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摘要

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

摘要

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

引言

在近几十年中，成像技术已经彻底改变，医生诊断和监测疾病的方法。这些成像技术，然而，已经在很大程度上仅限于全身成像系统，例如正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层摄影（SPECT），计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）。特别注意了癌症，而技术突破成像有很大的提高，这种病诊断和治疗的方式。尽管有这些进展，但是一个地方，这些成像技术只是不适合:手术室。虽然全身成像技术可在手术计划帮助下，他们通常缺乏空间分辨率足够高，以帮助医生实时确定是否所有的肿瘤组织已被删除或残留的肿瘤组织仍然在手术切缘1隐藏。确保无浸润肿瘤边缘被留下是最重要的手术目标之一，和外科医生必须走严格而谨慎的组织切除之间的紧绳子。如果太多被去除，不需要的副作用对患者正在加剧;如果太少被删除，复发率增加2，3。因此，划定精确的肿瘤边缘是至关重要的，而且我们相信，化学发光成像术可通过帮助医生形象化恶性组织，否则会没有被发现已建立的技术，以提高肿瘤边缘的识别精度。

目前正在调查其可能的实用程序，术中成像系统的许多影像技术。这些包括β-和γ射线发射探头4，光学荧光5，拉曼光谱6 >，7和切伦科夫发光8,9。迄今为止，然而，没有这些都成为确立为标准的临床工具。光学荧光成像迄今被证明是最有前途的这些技术，因此是最探讨。虽然它已经被证明是对许多应用的有价值的工具，它也不是没有局限性。事实上，它的主要缺点是由固有的自发荧光的生物组织所产生的背景荧光。这样的背景自发荧光信号是周围组织的激励的产物，除了荧光团，通过所需要的荧光信号的产生的外部光源。从实践的角度来看，这自发荧光可以潜在地导致低信号对噪声比，它可以限制在手术室这种技术的效用。

校长优势化学发光成像在荧光成像是没有激发光是必要的。其结果是，没有背景自发荧光。在化学发光成像，代替化学生成的激发能量。这一过程不会产生意外的背景信号，因此可以导致更高的信号 - 噪声比。这可能最终导致手术切缘的更精确和准确的检测。出人意料的是，这种方法作为一种手术成像技术的效用仍然未开发的10。事实上，最近的例子，这种技术是鲁米诺由髓过氧化物酶的小鼠11，12，13的氧化。因此化学发光生物医学成像是研究的一个，而未开发地区，可以具有以下优点:（1）导致与喜低背景信号最小自发荧光gher信号 - 噪声比; （2）化学发光发射范围从可见光到近红外的波长可调波长; （3）官能化的化学发光复合物，当与连接器的技术相结合，有针对性已经存在的生物分子，靶向分子成像探针14的整个库提供接入。

验证的原理该研究说明了化学发光成像在使用基于钌 - 成像剂的生物医学设置的潜在效用。该化合物的化学发光特性很好的研究，以调查可追溯至60年代中期15。经化学活化，所述试剂产生在约600毫微米16的光，这是非常适合用于医疗成像目的。活化能是由导致激发态-其具有650纳秒寿命在水中17 -foll的氧化还原反应提供在此激发态的松弛由光子的产生欠款。通过使用一个特别设计的远程喷雾器的，我们能够检测到化合物既体外 和体内 。最初的实验的结果是非常有前景的，这表明该技术的进一步调查。

研究方案

伦理学声明:以上所描述的，根据经批准的协议，并在纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSK）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的道德准则进行体内动物实验。

1.一雾化装置的构建

  1. 木连接部分A（12.5×2.5×1.8 cm 3）的直立用两个螺丝（4×25 平方毫米）B部分（12.7×10.7×1.8 立方厘米 ）的中心。附上木质部-C（11×2.5×1.8 毫升 ），以利用一个螺钉，使得C部分（11×2.5×1.8 毫升 ）仍可被移动部A（12.5×2.5×1.8 毫升 ）的中间。 见图1。
  2. 钻两个孔通过塑料3盎司微型喷雾器（D）的喷射瓶扳机的下部末端，并按下一个不锈钢棒（10厘米的1/16"钢）（E）通过，以形成两个环，一个在任一触发器的一侧。
  3. 包住喷射瓶用胶带（F）的底部，以防止滑出扎带。附加喷雾瓶使用两个塑料扎带木质部C（11×2.5×1.8 毫升 ）（28厘米）（G）。
  4. 切断011伺服电机（Ⅰ）中，用伺服控制（H）的松散的电缆重新连接。然后，伺服电机连接至用胶带木质部A（12.5×2.5×1.8 毫升 ）的顶部。
  5. 附加铅笔（J）使用回形针（K）伺服电机控制杆。紧密连接的铅笔用塑料盖扭线（L）钢棒循环的最外层部分和安全的用胶带铅笔的末端。
  6. 切断伺服电机控制单元的磁电缆连接器（M），并将其重新连接到扬声器连接线（N）。然后，伺服电机控制部胶带到木质部B（12.7×10.7×1.8 毫升 ）。切断与磁性连接器的W1的电缆在一半和附加一个部分在铜S的松散端调峰电缆（1米）。连接（磁）12拨动开关和P1的电源可用W1电缆和一个9V电池。

