In vitro de permeación de ferritinas cargados con FITC través de una barrera sangre-cerebro de rata: un modelo para estudiar la entrega de moléculas Nanoformulated

Resumen

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Resumen

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Introducción

La resistencia del sistema nervioso central (SNC) enfermedades (es decir. El cáncer, la epilepsia, la depresión, la esquizofrenia y el trastorno neurológico asociado con el VIH) a las terapias farmacológicas se debe a varios mecanismos diferentes, incluyendo penetración de fármaco ardua través de la barrera hematoencefálica (BBB) . La BBB es la frontera que aísla los tejidos del cerebro de las sustancias que circulan en la sangre. Dentro de esta barrera, una capa de células microvasculares endoteliales del cerebro (BMECs), apoyado por pericitos y endfeet astrocitos, es responsable de la alta selectividad de la acreditación a esos medicamentos hidrosolubles con un peso molecular superior a 400 Da ^1. Otro mecanismo de resistencia relacionada con la droga está vinculada a la presencia en BMECs de transportadores de flujo de salida de fármaco (P-glicoproteína y resistencia a múltiples fármacos, proteínas) que cooperan para reducir la penetración del fármaco en el SNC y facilitar su extrusión desde el cerebro ^2.

En la ultima década, Un gran número de ámbito de las nanotecnologías se han desarrollado para hacer frente al desafío clínico y biológico de la administración de fármacos a través de la acreditación ^3-6. En este contexto, nanoesferas de ferritina (Fnn) representan una solución totalmente innovadora y prometedora. Fnn son esferas 12 nm de 24 ferritina auto-montaje (Fn) monómeros, que están dispuestos en una estructura esférica hueca de 8 nm de diámetro interior. subunidades de ferritina se pueden desmontar a pH ácido y volver a montar de una manera con memoria de forma por lo que el pH a la neutralidad, lo que permite diversas moléculas orgánicas a encapsular. Por lo tanto, Fnn representan un modelo interesante para el desarrollo de múltiples funciones de administración de fármacos sistemas ^7,8. Por otra parte, Fnn puede interactuar con BMECs gracias al reconocimiento específico de receptor de transferrina (TfR) 1, que se expresa en la membrana luminal de estas células ^9.

Hasta el momento, diferentes modelos in vitro de la acreditación han sido desarrolladas en el order para dilucidar trans-BBB permeabilidad a los diversos fármacos, toxicidad hacia la BBB, o la interacción de las moléculas con transportadores de salida. De hecho, estos modelos se consideran válidas en vitro enfoques para un cribado rápido de moléculas activas antes de continuar con estudios in vivo. Estos modelos se componen de una sola capa endotelial de BMECs o BMECs y astrocitos co-cultivadas (más raramente pericitos), obtenido a partir de animales (rata, ratón, cerdo y bovino) o líneas celulares humanas ^10,11,12. El transendotelial Resistencia Eléctrica (TEER) y la permeabilidad aparente (P _app) de trazadores con un peso molecular definido representan dos parámetros críticos que se utilizan para determinar la calidad del modelo in vitro. Aquí se describe el empleo de un modelo de acreditación in vitro, basado en un co-cultivo de rata BMECs (RBMECs) y la rata astrocitos corticales (ARC) para estudiar la permeabilidad trans-acreditación de nano-cajas de ferritina encapsular isothi fluoresceínaocyanate (FITC).

Protocolo

1. Establecer el modelo de acreditación

Nota: Para establecer el modelo de acreditación sugerimos usar RBMECs primarias disponibles comercialmente y ARC. Todos los pasos deben realizarse con reactivos y material desechable estéril, que se manejan en una campana de flujo laminar.

