쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

요약

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

초록

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

서문

약물 요법에 대한 중추 신경계의 저항 (CNS) 질환 (예. 암, 간질, 우울증, 정신 분열증 및 HIV 관련 신경 장애)로 인해 뇌 혈관 장벽을 통과 곤란한 약물 투과 포함하는 다양한 다른 메커니즘이다 (BBB) . BBB를 혈액 순환 물질로부터 뇌 조직을 분리 경계이다. 이 배리어 내 혈관 주위 세포와 성상 세포의 endfeet 지원 뇌 미세 혈관 내피 세포 (BMECs)의 층은, 분자량이 400 이상인 다 ¹ hydrosoluble 이들 약물에 BBB의 높은 선택성을 담당한다. 또 다른 약물 관련 저항기구는 CNS에 약물 침투를 감소시키고 뇌 ^(2)로부터 자신의 압출을 용이하게하기 위해 협력 약물 유출 컨베이어 (P 당 단백질 및 약제 내성 단백질)의 BMECs에 존재 연결된다.

지난 10 년간, 나노 기술 방법 중 다수는 BBB ^3-6 걸쳐 약물 전달의 임상 적 및 생물학적 과제를 해결하기 위해 개발되었다. 이러한 상황에서, 나노 페리틴 (FNN)는 완전히 혁신적이고 유망한 솔루션을 나타낸다. FNN 8 nm의 내경 중공 구형 구조로 배열되어 자기 조립 (24) 페리틴 (FN) 모노머, 12 nm의 구형이다. 페리틴 소단위는 산성 pH에서 분해 및 다양한 유기 분자를 캡슐화 할 수 있도록 중립성 pH를 가져와 형상 기억 방식으로 조립 될 수있다. 따라서, FNN 다기능 약물 전달 시스템 ^7,8의 개발이 흥미있는 모델을 나타낸다. 또한, FNN이 셀 ^(9)의 내강 막 상에 발현되는 트랜스페린 수용체 (TFR) (1)의 구체적인 포상 BMECs 감사와 상호 작용할 수있다.

지금까지, BBB의 시험 관내 모델이 다른 순으로 하였다 개발되어왔다R은 다양한 약물의 독성 BBB 향해 또는 유출 수송차와 분자의 상호 작용 트랜스 BBB 투과성 해명. 사실,이 모델은 생체 내 연구를 진행하기 전에 활성 분자의 신속한 검사를 위해 접근 체외에서 유효한 것으로 간주됩니다. 이 모델 동물 (쥐, 마우스, 돼지와 소) 또는 인간의 세포 라인 ^{10,11,12에서} 얻은 BMECs 또는 공동 배양 BMECs 및 성상 세포 (드물게 혈관 주위 세포)의 단일 내피 층으로 구성되어 있습니다. TransEndothelial 전기 저항 (봉사자)과 정의 분자량 추적자의 명백한 침투성 (P _{응용 프로그램)은} 체외 모델의 품질을 결정하는 데 사용되는 두 가지 중요한 매개 변수를 나타냅니다. 여기에 우리가 쥐 BMECs (RBMECs)의 공동 문화를 기반으로 BBB 체외 모델의 고용을 설명하고 쥐 대뇌 피질 성상 세포 (RCA 단자)는 형광 isothi을 캡슐화 페리틴 nanocages의 트랜스 BBB 투과를 공부ocyanate (FITC).

프로토콜

1. BBB 모델 구축

참고 : 우리가 시판 차 RBMECs와 RCA 단자를 사용하는 것이 좋습니다 BBB를 모델을 구축하십시오. 모든 단계를 층류 후드에서 멸균 처리 시약 및 일회용으로 수행되어야한다.

