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摘要

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

摘要

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

引言

MS是人类疾病的特点是慢性炎症和这被认为是由针对髓鞘自身免疫应答被驱动的中枢神经系统的神经变性。髓鞘和轴突随时间的流失导致认知和运动功能1逐渐下降。 "实验性自身免疫性脑脊髓炎"是用于针对CNS髓磷脂自身免疫性疾病的动物模型的总称。像人类的MS，EAE特征通常为CNS的免疫细胞浸润，并且在某些情况下，脱髓鞘2。然而，向其中任何给定的EAE模型类似于人的MS部分的程度取决于所使用的种或菌株和在底层的抗髓鞘自身免疫反应的复杂性。

抗髓鞘自身免疫可以通过实验诱导几种方式，但是目前使用的最常见的方法是将免疫小鼠用氨基酸模仿免疫的CD4的短肽 + T细胞表位。这表示以诱导致病响应的最低要求。可能是最常见的这些是从髓鞘少突胶质糖蛋白（MOG 35-55）衍生的21氨基酸肽，它用于以诱导EAE在C57BL / 6小鼠3。然而，对于一些实验目的，希望或甚至必需的具有较大蛋白抗原和确实有一些优点这个过短肽免疫来免疫。第一，因为MHC限制的，短肽通常只有在菌株的一个非常有限的范围内有效，而代表任一整蛋白或特定域较大蛋白抗原可在不同的物种中正常处理以便呈现在多个近交小鼠品系或甚4。第二，较大的蛋白抗原能够诱导结合多种类型的淋巴细胞的抗原识别，更复杂的免疫反应，而不是limitin的15μg抗原识别到CD4 + T细胞。例如，通过其B细胞受体（BCR）的B细胞与整体，而不是处理的蛋白直接相互作用。我们和其他人已经表明由MOG 35-55免疫激活不承认MOG蛋白5 B细胞。由于B细胞最近证明在人MS 6发挥致病作用，即结合B细胞在自身免疫性病理学的EAE模型是越来越重要。

尽管使用较大的蛋白抗原以诱导EAE的优点，仍存在这样的蛋白质的一些可商购的来源。实际上，虽然短肽像MOG 35-55可以非常快速地并以相对低的成本来合成MOG蛋白的商业选择是有限的，成本基本上更购买。然而，存在可用于研究团体产生MOG胞外结构域的几个表达载体（MOG 1-125）本身。 HoweveR，所有我们在文献中已经确定了表达系统是基于至今已换成更高效表达系统7的旧技术。此外，大多数是基于大鼠或人MOG 8。用于在小鼠中自身免疫的一些调查，根据鼠标MOG自身抗原的抗原是优选的。最后，商业或作为表达载体，我们已经确定了所有基于MOG蛋白，是含有额外的氨基酸的MOG 1-125基的融合蛋白。这些措施包括净化，通常其他序列标签为好，这有很多的功能，我们无法辨认。

为了解决这些局限性，我们产生基于稠合到含有硫氧还蛋白打击MOG蛋白5的已知的不溶性的标记的小鼠MOG胞外结构域的新型融合蛋白。标签序列还包含用于净化和TEV蛋白酶CLE一个序列的6xHisavage站点，允许完全去除所有的标签序列的，如果需要的话。这是我们都知道的，生成纯MOG 1-125蛋白质的唯一方法。为了便于生产大量蛋白质的MOG 1-125序列用于细菌表达密码子优化和MOG 标签融合蛋白插入的pET-32表达系统。在这里，我们详细描述了该协议生产和净化MOG 标记蛋白，而纯MOG-125，使用现有的大多数实验室免疫学非专用设备。

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研究方案

1.蛋白质感应

注意:在以下步骤，BL21 大肠杆菌细菌转化含用于MOG 标签融合蛋白的序列的的pET-32载体（见参考图5和图1）中生长到高密度，然后被诱导表达的MOG 标记蛋白。 图2所示为整体时间表-注意，天都是近似值和备用停机点在协议中注明。如果与纯化的pET-32 MOG 标签载体DNA开始，这将是必要的，以化学它转变成感受态BL21 大肠杆菌杆菌细菌用氨苄青霉素选择，如已经充分描述9。成功的转化可以通过使用标准的商业试剂盒，接着用限制性消化纯化选自细菌DNA中证实酶AGE1和SAC1到琼脂糖凝胶上10产生一个424 bp的条带。

  1. 接种5ml毫升无菌LB培养基（LB）肉汤（0.1毫克氨苄青霉素/毫升）与BL21-MOG 标签甘油中，并在37℃，200rpm下过夜孵育它。
  2. 放置含有500毫升无菌LB肉汤的在37℃培养箱中为第二天制备两个1升锥形烧瓶中。
  3. 加入500微升100毫克/毫升氨苄青霉素的每个从步骤1.2（终浓度0.1mg / ml的氨苄青霉素）含有500毫升的LB烧瓶。从步骤1.1到每个LB肉汤的两个烧瓶的转移将1ml过夜培养物。孵育在37℃和200rpm下5小时或最多为0.6的光密度。
  4. 从烧瓶中的一个取一取1 mL，并转移到一个单独的1.5毫升离心管中。沉淀细胞以16,000 xg离心1分钟，并除去上清液。标记管为T 0（预诱导），然后把细菌沉淀成-20℃冷冻以供将来十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的分析（见第8和图3）。
  5. 加入0.5毫升的1M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷，异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）到每个培养瓶中。孵育烧瓶在37℃，200rpm下进行4小时，然后在室温下以75rpm过夜。

