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Resumo

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Resumo

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

Introdução

Nas últimas décadas, as tecnologias de imagem têm revolucionado a maneira que os médicos diagnosticar e monitorar a doença. Estas tecnologias de imagem, no entanto, foram em grande parte limitada a sistemas de imagem de corpo inteiro, como a tomografia por emissão de positrões (PET), photon emissão única tomografia computadorizada (SPECT), tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (MRI). Particular atenção tem sido dada ao câncer, e os avanços tecnológicos de imagem melhoraram muito a maneira que esta doença é diagnosticada e tratada. Apesar destes avanços, há um lugar onde essas tecnologias de imagem simplesmente não se encaixam: a sala de cirurgia. Enquanto técnicas de imagem de corpo inteiro pode ajudar no planejamento cirúrgico, que normalmente não têm resoluções espaciais altas o suficiente para ajudar os médicos a determinar em tempo real se todo o tecido do tumor foi removido ou tecido tumoral residual permanece escondido nas margens cirúrgicas 1. Certificar-se de que nenhum infiltrativamargens do tumor são deixados para trás é um dos objetivos cirúrgicos mais importantes, e os cirurgiões devem andar uma corda bamba entre rigorosos e cautelosos ressecção de tecido. Se demasiado for removido, os efeitos colaterais indesejáveis ​​para o paciente são exacerbados; se muito pouco é removido, as taxas de recorrência são aumentados 2, 3. Portanto, é fundamental para delinear as margens tumorais precisos, e acreditamos que a imagem intra-operatória quimioluminescente pode ajudar a melhorar a precisão da identificação de margens do tumor, ajudando cirurgiões a visualizar tecido maligno que poderiam passar despercebido com técnicas estabelecidas.

Existem muitas tecnologias de imagem atualmente sendo investigado por sua possível utilidade como sistemas de imagem intra-operatórias. Estes incluem sondas p- e-γ-radiação que emite 4, fluorescência óptica 5, espectroscopia Raman 6 >, 7 e Cherenkov luminescência 8, 9. Até à data, no entanto, nenhum deles se estabeleceram como ferramentas clínicas padrão. imagem de fluorescência óptica tem até agora provado ser o mais promissor destes técnicas e é portanto a mais explorada. Enquanto que foi já demonstrado ser uma ferramenta valiosa para muitas aplicações, não é sem os seus limites. Na verdade, sua principal desvantagem é a fluorescência de fundo gerado pelo tecido biológico inerentemente autofluorescente. Este sinal de fundo autofluorescente é um produto da excitação do tecido circundante, para além do fluoróforo, pela fonte de luz externa necessária para a geração de um sinal fluorescente. De uma perspectiva prática, este autofluorescência pode potencialmente levar a baixas taxas de sinal-ruído, que podem limitar a utilidade desta tecnologia na sala de cirurgia.

O diretor da escolavantagem de imagiologia quimiluminescência sobre imagens de fluorescência é que nenhuma luz de excitação é necessário. Como resultado, não há autofluorescência fundo. Em imagiologia de quimioluminescência, a energia de excitação é em vez disso gerado quimicamente. Este processo produz nenhum sinal de fundo não intencional e, portanto, pode resultar em rácios mais elevados de sinal-para-ruído. Isto poderia finalmente resultar na detecção mais precisa e exata das margens cirúrgicas. Surpreendentemente, a utilidade desta abordagem como uma técnica de imagem intra-operatória tem permanecido inexplorados 10. Na verdade, o mais próximo de exemplo desta técnica é a oxidação do luminol pela enzima mieloperoxidase em ratinhos 11, 12, 13. imagiologia biomédica quimioluminescente é, portanto, uma área bastante inexplorada da pesquisa que poderia oferecer as seguintes vantagens: (1) autofluorescência mínima resultando em um baixo sinal de fundo com oirácios Gher sinal-ruído; (2) comprimentos de onda sintonizável de emissões quimioluminescentes que vão desde o visível ao infravermelho próximo; e (3) complexos quimioluminescentes functionalizable que, quando combinado com as tecnologias vinculador e biomoléculas que já existem direcionados, dão acesso a bibliotecas inteiras de sondas de imagem molecular alvo 14.

Este estudo de prova de princípio ilustra a utilidade potencial da imagem quimioluminescente na configuração biomédica utilizando um agente de imagiologia à base de ruténio. As propriedades quimiluminescentes deste composto são bem estudadas, com investigações que datam de meados da década de 1960 15. Após a activação química, o agente produz luz em torno de 600 nm, 16, que é bem adequado para fins de imagiologia médica. A energia de activação é fornecida através de uma reacção redox, que conduz a um estado que animado tem uma duração de 650 ns na água 17 -folldevidos pela geração de fótons em cima relaxamento deste estado animado. Através da utilização de um nebulizador remoto especialmente concebido, fomos capazes de detectar o composto tanto ex vivo e in vivo. Os resultados dos experimentos iniciais são muito promissores, sugerindo uma investigação mais aprofundada desta tecnologia.