2.方法的灵敏度测定

  1. 在1.5毫升离心管中，在260微克（347纳摩尔），52微克（69纳摩尔），26微克（34纳摩尔）金额反渗透水（100微升）准备[茹（联吡啶）3] Cl 2的的解决方案，5微克（6.9纳摩尔），3微克（3.5纳摩尔），520纳克（694皮摩尔），260纳克（347皮摩尔），52纳克（69皮摩尔），26纳克（34皮摩尔），5毫微克（6.9皮摩尔）和3纳克（3.5皮摩尔）。
  2. 混合100μL的每个的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的溶液与100微升硝酸铵铈的水溶液（（NH 4）2的Ce（NO 3）6）在显微镜载玻片上的水（25毫摩尔）。
  3. 通过初始化成像软件建立在生物发光读者收购。
    1. 登录到用户配置文件，并寻找阿奎习得的控制面板。点击"初始化"，等到仪器准备。
    2. 寻找"拍摄模式"，并确保"发光"和"照片"被选中，而"荧光"是没有选。
    3. 改变"曝光时间"为"发光"设置为20秒。设置"发光"其余的设置如下:"分档":中等; "F /停止":1;和"排放过滤器":打开。
      注:曝光时间可能需要根据仪器和所用的实验设置，可以适于，如果从呈现的设置不同。
    4. 对于"照片"，请使用以下设置:"接触时间":自动; "分档":中等;和"F /停止":8.对于"视场"下拉菜单成像target.Look调整"主题高度"。初始设置为"C"。 C在更改为"B"（14厘米的距离相机和样品台）。
  4. 通过将显微镜载玻片上黑施工纸张上成像室以保护其免受氧化剂的地板的片材设置的喷雾器。混合100μLdroplet的[茹（联吡啶）3] Cl 2的-solution用100微升的水溶液（NH 4）2铈（NO 3）6.观察绿框十字线。
    1. 放置在黑色施工纸成像对象，使得所感兴趣的区域是在绿色光盒瞄准器的中心显示在样品台上。由木支持卸下塑料喷雾瓶准备喷雾器。补的三乙胺中的溶液（1:3的水/乙醇）成其塑料容器和其重新安装到木支撑。
    2. 将生物发光读取器内部雾化器，确保电源线从电源线雾化器断开。确保电源开关是，拨动开关处于关闭状态，红色LED亮起。放置喷雾器，使得喷射流指向朝向上的成像对象感兴趣的区域，同时尽量减少从摄像机朝向由喷嘴头的成像对象的视图阻塞。
    3. 将在任何潜在的热点黑色小片建筑用纸（如白色的痕迹在显微镜载玻片或注射部位），从喷雾保护他们。地点的至少40厘米的成像室内部的喷雾器遥控线的，使得它不与成像对象，喷雾器，或磁性门闩干扰。关闭成像系统的门。
      注意:十字线将根据"视场"改变大小设置"生活图片;"确保此设置为"B"。
  5. 通过启动成像序列获取图像。点击"获取的"中"采集控制面板"。在第一摄像色曲ENCE，如果需要的话（推荐）使自动保存，并选择一个数据文件夹。忽略"编辑影像标签"对话直到序列的结束。
    注:控制软件显示仪表的行动一步一步的实时性。制备测量和移动所述样本台，以合适的位置之后，它打开相机快门和计数测量时间。活门开启也可以通过由机器产生的咔嗒声听到。
  6. 通过切换切换开关三次，以产生化学发光:在快门打开时，喷三乙胺的溶液的三连发（在水/乙醇3，每喷突发0.24±0.04毫升1）。
    注:样品阶段将在测量过程中移动。留出足够的（最少40厘米）的电缆在仪器内部，让这一点。确保该溶液通过喷雾器喷洒可由上升管被渴望并有在管道中没有气泡。有几个备用BATTERIES为喷雾器准备需要的情况下。