1. Cultivo de células
   1. Escudo frascos de cultivo celular con poli-L-lisina 100 mg / ml (1 hora a temperatura ambiente) o fibronectina 50 mg / ml (1 hora a 37 ° C) para promover la unión de las ARC o RBMECs, respectivamente. Entonces, deshielo 1 x 10 ⁶ ARC y 5 x 10 ⁵ RBMECs en medio de células endoteliales, suplementado con 5% de suero bovino fetal, 1% de suplemento de crecimiento de células endoteliales y 1% de penicilina / estreptomicina (SECM). RCA de semillas en un matraz T175 en 20 ml SecM y RBMECs en un matraz T75 en 10 ml SecM.
      Nota: La descongelación y pasajes de siembra de ARC y RBMECs deben ajustarse, en términos de densidad de células y el tiempo en cultivo, de acuerdo con el número de condiciones experimentales para ensayar con el modelo de BBB. por inicioing con 1 vial de 1 x 10 ⁶ ARC y 1 vial de 5 x 10 ⁵ RBMECs, es posible obtener hasta 20 insertos BBB-cojinete.
   2. Mantener las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ en una atmósfera humidificada durante aproximadamente 6 días, hasta alrededor de 80% de confluencia para ARC y más de 90% de confluencia para RBMECs. Separar las células usando solución de tripsina-EDTA (tripsina 1: 250) durante 5 min (1 ml de tripsina para matraces T75 y 2 ml para matraces T175). Deja de actividad de la tripsina con SECM (2: 1), suspensiones de células de centrifugación a 750 xg durante 5 min y volver a suspender los pelets en 60 ml SECM.
   3. Dividir los RBMECs en 3 matraces T175 y la cultura en SecM por otros 3 días antes de la siembra en los insertos. Contar el número total de vida ARC, mediante la observación de una suspensión celular diluida 1: 1 con azul de tripano con un microscopio óptico en una cámara Burker.
2. La siembra de células en insertos
   1. Tratar a un lado del tereftalato de polietileno (PET) de la membrana de transpa 6 pocillos múltiplesinserciones ORL con poli-L-lisina 100 mg / ml y el otro lado con fibronectina 50 g / ml, para permitir la fijación de RCA y BMECs. Manejar los insertos con pinzas con el fin de evitar el contacto con la membrana de PET.
      1. Coloque los insertos en una placa de 6 pocillos y añadir solución de fibronectina (mínimo 500 l) en la cámara superior. Después de 1 h de incubación a 37 ° C, se retira la solución de fibronectina, tome las inserciones de la placa de múltiples pocillos y ponerlos boca abajo en el fondo de un 150 cm plato ² Petri, que se utiliza aquí como un soporte estéril para el ya recubiertos insertos.
      2. Añadir con cuidado 800 l de poli-L-lisina en el lado inferior de la pieza de inserción (como se muestra en la Figura 1A; se hace referencia como la siembra ARC), y mantener la solución en los insertos durante 1 hora a RT.
      3. Aspirar la solución y dejar que los insertos se secan a temperatura ambiente durante 15-30 min. Los insertos están ahora listos para la siembra de células, pero también se pueden almacenar en la placa de múltiples pocillos para variosdías a 4 ° C, antes de proceder a la construcción de la acreditación.
         Nota: Recuerde que debe mantener al menos 3 insertos recubiertos libres de células, para ser utilizados como controles para validar la acreditación establecimiento por FD40 mediciones de flujo.
   2. ARC semillas (35.000 / cm ²⁾ en el lado inferior de los insertos de poli-L-lisina, dejando caer 800 l de suspensión de células en el revés de inserción (Figura 1A). Dejar la suspensión RCA en los insertos durante 4 horas a RT, con el fin de permitir la fijación eficiente de las células a la membrana.
   3. Aspirar la solución residual, colocar los insertos en los pocillos que contenían 2 ml de SECM y mantener la placa de múltiples pocillos a 37 ° C y 5% de CO ₂ en una atmósfera humidificada, cambiando el SECM cada 2 días.
   4. Después de 3 días, cuando las ARC han revestido la cara inferior de la inserción, RBMECs de semillas sobre el lado superior del inserto, siguiendo estos pasos:
      1. Separar RBMECs de los matraces T175 y contar ellas células vivas totales, como se informó en los pasos 1.1.2 y 1.1.3.
      2. RBMECs semillas (60.000 / cm ²⁾ sobre la superficie superior del inserto en SECM (1000 l) (Figura 1B), dejando 3 insertos con sólo los astrocitos, que se utilizarán como fondo TEER. Colocar la placa de múltiples pocillos en condiciones de cultivo estándar. Mantener el sistema de cultivo durante al menos 3 días, cambiando el SecM en la cámara interior e inferior cada 2 días.