Protocolo

Declaração de ética: Todos os experimentos in vivo em animais descritos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado e sob as diretrizes éticas do Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Cuidado Institucional Animal e Comitê de Uso (IACUC).

1. Construção de um dispositivo de nebulização

  1. Anexar madeira parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) na vertical no centro da parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) com dois parafusos (4 x 25 mm 2). Anexar madeira parte C (11 × 2,5 × 1,8 centímetros 3) para o meio da parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3), utilizando um parafuso, de tal modo que a parte C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) pode ainda ser movido. Veja a Figura 1.
  2. Broca dois furos através da ponta inferior do gatilho garrafa de pulverização de um mini-pulverizador 3 oz plástico (D) e empurrar uma barra de aço inoxidável (10 cm de "aço 16/1) (E) por meio para formar duas alças, uma em cada lado do gatilho.
  3. Enrole a parte inferior do frasco de spray com fita adesiva (F) para evitar que os laços de cabo de deslizar fora. Fixe o frasco de spray para madeira parte C (11 x 2,5 x 1,8 centímetros 3) usando as duas braçadeiras de plástico (28 cm) (G).
  4. Cortar o motor 011 servo (I) e reconecte-o com os cabos soltos do controle servo (H). Em seguida, conecte o servo motor para o topo da madeira a parte A (12,5 x 2,5 x 1,8 centímetros 3) usando fita adesiva.
  5. Anexar um lápis (J) para a alavanca servo motor usando o clipe de papel (K). Firmemente conectar as partes periféricas da lápis para os loops haste de aço que utilizam fios de torção de plástico coberta (L) e prenda as extremidades do lápis com fita adesiva.
  6. Cortar conector do cabo magnético da unidade de controle do servo motor (M) e recolocá-la ao cabo de altifalante (N). Em seguida, cole a unidade de controle servo motor para a madeira parte B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm3). Cortar um cabo W1 com conectores magnéticos na metade e anexar uma parte para a ponta solta do cobre scabo Peaker (1 m). Ligue o interruptor basculante (magnética) i2 e poder p1 ao cabo W1 disponível e uma bateria de 9V.