1. 세포 배양
   1. 폴리 -L- 라이신 100 μg의 / ㎖ (RT에서 1 시간) 또는 피브로넥틴 50 ㎍ / ㎖ (37 ° C에서 1 시간)와 코트 세포 배양 플라스크는 각각 RCA 단자 또는 RBMECs의 부착을 촉진. 이어서, 5 % 소 태아 혈청, 1 %의 내피 세포 성장 보충와 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (SECM)으로 보충 된 1 × ¹⁰⁶ RCA 단자와 내피 세포 배지에서 5 × ¹⁰⁵ RBMECs, 해동. 10 ml의 SECM의 T75 플라스크에서 20 ㎖의 SECM과 RBMECs의 T175 플라스크에 종자 RCA 단자.
      주 : 해동 및 RCA 단자와 RBMECs 시드의 통로는 배양 세포 밀도와 시간의 조건으로 조정할 필요는 BBB 모델에서 시험 될 실험 조건의 수에 따라. 처음으로1 × ¹⁰⁶ RCA 단자 1 바이알에 5 × ¹⁰⁵ RBMECs 1 바이알로 보내고, 그것을 20 BBB 베어링 삽입까지 얻을 수있다.
   2. RCA 단자에 대해 80 %가 합류 할 때까지 37 ° C, 5 %, 약 6 일 동안 가습 분위기 중의 CO _2에서 세포를 유지하고 RBMECs 90 % 이상 합류. 5 분 (T75 플라스크 1 ㎖의 트립신과 T175 플라스크 2 ㎖)에 대해 : 트립신 EDTA 용액 (250 트립신 1)를 사용하여 세포를 분리합니다. SECM와 트립신 활동 정지 (2 : 1)로 5 분 동안 750 × g에서 원심 분리하고 세포 현탁액 60 ml를 SECM에 펠릿을 재현 탁.
   3. 삽입에 파종 전에 다른 3 일간 SECM 3 T175 플라스크와 문화에 RBMECs을 분할합니다. BURKER 챔버 내에 광학 현미경 하에서 트립 판 블루로 1 : 1 희석하여 세포 현탁액을 관찰함으로써, RCA 단자 생활의 총 수를 계산.
2. 삽입 위에 셀 시드
   1. 6 멀티 웰 transpar의 폴리에틸렌 테레 프탈레이트의 일측 치료 (PET) 멤브레인100 μg의 / ㎖ 폴리 -L- 리신 피브로넥틴를 50㎍ / ㎖로 상대방과 ENT 인서트 RCA 단자와 BMECs의 부착을 허용한다. 애완 막과의 접촉을 피하기 위하여 핀셋을 삽입 핸들.
      1. 상부 챔버로 피브로넥틴 용액 (최소 500 μl를) 6 웰 플레이트에 삽입을 놓고 추가 할 수 있습니다. 37 ° C에서 배양 1 시간 후, 피브로넥틴 용액을 제거 멀티 웰 플레이트 떨어져 삽입을하고 대한 멸균 지원 여기에 사용되는 150cm ² 페트리 접시의 바닥에 거꾸로 넣어 이미 삽입 코팅.
      2. 부드럽게 (도 1a에 도시 된 바와 같이, RCA 단자 시드 라 함)를 인서트의 바닥면에 폴리 -L- 라이신 800 μL를 추가하고, 실온에서 1 시간 동안 인서트의 해결책을 유지한다.
      3. 솔루션을 대기음하고 삽입은 15 ~ 30 분 동안 실온에서 건조 할 수 있습니다. 인서트는 이제 셀 시딩에 대한 준비뿐만 아니라, 여러 가지의 멀티 웰 플레이트에 저장 될 수있다BBB를 건설을 진행하기 전에 4 ° C에서 일.
         참고 : FD40 유량 측정에 의해 BBB 설립의 유효성을 검사하는 컨트롤로 사용되는 세포에서 무료로 최소 3 코팅 삽입을 유지해야합니다.
   2. 시드 RCA 단자 삽입 (도 1a)의 아래에서 위쪽에 세포 현탁액 800 ㎕를 적하하여 폴리 -L- 리신 코팅 된 인서트의 바닥면 상 (35,000 / cm ^2). 막에 세포의 효과적인 부착을 허용하기 위해, RT에서 4 시간 동안 인서트의 RCA 현탁액을 떠난다.
   3. 잔류 용액을 흡인 SECM 2 ㎖을 함유하는 웰에 삽입 배치하고 매 2 일 SECM을 변경 가습 분위기에서 37 ℃, 5 % CO _2의 멀티 웰 플레이트를 유지한다.
   4. 삼일 후에 때 RCA 단자는 인서트의 하부면을 코팅 한 다음이 단계 인서트의 상부면에 시드 RBMECs :
      1. T175 플라스크에서 RBMECs를 분리하고 계산총 살아있는 세포 단계 1.1.2과 1.1.3에보고.
      2. 아스트로 사이트만을 가진 3 삽입 이탈 SECM (1000 μL) (도 1B)에 삽입 체의 상면에 씨앗 RBMECs (60,000 / cm ^2), 티이 배경으로 사용될 수있다. 표준 배양 조건에서 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 2 일마다 내측 하부 챔버 내의 SECM 변경 적어도 3 일간 배양하는 시스템을 유지한다.

