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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Abstract

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

Introduzione

Negli ultimi decenni, le tecnologie di imaging hanno rivoluzionato il modo in cui i medici a diagnosticare e monitorare la malattia. Queste tecnologie di imaging, tuttavia, sono stati in gran parte limitato a sistemi di imaging di tutto il corpo, come la tomografia ad emissione di positroni (PET), singolo fotone-emissione di tomografia computerizzata (SPECT), tomografia computerizzata (TC) e la risonanza magnetica (MRI). Particolare attenzione è stata dedicata al cancro, e innovazioni tecnologiche di imaging hanno notevolmente migliorato il modo in cui questa malattia è diagnosticata e trattata. Nonostante questi progressi, c'è un posto in cui queste tecnologie di imaging proprio non si adattano: la sala operatoria. Mentre le tecniche di imaging intero corpo può aiutare nella pianificazione chirurgica, che in genere non hanno risoluzioni spaziali alto abbastanza per aiutare i medici a determinare in tempo reale se tutto il tessuto tumorale è stata rimossa o tessuto tumorale residuo rimane nascosto ai margini chirurgici 1. Fare in modo che nessun infiltrativamargini del tumore sono lasciati alle spalle è uno dei più importanti obiettivi chirurgici e chirurghi devono camminare una corda tesa tra il rigoroso e prudente la resezione di tessuto. Se troppo viene rimosso, effetti collaterali indesiderati per il paziente sono aggravate; se troppo poco è stato rimosso, i tassi di recidiva sono aumentati 2, 3. Pertanto, è fondamentale per delineare i margini del tumore accurati, e crediamo che l'imaging chemiluminescenza intraoperatoria può contribuire a migliorare l'accuratezza della identificazione dei margini del tumore, aiutando i chirurghi di visualizzare il tessuto maligno che altrimenti potrebbero rimanere inosservato con tecniche consolidate.

Ci sono molte tecnologie di imaging attualmente sotto inchiesta per il loro possibile utilità come sistemi di imaging intraoperatorie. Questi includono beta- e γ-radiazioni che emettono le sonde 4, la fluorescenza ottica 5, spettroscopia Raman 6 >, 7, e Cherenkov luminescenza 8, 9. Fino ad oggi, tuttavia, nessuno di questi si sono affermati come strumenti clinici standard. fluorescenza ottica ha finora dimostrato di essere il più promettente di queste tecniche ed è quindi la più esplorata. Mentre è già dimostrato di essere un valido strumento per molte applicazioni, non è priva di limiti. In effetti, il suo svantaggio principale è la fluorescenza di fondo generato dal tessuto biologico intrinsecamente autofluorescenti. Questo segnale di fondo autofluorescenti è un prodotto della eccitazione del tessuto circostante, oltre al fluoroforo, dalla sorgente di luce esterna necessaria per la generazione di un segnale fluorescente. Dal punto di vista pratico, questo autofluorescenza può potenzialmente portare a bassi rapporti segnale-rumore, che possono limitare l'utilità di questa tecnologia in sala operatoria.

Il principalevantaggio dell'imaging chemiluminescenza sopra fluorescenza è che la luce di eccitazione è necessaria. Di conseguenza, non vi è alcun fondo autofluorescenza. Nell'imaging chemiluminescenza, l'energia di eccitazione viene invece generato chimicamente. Questo processo produce nessun segnale di fondo non volute e quindi può determinare maggiori rapporto segnale-rumore. Ciò potrebbe concludersi con l'individuazione più precisa ed accurata dei margini chirurgici. Un po 'a sorpresa, l'utilità di questo approccio come una tecnica di imaging intraoperatorio è rimasto inesplorato 10. Infatti, l'esempio più vicino a questa tecnica è l'ossidazione del luminolo da mieloperossidasi nei topi 11, 12, 13. Chemiluminescent di imaging biomedico è quindi una zona piuttosto inesplorato di ricerca che potrebbe offrire i seguenti vantaggi: (1) autofluorescenza minimo con un conseguente basso segnale di fondo con hirapporti Gher segnale-rumore; (2) lunghezze d'onda sintonizzabili di emissioni chemiluminescenti che vanno dal visibile al vicino infrarosso; e (3) functionalizable complessi chemiluminescenza che, quando combinato con le tecnologie linker e biomolecole che già esistono mirati, forniscono l'accesso a intere biblioteche di sonde di imaging molecolare mirati 14.