2. Validación de la acreditación

1. Medición TEER
   1. En el ^3er día de co-cultivo, compruebe la TEER mediante la inserción de los insertos que portan la acreditación en una cámara apropiada (que tiene una tapa y donde tanto la cámara y la tapa contienen un par de detección de voltaje y los electrodos de corriente), lleno de 4 ml de SECM. Conectarse a una epiteliales del tejido voltios / ohmímetro.
   2. Junto con las mediciones de TEER de las células BBB-sistemas, registrar los valores de TEER de los 3 Casquillos de cojinetes de las ARC thWill restarse de los valores obtenidos con el BBBs. Multiplicar los valores de TEER resultantes por la superficie de la pieza de inserción (4,2 cm ²⁾ a fin de expresar los resultados como Ω x cm ^2.
   3. A partir de los ³ días de co-cultivo, medir la TEER todos los días. Nota: Después de un período inicial en el que el TEER aumenta, los valores registrados deben permanecer estables durante al menos dos días consecutivos (por lo general entre el ^5º y el ^7º día de co-cultivo). En ese punto la BBB está listo para la segunda etapa de validación (sección 2.2) y / o para los experimentos de trans-BBB.
      Nota: El procedimiento descrito en la sección 2.1 se puede realizar en las mismas BBB-sistemas dedicados a los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). Operar bajo condiciones estériles.
2. Trans-Flux acreditación de FITC-dextrano 40 (FD40)
   1. Medir el flujo FD40 desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB en comparación con los que a través de 3 insertos vacíos(Véase la nota de la sección 1.2.1) de acuerdo con los siguientes pasos:
      1. Añadir 1 mg / ml FD40 (diluido en SECM) en el compartimiento superior de la BBBs, y después de 1, 2 y 3 hr retirar 200 SECM l de la cámara inferior y medir la intensidad de fluorescencia por espectrofluorímetro (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, de hendidura 5).
      2. Obtener los valores para el fondo SECM fluorescenceby medición de 500 l de medio de virgen utilizando los mismos parámetros analíticos. Restar la fluorescencia de fondo SecM de todos los valores de fluorescencia FD40.
      3. Determinar la cantidad de FD40 permeado mediante la comparación de los valores de fluorescencia observados con una curva de calibración producida con concentraciones conocidas (es decir. 0.312, 0.625, 1.25, 2.5 mg / ml) del trazador fluorescente disuelto en 500 l de SECM.
      4. Calcular el coeficiente de permeabilidad aparente (P _app) a partir de los valores de flujo de medios de acuerdo con:
         P _app = J / AC
         Donde J es el flujo de la molécula (moles / seg), A es el área de permeación (cm ²⁾ y C es la concentración de la molécula en el compartimiento superior (moles / cm ^3).
         Nota: Tres o más BBB-sistemas que han alcanzado valores de TEER adecuados, deben estar dedicados exclusivamente a este procedimiento de validación, y no deben emplearse para los siguientes experimentos de permeabilidad (sección 3). La esterilidad no es obligatorio.

3. Trans-acreditación Penetración de la ferritinas cargado con FITC (FNN)

Nota: Una variante recombinante de la ferritina humana (Fn), producida en Escherichia coli y se reunieron en nano-cajas (FNN) para la encapsulación de diferentes moléculas fluorescentes, está disponible en el NanoBioLab del Prof. Prosperi (Universidad de Milán-Bicocca, Italia). Fnn se cargan con FITC, de acuerdo con un protocolo previamente descrito ¹³ y las concentraciones de ambos Fn y las moléculas cargadas se determin precisióned.

