毛细管电泳监视肽接枝壳聚糖膜实时

摘要

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

摘要

自由溶液的毛细管电泳（CE）在溶液中，通过电场的应用分离分析物，通常电荷的化合物。相对于其他的分析分离技术，如色谱法，CE是便宜，耐用和有效不需要样品制备（对于一些复杂的天然基质或聚合物样品）。 CE是快速和可用于实时跟踪（ 例如 ，化学反应动力学）的混合物的演进，作为用于分离的化合物中观察到的信号是直接正比于它们在溶液中的数量。

这里，CE的效率表现出用于监测肽的共价接枝到用于随后的生物医学应用的壳聚糖薄膜。脱乙酰壳多糖的抗微生物和生物相容特性使其用于生物医学应用，如细胞生长底物的有吸引力的材料。共价嫁接肽RGDS（精氨酸 - 甘氨酸 -天冬氨酸 - 丝氨酸）到脱乙酰壳多糖膜的表面旨在改善细胞附着。从历史上看，色谱法和氨基酸分析已经被用于提供接枝肽的量的直接测量。然而，通过CE提供样品制备的快速分离和不存在下使肽接枝过程同样准确但实时监控。 CE是能够分离和量化反应混合物的不同组成部分:（非接枝）肽和化学偶联剂。在这种方式中使用的CE导致下游应用改进的薄膜。

通过固态NMR（核磁共振）光谱的壳聚糖膜进行了表征。这种技术是比较耗时，并且不能在实时应用，但产生的肽的直接测量，从而验证了CE技术。

引言

自由溶液的毛细管电泳（CE）是分隔在根据它们的电荷对摩擦比^1,2解化合物的技术。电荷-尺寸比通常在文献中所提到的，但这种简化并不适用于聚电解质，其中包括在这项工作中的多肽，并且也显示出不适合小有机分子^3。 CE不同于其它分离技术，因为它不具有固定相，仅一个背景电解质（通常是缓冲液）。这使得该技术将在其分析大范围样本的复杂基质^4，如植物纤维^5，发酵酿造⁶接枝到合成聚合物^7，食品样品⁸和难溶肽⁹无需繁琐的样品制备和能力强劲纯化。这是一个复杂的聚电解质具有的溶解问题（S特别显著UCH壳聚糖¹⁰和结冷胶^11），因此，存在如凝集或在溶液中沉淀，并已成功地分析没有样品过滤。此外，早餐谷类食品糖的分析涉及的早餐麦片样品颗粒注入样品中水⁸沉淀。这还延伸至支链聚电解质或共聚物^12,13的分析。大量的工作也已在CE技术的发展专门为蛋白质的蛋白质组学^14，天然或合成的肽¹⁵和蛋白质和肽¹⁶的微芯片的分离的手性分离的分析完成。由于分离和分析发生在毛细管，样品只有小体积和溶剂被用于使CE为具有比其它分离技术包括色谱法^5,6,17较低的运行成本。由于通过CE分离速度快，它允许monito反应动力学的环。这表现在肽的接枝改进细胞粘附¹⁸脱乙酰壳多糖膜的情况下。

脱乙酰壳多糖是从几丁质的N- -deacetylation衍生的多糖。脱乙酰壳多糖膜可用于各种生物医学应用，例如生物粘合剂¹⁹和细胞生长基板^18,20，由于脱乙酰壳多糖的生物相容性^21。细胞附着到特定的细胞外基质蛋白，如纤连蛋白，胶原和层粘连蛋白，直接关系到细胞²²的存活。值得注意的是，不同的细胞类型往往需要连接到不同的细胞外基质蛋白生存和正常功能。结果表明细胞附着于壳聚糖膜，通过纤维连接蛋白²³的嫁接得到加强;然而，制备，纯化和这样大蛋白质的接枝是在经济上不可行。或者一系列小肽甲肝È被证明能够模仿大胞外基质蛋白的性质。例如，肽如纤连蛋白模拟物的RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）和RGDS（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸）已经被用于促进和增加细胞附着^24。 RGDS到壳聚糖膜的共价嫁接导致已知附加到纤维连接蛋白在体内细胞¹⁸提高细胞附着。代较大的蛋白质喜欢和较小的肽具有相同的功能提供了一个显著成本降低纤维连接蛋白。