2. BBB 검증

1. 봉사자 측정
   1. 공동 배양 3 ^일째에, 적절한 챔버로 BBB 베어링 삽입물을 삽입하여 티이을 확인 (즉, 캡을 가지고 있으며, 챔버 뚜껑 모두 전압 검출 및 전류 쌍의 전극을 포함 할 경우) (4) 충전을 SECM ml의. 상피 조직의 볼트 / 저항계로 연결합니다.
   2. 함께 셀 BBB-시스템 티이 측정에 의해, RCA 단자 번째 베어링 3 인서트 봉사자 값을 기록에서 BBBs 얻은 값에서 차감됩니다. Ω cm의 X의 ^2와 같은 결과를 표현하기 위하여 인서트 (4.2 cm ^2)의 표면에 의해 얻어진 티이 값을 곱한다.
   3. 공동 문화의 3 ^{번째 날부터} 매일 봉사자를 측정한다. 참고 : 봉사자가 증가 초기 기간 후 기록 된 값 (보통 5 ^일 및 공동 문화의 일곱 ^번째 일 사이에) 적어도 두 개의 연속 일 동안 안정적으로 유지해야한다. 그 시점에서 BBB 검증 (2.2 절) 및 / 또는 트랜스 BBB의 실험의 두 번째 단계에 대한 준비가되어 있습니다.
      참고 : 2.1 절에서 설명하는 절차는 다음 투과성 실험 (3 절)에 전념 같은 BBB-시스템에서 수행 할 수 있습니다. 무균 조건에서 작동합니다.
2. 의 트랜스 BBB 플럭스 FITC-덱스 트란 40 (FD40)
   1. 3 빈 인서트 걸쳐 그 비교 BBB 모델의 하부 챔버 상부에서 FD40 광속 측정다음 단계에 따라 (섹션 1.2.1의 주 참조)
      1. 1 ㎎을 추가 / ㎖ FD40는 BBBs의 상부 구획으로 (SECM 희석) 및 λ를, _그들을 1, 2, 3 시간 후, 하부 챔버 200 μL의 SECM 인출 및 λ의 _예를 (spectrofluorimeter으로 488 nm의 형광 강도를 측정 515 nm의) 5 슬릿.
      2. 동일한 분석 매개 변수를 사용하여 처녀 매체의 500 μl를 측정 fluorescenceby SECM 배경에 대한 값을 가져옵니다. 모든 FD40 형광 값의 SECM 배경 형광을 뺍니다.
      3. 공지 농도 (즉. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 μg의 / ㎖) SECM 500 μL에 용해 형광 추적자로 제조 한 검량선과 관찰 된 형광 값의 비교에 의해 투과 FD40의 양을 결정한다.
      4. 에 따라 평균 플럭스 값의 외관상 투과 계수 (P _{응용 프로그램)을} 계산한다 :
         P _앱 = J / AC , A는 투과 면적 (cm ^2)이고, C는 상기 상부 구획실 (몰 / cm ^3)의 분자의 농도이다.
         참고 : 적절한 봉사자 값에 도달했습니다 3 개 이상 BBB-시스템은 독점적으로이 검증 절차에 전념해야하며, 다음과 같은 투과성 실험 (섹션 3)에 이용되어서는 안된다. 불임은 필수가 아닙니다.

3. 횡단 BBB FITC로드 Ferritins의 침투 (FNN)

참고 : 다른 형광 분자의 캡슐화 nanocages (FNN)에서 대장균에서 생산 및 조립 인간 페리틴의 재조합 변형 (FN)이,의 교수 스페리의 NanoBioLab (대학 밀라노 - 비 코카, 이탈리아)에서 구할 수 있습니다. FNN은 FITC로드 이전에 설명 프로토콜 ⁽¹³⁾ 모두 Fn을로드 분자의 농도에 따라 정확하게 determin되어 있습니다에디션.