2. Sensibilidade Determinação do Método

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar soluções de [Ru (bpy) 3] Cl 2 em água de osmose inversa (100 uL) em quantidades de 260 mg (347 nmol), 52 ug (69 nmol), 26 ug (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 ug (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmoles), 5 ng (6,9 pmol), e 3 ng (3,5 pmol).
  2. Misturar 100 mL de cada [Ru (bpy) 3] Cl 2 solução com 100 mL de uma solução aquosa de nitrato de cério e amónio ((NH4) 2 Ce (NO3) 6) em água (25 mM) numa lâmina de microscópio.
  3. Configurar a aquisição no leitor bioluminescência por inicializar o software de imagem.
    1. Entrar no perfil do usuário e olhar para o acquipainel de controle sição. Clique em "Iniciar" e aguarde até que o instrumento está pronto.
    2. Olhe para o "Modo de imagem" e certifique-se "luminescentes" e "Fotografia" são verificados e que "Fluorescent" está desmarcada.
    3. Change "Tempo de Exposição" configuração para "luminescentes" a 20 s. Defina as configurações restantes para "luminescentes" da seguinte forma: "Binning": Médio; "F / stop": 1; e "filtro de emissão": Open.
      NOTA: Os tempos de exposição pode ter de ser adaptadas de acordo com a instrumentação e configuração experimental utilizado, se for diferente da configuração apresentada.
    4. Para "Photograph", use as seguintes definições: "tempo de exposição": Auto; "Binning": Médio; e "F / stop": 8. Ajuste o "Assunto Altura" de acordo com a imagem latente target.Look para o menu suspenso "campo de visão". A definição inicial é "C." Mudar para "B" (14 cm de distância entre a camera e estágio da amostra).
  4. Defina-se o nebulizador por colocação de uma lâmina de microscópio sobre uma folha de papel de construção preto no chão da câmara de imagem para protegê-lo contra o agente oxidante. Misturar 100 μLdroplet de [Ru (bpy) 3] Cl 2 -solution com 100 mL de uma solução aquosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6. Observar o quadro de mira verde.
    1. Colocar o objecto de imagem no papel de construção preto, de tal modo que a área de interesse está no centro da cruz caixa de luz verde exibido na fase de amostra. Prepare o nebulizador, retirando o frasco de spray de plástico do suporte de madeira. Encha uma solução de trietilamina (1: 3 em água / etanol) em seu reservatório de plástico e recolocá-la para o suporte de madeira.
    2. Coloque o nebulizador no interior do leitor de bioluminescência e certifique-se de que o cabo de alimentação está desconectado do cabo de nebulizador. Certifique-se de que o interruptor de alimentaçãoestá ligado, o interruptor basculante está desligado e o LED vermelho está aceso Colocar o nebulizador de modo a que o fluxo de pulverização é apontada para a área de interesse na imagem objecto, enquanto minimiza a obstrução da vista a partir da câmara em direcção ao objecto de imagem pela cabeça de bico de pulverização.
    3. Coloque pequenos pedaços, preto de papel de construção mais de quaisquer potenciais pontos quentes (por exemplo, marcas brancas em lâminas microscópicas ou locais de injecção), para protegê-los de spray. Coloque pelo menos 40 cm do cabo remoto nebulizador dentro da câmara de imagem, de modo a que não interfira com o objecto de imagem, o nebulizador, ou o fecho da porta magnética. Feche a porta do sistema de imagem.
      NOTA: A mira irá alterar o tamanho com base no "campo de visão" em "Imagem Viver"; certificar-se de que este está definido para "B".
  5. Adquirir uma imagem, iniciando a sequência de imagens. Clique em "Adquirir" no "Painel de Controle Aquisição". No primeiro sequ imagiologiacia, permitir a gravação automática se desejado (recomendado) e escolha uma pasta de dados. Ignore o "Editar etiquetas de imagem" de diálogo até que o fim da sequência.
    NOTA: O software de controle exibe as ações do instrumento passo-a-passo em tempo real. Depois de preparar a medição e movendo-se a fase de amostra para a posição direita, que abre o obturador da câmara e conta o tempo de medição. A abertura do obturador também pode ser ouvido por um som de clique gerado pela máquina.
  6. À medida que o obturador se abre, spray três explosões de uma solução de trietilamina (1: 3 em água / etanol, 0,24 ± 0,04 mL por pulverização) de ruptura pela comutação do interruptor de alavanca de três vezes para gerar quimioluminescência.
    NOTA: O estágio da amostra irá mover durante a medição. Deixe cabo suficiente (mínimo 40 cm) dentro do instrumento para permitir isso. Certifique-se de que a solução a ser pulverizada pelo nebulizador pode ser aspirado pelo tubo ascendente e que não existem bolhas de ar no tubo. Ter vários batterie de reposiçãos para o nebulizador pronto no caso necessário.

3. In vivo de imagens Após Systemic injeção intravenosa

  1. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, preparar 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), contendo entre 8 e 33 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Prepara-se uma solução aquosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 em água (25 mM), ao mesmo tempo.
  2. Injectar por via intravenosa de 100 ul de [Ru (bpy) 3] Cl 2 na veia da cauda de ratinhos saudáveis (n = 5).
  3. Eutanásia dos ratinhos 10 minutos após a injecção através de asfixia com CO 2.
    1. Retire a pele com um Y-cut do torso, em seguida, retire o arco costal em forma de U para expor o coração e os pulmões. Perfundir dos ratinhos por corte de uma tomada no átrio direito e injectando 20 ml de PBS através de uma agulha de calibre 24 para o ventrículo esquerdo 18. Cuidadosamente cortar a barrigapele e expor o rim e fígado. Cortar longitudinalmente através dos órgãos para criar um corte visível.
  4. Defina-se a aquisição tal como descrito nos passos 2,3-2,6, com as seguintes alterações.
    1. Depois de lavar cuidadosamente o reservatório de plástico nebulizador, enchê-lo com uma solução de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 em água (25 mM) em vez de trietilamina.
      NOTA: É importante para enxaguar bem o bico nebulizador após cada utilização, uma vez que a cristalização de (NH4) 2 Ce (NO3) 6, podem destruir o bico de pulverização depois de vários usos.
  5. Use toda a amostras de animais ou de órgãos para a imagem latente.
    1. Para geração de imagens abdômen inteiro, posicione a carcaça do rato com o abdômen aberto virado para a câmera e a cabeça apontando para a parte de trás do instrumento. Centralize o órgão a ser trabalhada (por exemplo, fígado ou rins) na mira caixa de luz verde.
    2. Fou indivíduo imagens de órgãos e quantificação, remova o rato do instrumento de imagem e fixá-lo. A partir da cavidade do corpo já aberto, excisar os órgãos internos (por exemplo, rim, fígado, pulmão, músculo, baço, cérebro e coração). Corte através da pele perna para excisar o tecido muscular. abra cuidadosamente o crânio com um bisturi para extirpar o cérebro.
      1. Se o órgão de interesse é o fígado, rim e baço, cortar todos os órgãos em metade longitudinalmente, coloque cada órgão em uma placa de Petri ou um pedaço de papel de construção preto.
    3. Seguir o processo descrito nas etapas 2,3-2,6 para estabelecer a emissão relativa do marcador quimioluminescente para órgãos individuais.