这里，如先前发表¹⁸进行肽接枝到壳聚糖。正如以前证明，这种方法通过使用偶联剂EDC盐酸（1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳化二亚胺）和NHS（N-羟基）官能的RGDS的羧酸是提供简单而有效的接枝接枝到壳聚糖薄膜。这种接枝方法的两个优点是，它不需要壳聚糖或肽的任何修改，并且在水性介质中进行的，以最大程度地与未来细胞培养应用^18,20的兼容性。作为耦合剂和所述肽可以充电，CE是用于反应动力学的分析的合适方法。重要的是，经由CE中的反应动力学的分析，可以在接枝反应进行实时监控，并且因此能够既优化和量化接枝度。

虽然它不是常规必要，在CE分析的结果可以被离线由肽接枝到利用固体NMR（核磁共振）光谱^25,26的脱乙酰壳多糖膜的直接测量验证以证明共价接枝的的肽到薄膜^18。然而，随着固态NMR光谱法相比，实时分析由设置CE能够实时肽消耗，从而以评估反应的动力学的能力的定量。

上述方法是简单，并且允许肽的接枝到与接枝的程度的间接定量脱乙酰壳多糖膜的实时分析。所表现出的方​​法可以扩展到不同的化学反应，只要反应物或待分析可充电产品的实时定量评估。

研究方案

1.壳聚糖膜的制备

1. 称输出2克冰醋酸的，完整的100毫升的超纯水。
2. 称出1.7克壳聚糖粉末，加入100毫升的2％M / M乙酸水溶液。搅拌5天，在室温下或用铝箔覆盖或在黑暗中搅拌棒和磁力搅拌板。
3. 离心脱乙酰壳多糖分散液在1,076 xg离心在23℃1小时。收集用注射器上清液并丢弃沉淀物。
4. 为每部影片，等分试样的10ml脱乙酰壳多糖的悬浮液成在室温下具有9厘米塑料培养皿中。离开覆盖干燥至少7天的电影。
5. 用剪刀剪断干膜成1×1cm的正方形。注意:实验可在此阶段被暂停。

2.制备磷酸盐缓冲盐水的（PBS）中

1. 称出8克氯化钠将0.2g氯化钾，1.44克氢二钠磷酸phate及0.24g的磷酸二氢钾。
2. 溶解这些称量的化学品在800毫升的超纯水，用浓盐酸将溶液滴定至pH 7.4。
   注意:实验可在此阶段被暂停。

在pH 9.2的75mM硼酸钠缓冲液3.制备

1. 称取3.0915克硼酸。将其溶解于75ml超纯水中。
2. 滴定硼酸溶液与氢氧化钠溶液的pH为9.2，以10 M或更高的浓度。
   注意:浓缩的氢氧化钠溶液有腐蚀性，应带手套处理。
3. 完全用超纯水，得到100毫升溶液中。这产生在pH 9.2的500mM硼酸钠缓冲液。
4. 稀释用超纯水的500mM的硼酸钠缓冲液至75mM的硼酸钠缓冲液。注意:实验可在此阶段被暂停。