Questo studio prova di principio illustra la potenziale utilità dell'imaging chemiluminescente nella cornice biomedica utilizzando un agente di imaging a base di rutenio. Le proprietà chemiluminescenti di questo composto sono ben studiati, con indagini risalenti alla metà del 1960 15. All'attivazione chimica, l'agente produce luce a circa 600 nm 16, che è adatto per scopi di imaging medicale. L'energia di attivazione è fornita da una reazione redox che porta ad un eccitato allo stato che ha una durata di 650 ns in acqua 17 -folldovuto dalla generazione di fotoni su rilassamento di questo stato eccitato. Attraverso l'uso di un nebulizzatore remota apposito, siamo stati in grado di rilevare il composto sia ex vivo e in vivo. I risultati degli esperimenti iniziali sono molto promettenti, suggerendo ulteriori indagini di questa tecnologia.

Protocollo

Dichiarazione etica: tutti gli esperimenti su animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e sotto le linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC).

1. Costruzione di un dispositivo di nebulizzazione

  1. Attaccare legno parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) verticalmente al centro di una parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) con due viti (4 x 25 mm 2). Attaccare legno parte C (11 × 2,5 × 1,8 centimetri 3) per mezzo della parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) utilizzando una vite, in modo che parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) possono ancora essere spostati. Vedere la Figura 1.
  2. Due fori attraverso la punta inferiore del grilletto flacone spray di un mini spruzzatore 3 oz plastica (D) e spingere una barra di acciaio inossidabile (10 cm di "acciaio 1/16) (E) fino a formare due anelli, uno su entrambi lato del grilletto.
  3. Avvolgere la parte inferiore della bottiglia spray con nastro adesivo (F) per evitare le fascette di scivolare. Fissare il flacone spray al legno parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) con le due fascette di plastica (28 cm) (G).
  4. Tagliare il motore 011 servo (I) e ricollegare con i cavi sciolti del servocomando (H). Quindi, fissare il servomotore all'inizio legno parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) con nastro adesivo.
  5. Attaccare una matita (J) alla leva servomotore utilizzando la graffetta (K). Strettamente collegare le parti più esterne della matita per gli anelli in tondino d'acciaio che utilizzano fili torsione di plastica coperto (L) e fissare le estremità sulla matita con del nastro adesivo.
  6. Tagliare il connettore del cavo magnetica dell'unità di controllo del servomotore (M) e ricollegare al cavo dell'altoparlante (N). Poi, il nastro l'unità di controllo del servomotore al legno parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Tagliare un cavo W1 con connettori magnetici a metà e collegare una parte per l'estremità libera del rame sCavo peaker (1 m). Collegare l'interruttore a levetta (magnetico) i2 e potenza P1 al cavo W1 a disposizione e una batteria da 9V.