4. In vivo de imagens de linfonodos

  1. Preparar 10 ml de uma solução de PBS contendo 80 nmol de [Ru (bpy) 3] Cl 2. Prepara-se uma solução aquosa de (NH4) 2 Ce (NO3) 6 em WATer (25 mM), ao mesmo tempo.
  2. Injectam-se 10 ul da solução subcutaneamente na pata traseira de ratinhos saudáveis ​​(n = 5). Como um controlo negativo, injectar a pata contralateral com 10 ul de PBS puro. Sacrifício dos ratinhos através de asfixia com CO 2 15 minutos após a injecção. Remover a pele em ambas as patas traseiras para expor os canais linfáticos-se para os nódulos linfáticos poplíteos.
  3. Defina-se a aquisição tal como descrito na etapa 3.4.
  4. Remover os gânglios linfáticos poplíteos de ambas as patas traseiras, cortá-los ao meio, e pulverizá-los com oxidante em uma placa de Petri, tal como descrito antes (passo 3.5.3), com o objectivo de quantificação.

Resultados

O sistema de nebulizador descrito na secção protocolo 1 pode ser construído a partir de materiais facilmente disponíveis, a um baixo custo. Destina-se a ser uma aposta para remoto disparado pulverização do agente de redução / oxidação dentro de um leitor bioluminescente (Figura 1). Nosso projeto permite a operação segura do nebulizador dentro do leitor bioluminescência em um 14 cm de distância da lente. Não se observou qualquer embaciamento ou desfocagem d...

Discussão

Aqui, nós apresentamos uma tecnologia que é capaz de delinear opticamente tecido através da emissão de fotões criada por um repórter quimioluminescente. Em contraste com a outra, mais estabelecido, as tecnologias de 4, 5, 6, 7, 8, 9, este sistema repórter quimioluminescente emprega uma sonda de imagem que é não-radi...

Divulgações

The authors have nothing to disclose.

Agradecimentos

The authors thank Prof. Jan Grimm and Mr. Travis Shaffer for their helpful discussions and Mr. David Gregory for editing the manuscript. Technical services provided by the MSK Animal Imaging Core Facility, supported in part by NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48, are gratefully acknowledged. The authors thank the NIH (K25 EB016673 and R21 CA191679, T.R. and 4R00CA178205-02, B.M.Z.), the MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), the Tow Foundation (B.C.), and the National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 at Hunter College for B.C. and T.M.S.) for their generous support. The research reported in this publication was supported by funding from the King Abdullah University of Science and Technology.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Wood part A (12.5 × 2.5 × 1.8 cm) Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part B (12.7 × 10.7 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Wood part C (11 × 2.5 × 1.8 cm)Woodcraft131404Cut from a 3/4” x 24” x 30” birch plywood sheet
Screws (4 × 25 mm)Screwfix79939
Harmon Face Values 3 oz mini sprayerBed, Bath and Beyond
stainless steel rod (10 cm of 1/16” steel)Metals Depot Int. Inc.2192
Pencil Classic HBPapermate58592
Paper clipOffice Depot221720
speaker cableRCA Inc.AH1650SN
Energizer 9V alkaline batteryEnergizer Holdings Inc.EN22
Hitech HS-82MG Micro Servo Motor, 3.4 kg/cm output torque @ 6VHitech RCD USA Inc.32082S
NameCompanyCatalog NumberComments
28 cm plastic cable tiesGeneral Electric Inc.50725
Duct tape3M Inc.3939
littleBits w1 wirelittleBits Inc.w1 wire
littleBits p1 powerlittleBits Inc.p1 power
littleBits i2 toggle switchlittleBits Inc.i2 toggle switch
littleBits 011 servolittleBits Inc.011 servo
20 cm plastic covered wire twist tiesFour Star Plastics71TIE8000
Tris(2,2′-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrateSigma-Aldrich Inc.224758
Ammonium cerium(IV) nitrateSigma-Aldrich Inc.22249
IsofluoraneBaxter Healthcare1001936060
PBSSigma-AldrichPBS1
EthanolSigma-Aldrich2854
TriethylamineSigma-Aldrich Inc.T0886
WaterWater was purified using a Milipore Mili-Q (R ≥ 18 MΩ)
Female nude (outbred) miceJackson Laboratories1929age 5 - 6 weeks
Strain C57BL/6J  
NU/J male mice at Jackson Laboratories2019age 6 – 8 weeks
IVIS 200 bioluminescence readerCaliper Live Science
Live Image 4.2 softwarePerkin-Elmer128165
Microscope slidesThermoScientific4951PLUS4

Referências

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