4.壳聚糖网络连接的研制LMS的接枝反应

1. 冲洗在5ml PBS中进行2小时10平方壳聚糖膜（1×1厘米）在室温下在培养皿中。
2. 在此期间，准备和验证的毛细管电泳仪（步骤5）。

5.编写和验证的毛细管电泳仪的

1. 制备43.5厘米裸熔融石英毛细管50μm的内径（43.5厘米是总长度，有效长度的检测窗口通常为35厘米）通过在与所述设定的长度弱化毛细管的聚合物外涂层钝具则贴紧毛细管。
   1. 用打火机烧在从入口8.5厘米聚合物涂层创建毛细管一个窗口，它冷却后擦拭干净用乙醇。烧毛细管的涂层在每一端为用打火机几毫米，并且它冷却后擦拭干净，用乙醇。
   2. 地方毛细血管INSI德检测窗口，并将其在毛细管盒通过将它放置在该入口和出口相等的长度和卷绕它围绕带盒的转轴安装。然后安装在毛细管电泳仪的纸盒。
2. 设置每个分离的方法的参数。在软件菜单中选择"方法"，然后"编辑整个方法"。设定温度，时间，电压，和用于分离（例如25℃，10分钟，30千伏）的小瓶中。
   1. 在预调节部分，设置连续刷新:10分钟，用1M氢氧化钠（在水中），5分钟用0.1M氢氧化钠（在水中），5分钟，用超纯水和5分钟，75毫硼酸钠缓冲液在一系列分析的第一方法pH为9.2。
   2. 用于后续的方法中，设置集在预处理部分连续刷新:1分钟用1M氢氧化钠（在水中），5分钟，75毫硼酸钠缓冲液在pH为9。2。
   3. 在注入部分，用于高压注射为10秒，所有的方法30毫巴压力设定参数。在分离部分中，9分钟为所有方法设置分离条件至30千伏在25℃。
      注:请具体CE设备的用户手册，作为程序操作CE仪器制造商之间可能会有所不同。制备的当天1M氢氧化钠溶液。
3. 注入和分离出中性内标（10％体积/体积的二甲基亚砜10微升（DMSO）中，在稀释到450微升的75mM硼酸钠缓冲液的水）。然后注入并以同样的方式分离的低聚丙烯酸酯标准（以^10g∙L-1溶解在超纯水中;见材料清单）检查毛细管的有效性。在这里暂停序列，直到接枝反应准备开始。

6.嫁接到RGDS壳聚糖膜的

1. 称出所述肽（1毫克RGDS）和偶联剂（3毫克EDC·HCl和2毫克NHS）。
2. 在PBS中的脱乙酰壳多糖膜浸泡开始后2小时，溶解肽，并在5毫升的PBS的偶联剂。
   1. 取该溶液的50微升等分试样。在水中添加2微升的10％体积/体积的DMSO作为内部中性标准的等分试样。分析与CE等分（见第7步）。
3. 除去5毫升的PBS用于冲洗从培养皿的脱乙酰壳多糖膜。 5 ml的溶液肽和偶联剂添加到含有脱乙酰壳多糖膜的培养皿。
4. 覆盖培养皿用石蜡膜，并将其放置在室温下轨道摇床。以反应介质的50微升等分在设定的时间。
   注:总的分析时间与CE为15分钟，从而将等分试样可以采取每15分钟（或每30分钟，如果两个反应并行监视， 等 ）。
   1. 在水中添加2微升的10％体积/体积的DMSO作为内部中性标准对每个人iquot。
      注:等分应该符合CE，尽快为他们取来分析（见第7步）。
5. 后摇和分装去除4小时，取出从振动筛的培养皿。除去从培养皿反应介质中。加入5毫升的PBS冲洗壳聚糖薄膜。
6. 从培养皿中取出PBS，漂洗用超纯水的脱乙酰壳多糖膜，并允许他们干燥过夜。除去超纯水，并在-20℃下的薄膜储存于塑料培养皿。

7.接枝反应监测使用CE

1. 注射以及使用的分析条件，在部分5.2培养皿中取出后，立即反应介质的单独分装。
2. 一旦分离完成漂洗用超纯水毛细管10分钟。干它通过与10分钟的空药瓶（空气）冲洗。
   注:实验可以在此阶段被暂停。