3. 在体内成像全身静脉注射后

  1. 在1.5毫升微量离心管中，制备100微升含有的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的8和33之间纳摩尔磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。制备的水溶液（NH 4）2的Ce（NO 3）中的同时用水（25毫摩尔）6。
  2. 静脉内注射100微升的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中成健康小鼠的尾静脉中（N = 5）。
  3. 通过CO 2窒息注射后安乐死的小鼠10分钟。
    1. 从躯干Y切割取下皮肤，然后取出肋弓的U形，露出心脏和肺部。通过一个24号针头在右心房切割的出口和注入20毫升的PBS到左心室18灌注小鼠。通过腹部经过精心切割皮肤和揭露肾脏和肝脏。纵向切开通过机关创建一个可见的削减。
  4. 如步骤2.3-2.6中所述，做出了以下改变设置的采集。
    1. 彻底冲洗喷雾器塑料储之后，具有的（NH 4）2的Ce（NO 3）6在水代替三乙胺溶液（25毫摩尔）填充。
      注意:要彻底冲洗每次使用后喷嘴雾化器，因为结晶是很重要的（NH 4）2铈（NO 3）6可经过多次使用破坏喷嘴。
  5. 使用整个动物或器官样品进行成像。
    1. 对于全腹成像，定位与开腹面对相机，指着仪器的后脑勺鼠标尸体。居中机关在绿色灯箱十字线成像（ 例如，肝脏或肾脏）。
    2. F或单个器官成像和量化，从成像仪器中取出鼠标和针下来。从已经开体腔开始，切除内部器官（ 例如，肾，肝，肺，肌肉，脾脏，脑，和心脏）。通过后腿皮肤切开切除的肌肉组织。小心打开颅骨用手术刀切除大脑。
      1. 如果感兴趣的器官是肝脏，肾脏，脾，切成两半所有器官纵向，将每个器官的培养皿或一块黑色的建设纸。
    3. 按照步骤2.3-2.6建立单个器官的化学发光示踪剂的相对发射描述的过程。

4.淋巴结体内成像

  1. 制备含有80纳摩尔的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中的一个的PBS溶液10μL。制备的水溶液（NH 4）2的Ce（NO 3）6在华之三（25毫米）在同一时间。
  2. 注入溶液10μL皮下到健康小鼠的后爪（N = 5）。作为阴性对照，注射用纯净的PBS10μL的对侧爪。注射后通过二氧化碳窒息牺牲小鼠15分钟。在两条后腿去除皮肤暴露淋巴管至腘窝淋巴结。
  3. 如步骤3.4所述设置了收购。
  4. 从两个后腿除去腘淋巴结，切断他们在一半，并与氧化剂喷他们上的培养皿，如之前（步骤3.5.3）中描述的，用于定量的目的。

结果

在协议部分1中所述的喷雾器系统可以从易得的材料以低成本来构造。它旨在是用于远程触发的生物发光读卡器内的还原/氧化剂的喷射（ 图1）的插入。我们的设计允许生物发光读者内的喷雾器在从透镜14厘米的距离的安全运行。在操作过程中，观察到透镜的不起雾或模糊。我们选择了市售化学发光剂的[Ru（联吡啶）3] Cl 2中为我们的方法是根据...

讨论

这里，我们已经提出了一种技术，能够通过由化学发光记者创建的光子的发射光学划定组织。相对于其他，更成熟的，技术4，5，6，7，8，9，此化学发光报道系统采用了成像探针是无放射性和在非常高的灵敏度水平便于检测。或许更重要的是，化学...

披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayerBed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
Paper clipOffice Depot221720
speaker cableRCA Inc.AH1650SN
Energizer 9V alkaline batteryEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NameCompanyCatalog NumberComments
28 cm plastic cable tiesGeneral Electric Inc.50725
Duct tape3M Inc.3939
littleBits w1 wirelittleBits Inc.w1 wire
littleBits p1 powerlittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 toggle switchlittleBits Inc.i2 toggle switch
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm plastic covered wire twist tiesFour Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.224758
Ammonium cerium(IV) nitrateSigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoraneBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EthanolSigma-Aldrich2854
TriethylamineSigma-Aldrich Inc.T0886
WaterWater was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) miceJackson Laboratories1929age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence readerCaliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Microscope slidesThermoScientific4951PLUS4

参考文献

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