RCAs tohumlama olarak anılacaktır) parçanın alt tarafına poli-L-lisin, 800 ul, ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile ekler üzerinde çözüm tutmak.
      3. solüsyonu aspire ve ek 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. uçlar artık hücre tohumlama hazır değil, aynı zamanda birden fazla çoklu plaka saklanabilirBBB yapı ile devam etmeden önce, 4 ° C 'de gün.
         Not: FD40 akı ölçümü ile BBB kuruluş doğrulamak için kontrol olarak kullanılmak üzere, hücreler serbest en az 3 kaplı insertler tutmak için unutmayın.
   2. Tohum RCAs uç (Şekil 1A) baş aşağı üzerine hücre süspansiyonu 800 ul bırakarak poli-L-lizin kaplı insertler alt tarafına (35.000 / ^cm2). zara hücrelerin etkin bağlanmasına olanak sağlamak üzere, oda sıcaklığında 4 saat için ekler RCA süspansiyon bırakın.
   3. Geri kalan solüsyon aspire SECM 2 ml içeren kuyu içine ekler yerleştirin ve her 2 günde bir SECM değişen nemli bir atmosferde 37 ° C'de ve% 5 _CO2 seviyesinde, çok oyuklu plaka muhafaza.
   4. 3 gün sonra, ne zaman RCAs ucun alt yüzeyi kaplanmış olan, aşağıdaki adımları ucun üst tarafına tohum RBMECs:
      1. T175 şişelerinden RBMECs ayırın ve saymaktoplam canlı hücreler, adım 1.1.2 ve 1.1.3 bildirildiği gibi.
      2. Astrositler, sadece 3 uçlar bırakarak SECM (1.000 ul) (Şekil 1B) ekin üst yüzeyi üzerine Tohum RBMECs (60,000 / ^cm2), TEER arka planı olarak kullanılır. standart kültür koşullarında çok oyuklu plaka koyun. her 2 günde bir, iç ve alt bölmede ise SECM değişen en az 3 gün süre ile kültüre sistemi korumak.

2. BBB Doğrulama

1. TEER Ölçümü
   1. Eş-kültür ^3. günde, uygun bir bölme içine BBB taşıyan insertler sokulmasıyla TEER kontrol (yani, bir kap ve haznesi ve kapak hem voltaj algılama ve akım elektrotları, bir çift içeren yerde) 4 dolu SECM ml. Bir epitel doku volt / ohmmetre bağlayın.
   2. Birlikte hücre BBB-sistemleri TEER ölçümleri ile, RCAS inci taşıyan 3 ekler TEER değerleri kaydetmekEn BBBs ile elde edilen değerlerden düşülür. Ω x cm ² gibi sonuçları ifade etmek için insert (4.2 cm ²⁾ yüzeyi tarafından ortaya çıkan TEER değerleri çarpın.
   3. Ko-kültür ^3. gününden itibaren, her gün teer ölçün. Not: TEER artıran bir başlangıç ​​döneminden sonra, kayıtlı değerlerinin (genellikle ^5. ve ko-kültür ^7. gününde arasında) en az iki gün üst üste istikrarlı kalmalıdır. Bu noktada BBB doğrulama (Bölüm 2.2) ve / veya trans-BBB deneyler için ikinci aşama için hazır hale gelir.
      Not: Bölüm 2.1'de açıklanan prosedür aşağıdaki geçirgenlik deneyleri (bölüm 3) ayrılmış, aynı BBB-sistemler üzerinde yapılabilir. steril koşullar altında çalışırlar.
2. Trans-BBB Flux FITC-dekstran 40 (FD40)
   1. 3 boş ekler arasında karşılaştırıldığında BBB modellerinin alt haznesine üst dan FD40 akı ölçünAşağıdaki adımlara göre (bölüm 1.2.1 nota bakınız):
      1. 1 mg ekleme / ml FD40 BBBs üst bölmesine (SECM içinde seyreltilmiş) ve N-, _em 1, 2 ve 3 saat sonra alt bölme 200 ul SECM çekme ve λ _ex (spektroflorimetre ile 488 nm fluoresans şiddetini ölçmek 515 nm) 5 yarık.
      2. Aynı analitik parametreleri kullanarak bakire orta 500 ul ölçme fluorescenceby SECM arka plan için değerler elde. Tüm FD40 floresans değerlerinden SECM arka floresan çıkarın.
      3. Bilinen konsantrasyonda (yani. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 ug / ml) SECM 500 ul içinde çözülmüş flüoresan tracer üretilen bir kalibrasyon eğrisi ile, gözlenen floresans değerlerinden karşılaştırılması ile nüfuz FD40 miktarını belirler.
      4. Göre ortalama akı değerlerden belirgin geçirgenlik katsayısı (P _uygulaması) hesaplayın:
         P _app = J / AC , bir nüfuz alanı ^(cm2) ve Cı üst bölmeye (mol / ^cm3) molekülün konsantrasyonudur.
         Not: Uygun TEER değerlere ulaşmıştır Üç veya daha fazla BBB-sistemleri, münhasıran bu doğrulama prosedürüne tahsis edilmeli ve aşağıdaki geçirgenlik deneyleri (bölüm 3) için kullanılan edilmemelidir. Sterilite zorunlu değildir.