2. Sensibilità determinazione del metodo

  1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5, preparare le soluzioni di [Ru (bpy) 3] Cl 2 in acqua ad osmosi inversa (100 l) in quantità di 260 mg (347 nmol), 52 mg (69 nmol), 26 mg (34 nmol) , 5 mcg (6.9 nmol), 3 mg (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), e 3 ng (3,5 pmol).
  2. Miscelare 100 ml di ciascuna [Ru (bpy) 3] Cl 2 soluzione con 100 ml di una soluzione acquosa di nitrato di ammonio di cerio ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) in acqua (25 mM) su un vetrino da microscopio.
  3. Impostare l'acquisizione nel lettore bioluminescenza per l'inizializzazione del software di imaging.
    1. Accedi al profilo utente e cercare l'acquipannello di controllo sizione. Clicca su "inizializzare" e attendere che lo strumento è pronto.
    2. Cercare "Modalità Imaging" e assicurarsi che "luminescenti" e "fotografia" sono controllati e che "Fluorescent" è incontrollato.
    3. Change "Tempo di esposizione" impostazione "luminescente" per 20 s. Impostare le altre impostazioni per "luminescente" come segue: "categorizzazione": media; "F / stop": 1; e "filtro per le emissioni": Open.
      NOTA: I tempi di esposizione potrebbero aver bisogno di essere adattato a seconda della strumentazione e l'impostazione sperimentale utilizzato, se diverso dal setup presentato.
    4. Per "Photograph", utilizzare le seguenti impostazioni: "Il tempo di esposizione": Auto; "Categorizzazione": media; e "F / stop": 8. Regolare il "Soggetto Altezza", secondo l'imaging target.Look per il menu a discesa "Campo visivo". L'impostazione iniziale è "C." Passare alla "B" (14 cm di distanza tra il camera e fase del campione).
  4. Impostare il nebulizzatore posizionando un vetrino microscopico su un foglio di cartoncino nero sul pavimento della camera di imaging per proteggerlo dalla agente ossidante. Mescolare un 100 μLdroplet di [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution con 100 ml di una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Osservare la scatola mirino verde.
    1. Posizionare imaging soggetto sul cartoncino nero, tale che l'area di interesse è al centro della scatola luminosa verde mirino visualizzato sulla fase del campione. Preparare il nebulizzatore staccando il flacone spray di plastica dal supporto ligneo. Riempire una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo) nel suo serbatoio plastica e ricollegare al supporto in legno.
    2. Posizionare il nebulizzatore all'interno del lettore bioluminescenza e assicurarsi che il cavo di alimentazione sia scollegato dal cavo nebulizzatore. Assicurarsi che l'interruttore di alimentazioneè attiva, l'interruttore a levetta è spento, e il LED rosso è acceso Posizionare il nebulizzatore tale che il flusso di spruzzo è puntato verso la zona di interesse sull'imaging soggetto, minimizzando la vista ostruzione dalla fotocamera a imaging soggetto dalla testa ugello.
    3. Mettere piccoli pezzi neri di cartoncino oltre eventuali punti caldi (ad esempio, macchie bianche su preparati microscopici o siti di iniezione) per proteggerli da spruzzo. Inserire almeno 40 cm di cavo a distanza nebulizzatore all'interno della camera di imaging, tale da non interferire con imaging soggetto, il nebulizzatore, o la serratura della porta magnetica. Chiudere la porta sistema di imaging.
      NOTA: Il mirino cambia dimensioni sulla base del "campo visivo" in "Immagine vivente;" assicurarsi che questo sia impostato su "B".
  5. Acquisire un'immagine avviando la sequenza di imaging. Fai clic su "Acquisire" nel "Pannello di controllo di acquisizione." Al primo Sequ di imagingza, abilitare il salvataggio automatico se lo si desidera (consigliata) e scegliere una cartella di dati. Ignorare la finestra "Edit imaging etichette" fino alla fine della sequenza.
    NOTA: Il software di controllo visualizza le azioni dello strumento passo-passo in tempo reale. Dopo aver preparato la misurazione e spostando la fase del campione nella posizione giusta, apre l'otturatore e conta il tempo di misura. L'apertura dell'otturatore può anche essere ascoltato da un suono click generato dalla macchina.
  6. Come si apre l'otturatore, spruzzare tre esplosioni di una soluzione di trietilammina (1: 3 in acqua / etanolo, 0,24 ± 0,04 ml per spruzzo Burst) commutando l'interruttore a levetta tre volte per generare chemiluminescenza.
    NOTA: La fase del campione si sposta durante la misura. Lasciare sufficiente (almeno 40 cm) cavo all'interno dello strumento per permettere questo. Assicurarsi che la soluzione da spruzzare dal nebulizzatore può essere aspirato dal tubo ascendente e che non vi siano bolle d'aria nel tubo. Avere diverse batterie di riservas per il nebulizzatore pronti in caso necessario.