1. Trans-Flux acreditación de FITC y FITC-Fnn
   1. Medir el flujo de FITC-Fnn desde la parte superior a la cámara inferior de los modelos de BBB validados (por lo general en el ^5º - ^7º día de co-cultivo), en comparación con la del colorante libre después de las 7 y 24 horas de incubación, según los pasos siguientes:
      1. Añadir FITC Fnn (50 mg / ml Fnn, 1,1 M FITC) o una cantidad igual de libre FITC en la cámara superior de al menos 6 sistemas de BBB para cada formulación, con el fin de retirar 2 ml de solución SecM de la cámara inferior de al menos 3 insertos después de las 7 horas, y desde la cámara inferior de otros 3 insertos después de 24 horas.
      2. Medir la intensidad de fluorescencia de 500 l de las muestras recogidas por espectrofluorímetro (λ _ex 488 nm, λ _em 515 nm, hendidura 5).
      3. Obtener la fluorescencia de fondo SECM mediante la medición de 500 l de medio utilizando los mismos parámetros analíticos. Restar la fluorescencia de fondo SecMde todos los valores de fluorescencia FITC o FITC-Fnn.
      4. Determinar la concentración de FITC por permeabilidad o FITC-Fnn mediante la comparación de los valores de fluorescencia obtenidos con dos curvas de calibración diferentes producidos con concentraciones conocidas (es decir. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libre o nanoformulated disuelto en 500 l SECM.
2. FITC-Fnn Localización en RBMECs
   1. Eliminar SECM de la cámara superior de los sistemas de BBB, lavar los insertos con PBS y fijar los RBMECs en al menos dos piezas de inserción para cada grupo experimental mediante la adición de 500 paraformaldehído l (4% en tampón fosfato salino-PBS) en el compartimiento superior para 10 min a TA.
   2. Lavar los insertos de tres veces con PBS para eliminar el paraformaldehído residual.
      Nota: A partir de ahora, la esterilidad no es necesario.
   3. Cortar trozos adecuados de la membrana de PET, y proceder con la immunodecoration de las células según los siguientes pasos:
      1. permeabilize RBMECs con 0,1% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos. Realizar una etapa de bloqueo durante 1 hora a RT con una solución que contiene 2% de albúmina de suero bovino (BSA), 2% de suero de cabra en PBS. Se incuban las muestras con un Willebrand Factor anti-Von (VWF) a una dilución de 1:20, durante 2 horas a RT.
      2. Después de lavar tres veces con PBS, exponer las células durante 2 horas a TA a una BSA 2%, una solución de suero de cabra 2% que contiene un anticuerpo secundario adecuado a una dilución 1: 300 con el fin de revelar la anti-VWR, y DAPI a una dilución 1: 1500 para la detección de núcleos.
   4. Montar las piezas de inserción en portaobjetos de microscopio utilizando una solución de montaje antifade (una gota por fragmento de inserción), a continuación, cierre la muestra con un cubreobjetos. Analizar mediante microscopía confocal usando un lente de inmersión en aceite a 40 aumentos, zoom de 1,5 y 1.024 x 1.024 píxeles de resolución.

Resultados

Durante el establecimiento de la BBB modelo, la unión celular y el crecimiento en las piezas de inserción se puede controlar usando un microscopio de luz gracias a la naturaleza transparente de las membranas de PET. ARC, sembradas a una densidad de 35.000 células / cm ^2, conecte de manera eficiente a la parte inferior de la pieza de inserción después de 4 h de incubación a RT (Figura 2A) y crecer para cubrir la superficie de la membrana en 3 días, tenie...

Discusión

El método in vitro descrito aquí representa un enfoque validado útil para estudiar la entrega trans-BBB de moléculas fluorescentes sobre nanoformulation con nanopartículas. Aquí utilizamos Fnn, lo que representa un buen candidato para estudiar la translocación de moléculas de carga a través de la BBB. Fnn se considera el nanovector oro para la entrega trans-BBB de drogas / agentes, ya que está específicamente reconocido por el receptor de TfR1, que se expresa en la membrana luminal de BMECs y media e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000