3. trans-BBB FITC yüklü ferritinin nüfuz (FNN)

Not: farklı floresan moleküller kapsüllenmesi için nanocages (FNN) Escherichia coli içinde üretilen ve monte insan ferritin bir rekombinant varyantı (FN), Prof. Prosperi bölgesinin NanoBioLab (University of Milan-Bicocca, İtalya) elde edilebilir. FNN, FITC ile yüklenir, daha önce tanımlanmış olan protokole ¹³ ve hem de Fn ve yüklenmiş moleküllerin konsantrasyonları uygun doğru determin areEd.

1. FITC Trans-BBB Akı ve FITC FNN
   1. Göre inkübasyon 7 ve 24 saat sonra serbest boya ile karşılaştırıldığında, - (CO-kültür ^7. gün, genellikle 5 ^inci) doğrulanmış BBB modelleri alt bölmeye yukardakine FITC FNN akının ölçülmesi aşağıdaki adımlar:
      1. FITC FNN (50 ug / ml FNN, 1.1 uM FITC) için ya da her bir formülasyon için en az 6 BBB sistemleri üst bölme içine serbest FITC eşit miktarda, alt bölmeden SECM çözeltisi 2 mi geri ekle 7 saat sonra ve 24 saat sonra, diğer 3 uçlar alt bölmeden en az 3 ekler.
      2. Spektrofluorimetresi ile toplanan numunelerin 500 ul fluoresans şiddetini ölçmek (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, 5 yarık).
      3. aynı analitik parametreleri kullanarak ortam 500 ul ölçülerek SECM arka floresan elde edilir. SECM arka plan floresan çıkarmaTüm FITC ya da FITC-FNN floresans değerlerinden.
      4. 500 ul SECM içinde çözülmüş serbest veya nanoformulated boyanın bilinen konsantrasyonlarda (yani. 6.87, 13.75, 27.5, 55 nM) ile üretilen iki farklı kalibrasyon eğrileri elde edilen floresan değerleri karşılaştırarak nüfuz eden FITC veya FITC FNN konsantrasyonunu belirleyin.
2. RBMECs FITC-FNN Lokalizasyon
   1. BBB sistemleri üst bölmeden SECM kaldırma PBS ile uçlar yıkayın ve 10 için üst bölmeye 500 ul paraformaldehid (fosfat tamponlu salin-PBS içinde% 4) ilave edilerek her bir deney grubu için en az iki ekin üzerine RBMECs tamir oda sıcaklığında min.
   2. artık paraformaldehid çıkarmak için PBS uçlar üç kez yıkayın.
      Not: Bu noktadan itibaren, kısırlık gerekli değildir.
   3. PET membran uygun parçalar kesin ve aşağıdaki adımları göre hücrelerin immündekorasyon ile devam edin:
      1. permeabi10 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 ile lize RBMECs. PBS içinde% 2 sığır serum albümini (BSA),% 2 keçi serumu ihtiva eden bir çözelti ile oda sıcaklığında 1 saat için bloke aşamasını gerçekleştirir. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile, 1:20 seyreltide bir anti-Von Willebrand Faktörü (vWF) ile inkübe edin.
      2. PBS ile üç kez yıkandıktan sonra,% 2 BSA için oda sıcaklığında 2 saat boyunca hücrelerin maruz, 1 uygun bir ikincil antikor ihtiva eden% 2 keçi serumu çözeltisi: sırayla 300 seyreltme anti-VWR ve DAPI ortaya çıkarmak için 1: çekirdek tespiti için 1500 dilüsyon.
   4. Bir antifade montaj çözümü (insert fragmanı başına bir damla) kullanarak mikroskop lamı üzerine ekleme parçaları monte sonra bir kapak kayma ile örnek kapatın. 40X büyütme, 1.5 zoom ve 1024 x 1024 piksel çözünürlükte bir immersiyon yağı lens kullanarak konfokal mikroskobu ile analiz edin.

Sonuçlar

ekler üzerinde bbb modeli, hücre yapışmasında ve büyüme kurulması sırasında PET membran saydam yapısı bir ışık mikroskobu sayesinde kullanılarak izlenebilir. 35.000 hücre / ^cm2, oda sıcaklığında (Şekil 2A) inkübasyon 4 saat sonra parçanın alt tarafına etkin bir şekilde eklemek yoğunluğunda tohumlanır RCAs ve bir mil şeklinde bir yapıya alma 3 gün zar yüzeyini kaplamak için büyümeye (Şekil 2B). 60.000 hücr...

Tartışmalar

Burada tarif edilen in vitro yöntem, nanopartiküller ile nanoformulation girdiğinde flüoresan moleküllerinin trans-BBB teslim incelemek için yararlı bir geçerli bir yaklaşım sunmaktadır. Burada BBB genelinde kargo moleküllerin translokasyon incelemek için iyi bir aday temsil FNN kullanın. Özellikle BMECs lüminal zarı üzerinde ifade edilen ve burada bir reseptör aracılı içselleştirme yolu kullanan nano partıkuler alımını aracılık eder TfR1 reseptör tarafından tanınır çünkü FNN...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000