3. In Vivo Imaging Dopo sistemica dell'iniezione endovenosa

  1. In una provetta da microcentrifuga da 1,5, preparare 100 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente tra l'8 e il 33 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparare una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) allo stesso tempo.
  2. Endovenosa iniettare 100 ml di [Ru (bpy) 3] Cl 2 nella vena della coda di topi sani (n = 5).
  3. Euthanize i topi 10 minuti dopo l'iniezione tramite CO 2 asfissia.
    1. Rimuovere la pelle con una Y-cut dal tronco, quindi rimuovere costale in una forma ad U per esporre il cuore e polmoni. Profumato topi tagliando una presa nell'atrio destro e iniettando 20 ml di PBS attraverso un ago calibro 24 nel ventricolo sinistro 18. tagliare con cura attraverso il ventrepelle e esporre il rene e il fegato. Tagliare longitudinalmente attraverso gli organi di creare un taglio visibile.
  4. Impostare l'acquisizione come descritto nei passaggi 2,3-2,6, con le seguenti modifiche.
    1. Dopo aver lavato accuratamente il serbatoio di plastica nebulizzatore, riempirla con una soluzione di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in acqua (25 mM) invece di trietilammina.
      NOTA: E 'importante lavare a fondo l'ugello nebulizzatore dopo ogni uso, dal momento che cristallizzando (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 può distruggere l'ugello di spruzzo dopo diversi usi.
  5. Utilizzare l'intero campioni di origine animale o di organi per l'imaging.
    1. Per tutta l'imaging dell'addome, posizionare la carcassa mouse con l'addome aperto rivolto verso la telecamera ed il capo rivolto verso la parte posteriore dello strumento. Centrare l'organo di essere ripreso (per esempio, il fegato o renali) nella casella di luce verde mirino.
    2. Fo individuo di immagini di organi e la quantificazione, togliere il mouse dallo strumento di imaging e pin verso il basso. Partendo dalla cavità del corpo già aperto, asportare gli organi interni (ad esempio, reni, fegato, polmoni, muscoli, milza, cervello e cuore). Tagliare la pelle zampa posteriore per asportare il tessuto muscolare. Aprire con cautela il cranio con un bisturi per asportare il cervello.
      1. Se l'organo di interesse è di reni, fegato milza, tagliare tutti gli organi in mezza longitudinalmente, posizionare ogni organo in una capsula di Petri o un pezzo di cartoncino nero.
    3. Seguire la procedura descritta nei passaggi 2,3-2,6 per stabilire l'emissione relativa del tracciante chemiluminescente per singoli organi.

4. imaging in vivo di Linfonodi

  1. Preparare 10 ml di una soluzione di PBS contenente 80 nmol di [Ru (bpy) 3] Cl 2. Preparare una soluzione acquosa di (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) allo stesso tempo.
  2. Iniettare 10 ml della soluzione subdermally nella zampa posteriore di topi sani (n = 5). Come controllo negativo, iniettare la zampa controlaterale con 10 ml di PBS pura. Sacrificare i topi con CO 2 asfissia 15 minuti dopo l'iniezione. Togliere la pelle su entrambe le zampe posteriori per esporre i canali linfatici fino ai linfonodi poplitea.
  3. Impostare l'acquisizione come descritto al punto 3.4.
  4. Rimuovere i linfonodi poplitei da entrambe le gambe posteriori, tagliarli a metà, e spruzzare con ossidante su un piatto Petri, come descritto in precedenza (fase 3.5.3), ai fini della quantificazione.

Risultati

Il sistema nebulizer descritto nella sezione del protocollo 1 può essere costruito a partire da materiali facilmente disponibili a basso costo. Esso è destinato ad essere un inserto per remote trigger spruzzatura dell'agente riducente / ossidante all'interno un lettore bioluminescente (Figura 1). Il nostro design consente il funzionamento sicuro del nebulizzatore all'interno del lettore bioluminescenza a 14 cm di distanza dalla lente. Non sono state osserva...

Discussione

Qui, abbiamo presentato una tecnologia capace di delineare otticamente tessuto tramite l'emissione di fotoni create da un reporter chemiluminescente. A differenza di altri, più stabilito, tecnologie 4, 5, 6, 7, 8, 9, questo sistema reporter chemiluminescenza impiega una sonda immagini che non radioattivo e facilita il r...

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayerBed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
Paper clipOffice Depot221720
speaker cableRCA Inc.AH1650SN
Energizer 9V alkaline batteryEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NameCompanyCatalog NumberComments
28 cm plastic cable tiesGeneral Electric Inc.50725
Duct tape3M Inc.3939
littleBits w1 wirelittleBits Inc.w1 wire
littleBits p1 powerlittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 toggle switchlittleBits Inc.i2 toggle switch
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm plastic covered wire twist tiesFour Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.224758
Ammonium cerium(IV) nitrateSigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoraneBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EthanolSigma-Aldrich2854
TriethylamineSigma-Aldrich Inc.T0886
WaterWater was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) miceJackson Laboratories1929age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence readerCaliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Microscope slidesThermoScientific4951PLUS4

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