8.数据TREA tment为CE

1. 检查每个分离的有效性，通过检查这两个分离期间的电流和电渗流动性标记（DMSO在这种情况下）的迁移时间是类似的低聚丙烯酸酯标准分离所观察到的那些。
   注:最多10-15％的变化是从约50微安和1.3分钟迁移时间值的预期电流值上可接受的（如需要更高的可重复性的电泳迁移率的值应该被用来代替迁移时间）。
2. 对于每个成功的分离，通过选择一个特定的数据集，右键点击出口，并选择适当的信号输出从毛细管电泳软件的原始数据。
3. 转换由CE记录的原始数据（表示为UV吸收为迁移时间的函数）。转换X轴（迁移时间t _米 ）到下面的等式1的电泳迁移率μ:
   N + 1"SRC ="/文件/ ftp_upload / 54549 / 54549eq1.jpg"/>（1）
   其中，L _d是长度到检测器中，L _t是毛细管的总长度，V是电压，而t _EO为中性物种（在此情况下，DMSO的内标^）27的迁移时间。
   转换的原始数据（吸光度在AU）的Y轴的电泳迁移率W（μ）的分布下列公式^2:28
   （2）

9.肽接枝膜¹⁸的附加特性

1. 将肽接枝壳聚糖膜，在自己周围转了转，采用4 mm固态核磁共振转子。填充转子用磷酸盐缓冲盐水溶胀膜，并关闭转子。等待了几个小时。
2. ¹³分析了电影^</ SUP> C-NMR光谱^18。

结果

CE非常适合监测肽（ 例如 ，RGDS）接枝到壳聚糖膜。合适的偶联剂包括EDC·HCl和NHS其中激活肽接枝到壳聚糖（ 图1）。 CE是能够与感兴趣的不同的分子从反应介质中分离。要分配的电泳峰，纯RGDS，EDC-HCl和NHS溶解，注入并单独分开。峰值分配后，将反应介质注入和各种反应物进行鉴定（ 图2）。的EDC·HCl反应成副产物EDH盐酸（3 - （（（乙基氨?...

讨论

这里所描述的协议的简单性使得它非常适合于广泛的应用。但是，需要特别注意支付给下面的关键步骤。

正确的CE仪器准备

它以分离已知的标准之前立即未知样品的分离（以及在一系列分离的结束时），检查在毛细管和仪器在当天的有效性是重要的。这个标准可以是低聚丙烯酸酯²⁷或已知在宽范围的迁移时间，得到多个峰的任何样品...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water	Millipore		All water used in the experiment has to be of Milli-Q quality
Chitosan powder (medium molecular weight)	Sigma-Aldrich	448877	lot MKBH1108V was used. Significant batch-to-batch variations occur with natural products such as polysaccharides
Acetic acid - Unilab	Ajax Finechem	2-2.5L GL	laboratory reagent
Dimethylsulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	laboratory reagent, slightly hazardous to skin, hazardous if ingested
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465	laboratory reagent, corrosive
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide	Sigma-Aldrich	D80002	Irritant to skin
N-hydroxysuccinimide	Sigma-Aldrich	130672	Irritant to skin
Sodium chloride	Ajax Finechem	466-500G	laboratory reagent
Potassium chloride - Univar	Ajax Finechem	384-500G	analytical reagent, slight skin irritant
Disodium hydrogen phosphate - Unilab	Ajax Finechem	1234-500G	laboratory reagent, slight skin irritant
Potassium dihydrogen phosphate - Univar	Ajax Finechem	4745-500G	analytical reagent, slight skin irritant
Oligoacrylate standard	custom made		See reference for synthetic protocol: Castignolles, P.; Gaborieau, M.; Hilder, E. F.; Sprong, E.; Ferguson, C. J.; Gilbert, R. G. Macromol. Rapid Commun. 2006, 27, 42-46
Boric acid	BDH AnalR, Merck Pty Ltd	10058	Corrosive
Hydrochloric acid - Unilab	Ajax Finechem	A1367-2.5L	laboratory reagent, corrosivie
Fused silica tubing	Polymicro (Molex)	TSP050375	Flexible fused silica capillary tubing with standard polyimide coating, 50 µm internal diameter, 363 µm outer diameter
Agilent 7100 CE	Agilent Technologies	G7100CE	Capillary electrophoresis instrument
Orbital shaker	IKA	KS260
Electronic balance	Mettler Toledo	MS204S
Milli-Q Synthesis	Millipore	ZMQS5VF01	Ultrapure water filtration system
Parafilm	Labtek	PM966	Parrafin wax