1. FITC의 트랜스 BBB 플럭스 및 FITC-FNN
   1. 항에있어서, 배양 7 및 24 시간 후에 자유 염료에 비하여, - (CO 배양 7 ^일째 통상 5 ^일에서) 유효성 BBB 모델의 하부 챔버 상부에서 FITC-FNN 광속 측정 다음 단계 :
      1. FITC-FNN은 (50 μg의가 / ㎖ FNN 1.1 μM FITC) 순으로 각 제제에 대해 적어도 6 BBB 시스템의 상부 챔버로 프리 FITC의 동일한 양의 하부 챔버로부터 SECM 용액 2 ㎖을 인출 추가 7 시간 후, 24 시간 후 다른 3 인서트의 하부 챔버에서 최소 3 삽입.
      2. spectrofluorimeter에 의해 수집 된 시료 500 μL의 형광 강도를 측정 (λ의 _전 488 nm의, λ _안에 515 나노 미터, 5 슬릿).
      3. 동일한 분석 매개 변수를 사용하여 매체의 500 μl를 측정하여 SECM 배경 형광을 얻습니다. SECM 배경 형광을 빼기모든 FITC 또는 FITC-FNN 형광 값에서.
      4. 500 μL SECM에 용해 유리 또는 nanoformulated 염료의 공지 된 농도 (즉. 6.87, 13.75, 27.5, 55 ㎚)로 제조 된 두 개의 서로 다른 캘리브레이션 곡선 얻어진 형광 값을 비교하여 투과 FITC 또는 FITC-FNN의 농도를 결정한다.
2. RBMECs에 FITC-FNN 현지화
   1. 상기 BBB 시스템의 상부 챔버로부터 SECM 제거 PBS로 삽입 씻어 10 상부 구획에 500 ㎕의 파라 포름 알데히드 (인산염 완충 식염수 PBS 4 %)을 첨가하여, 각 실험군에 대해 적어도 두 개의 인서트에 RBMECs 해결 RT에서 분.
   2. 잔류 파라 포름 알데히드를 제거하는 PBS로 삽입을 세 번 씻으십시오.
      참고 :이 시점에서, 불임이 필요하지 않습니다.
   3. 애완 막의 적합한 부분을 절단하고, 다음의 단계를 따라 세포를 진행 immunodecoration :
      1. Permeabi10 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 리제 RBMECs. PBS 2 % 소 혈청 알부민 (BSA), 2 % 염소 혈청을 함유하는 용액으로 실온에서 1 시간 동안 차단하는 단계를 수행한다. RT에서 2 시간 동안 1:20 희석 항 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 샘플을 인큐베이션.
      2. PBS로 3 회 세척 한 후, 2 % BSA로 RT에서 2 시간 동안 세포를 노출하는 하나에 적합한 차 항체를 함유하는 2 % 염소 혈청 용액 : 위해 300 희석 (A)에서 안티 VWR 및 DAPI를 공개 1 : 핵 탐지를위한 1,500 희석.
   4. antifade 장착 솔루션 (삽입 조각 당 하나의 드롭)를 사용하여 현미경 슬라이드 상에 삽입 조각을 탑재, 다음, 커버 슬립과 함께 샘플을 닫습니다. 40X 배율, 1.5 줌과 1,024 X 1,024 픽셀 해상도에서 기름 침지 렌즈를 사용하여 공 초점 현미경으로 분석합니다.

결과

인서트의 BBB 모델, 세포 부착 및 성장의 확립 중에 PET 막의 특성상 투명 광학 현미경 감사를 사용하여 모니터링 할 수있다. 35,000 세포 / cm ^2, RT (도 2A)에서 배양 4 시간 후, 인서트의 바닥면에 효과적으로 부착의 밀도로 시딩 RCA 단자와, 스핀들 형상의 형태를 가지고, 일에 막 표면을 덮도록 성장 (그림 2B). 60,000 세포 / ^㎠의 밀도로 접...

토론

여기에 설명 된 체외 방법은 나노 입자와 nanoformulation에 따라 형광 분자의 트랜스 BBB 전달을 연구하는 데 유용한 검증 된 접근 방식을 나타냅니다. 여기에서 우리는 BBB에서화물 분자의 전위를 연구 할 수있는 좋은 후보를 나타냅니다 FNN를 사용합니다. 그것은 구체적으로 BMECs의 내강 막에 표현 수용체 매개 내재화 경로를 사용하여 나노 입자의 흡수를 매개하는 TfR1 수용체에 의해 인식되기 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000