2.收获MOG 标记蛋白

注:在这个阶段，细菌会产生了大量MOG 标记蛋白质。收获MOG 标签 ，细菌首先在曲通X-100缓冲液，随后通过超声处理裂解。 MOG 标签 ，然后从包涵体释放和变性与咪唑和胍，导致在含有MOG 标记蛋白的粗蛋白溶液。

  1. 取一条1毫升一份从过夜培养物中的一个来自步骤1.5，并将其转移到一个1.5ml微量管中。沉淀细胞以16,000 xg离心1分钟，并除去上清液。标签浴缸（E T）O / N（诱导后），然后把细菌沉淀到-20℃的冰箱以备将来SDS-PAGE分析（ 图3）。
  2. 分布均匀的文化之中250毫升瓶高速离心兼容，并保持这些冰从这个角度向前发展。沉淀细菌细胞22,000 xg离心在4℃下15分钟。
  3. 弃去上清液。存储细菌沉淀于-20℃或继续到步骤2.4。
  4. 制备裂解缓冲液（0.1毫克/毫升鸡卵溶菌酶，0.1％的Triton-X（V / V）的磷酸盐缓冲盐水（PBS））加入的Triton X-100的60微升和120微升50毫克/毫升鸡卵溶菌酶储备溶液至60毫升PBS中。
  5. 重悬并在总共30毫升的裂解缓冲液将所有细菌粒料从步骤2.3。转让本卷圆底50ml管中能够进行高速离心。将此管在30℃水浴30分钟。在培养时间，摇管两次以悬浮细胞。
  6. 培养后，在20千赫兹，振幅70％，脉冲管转移到冰和超声处理的溶液3秒，脉关3秒，并且每一轮五个脉冲。声波处理总数六轮的溶液，并使溶液在冰上冷却轮在两者之间。
  7. 离心在4℃下为24,000 xg离心该溶液15分钟。弃上清，重复步骤2.5-2.7一次。存储颗粒在-20℃或继续到步骤2.8。
  8. 准备加入0.8766克的NaCl，0.09456克的Tris-HCl，并且0.01021克咪唑到100毫升烧杯中缓冲液A（500mM的氯化钠，20mM的Tris-盐酸，5mM咪唑，pH值7.9）。加入H 2Ø，直到量达到28毫升然后调节溶液的pH值到7.9。然后，将溶液转移到100ml的量筒和添加H. 2 O直到体积为30毫升
  9. 重悬从步骤2.7将沉淀在30ml缓冲液A和孵育在4℃下该溶液3小时。在这段时间掂量出17.2克盐酸胍的。
  10. 超声处理使用相同的设置在冰上的溶液，作为在步骤2.6。然后17.2克盐酸胍的添加到该溶液中。孵育此在冰上1小时以溶解MOG 标记蛋白。
  11. 离心在4℃下为24,000 xg离心该溶液30分钟。收集上清，上清在4℃保存，直至蛋白纯化。

3.蛋白纯化

注意:在下面的步骤中的MOG 标记蛋白质将通过4轮吸收（通过His标签）和洗脱纯化到充电镍树脂。

  1. 进行以下缓冲区:
    1. 制备缓冲液B（500mM的氯化钠，20mM的Tris-盐酸，5mM咪唑，6M的盐酸胍，pH值7.9）。 5.844克的NaCl，0.6304克的Tris-HCl的，0.0681克咪唑，114.64克胍-HCl添加到500ml烧杯中。然后添加H. 2 O，直到它到达190毫升和将pH调节至7.9。转移溶胶ution到250ml量筒和添加H. 2 O直到体积为200毫升
    2. 制备洗脱缓冲液（500 mM氯化钠，的20mM Tris盐酸，0.5M咪唑，6M的盐酸胍，pH值7.9）。 5.844克的NaCl，0.6304克的Tris-HCl的，6.808克咪唑，114.64克胍-HCl添加到500mL烧杯中。添加H. 2 O，直到它到达190毫升和将pH调节至7.9。转移溶液至250毫升的量筒和添加H. 2 O直到体积为200毫升
    3. 准备带缓冲器（500毫米氯化钠，20毫米的Tris-HCl，100毫米EDTA，pH值7.9）。 5.844克的NaCl，0.6304克的Tris-HCl的加入40ml的500mM的EDTA添加到500mL烧杯中。添加H. 2 O，直到达到190毫升，并调整pH至7.9。转移溶液至250毫升的量筒和添加H. 2 O直到体积为200毫升
    4. 制备电荷缓冲液（0.1M硫酸镍）。添加5.257克硫酸镍，以500毫升的烧杯中，加入H 2Ø，直到达到190毫升（注意，不处理镍硫酸盐通风柜直到硫酸镍之外已被溶解于H 2 O）。一旦硫酸镍溶解，将溶液转移到250ml量筒和添加H. 2 O直至体积达到200毫升
  2. 拆分10毫升镍树脂的两个锥形50ml离心能够超过4500 XG（5毫升每管）承受离心力的管之间。
  3. 充电和平衡镍树脂:
    1. 通过加入40毫升水2 O含有树脂各管洗涤树脂。水平放置管子到一个摇杆，让他们在4℃下搅拌5分钟。一旦完成后，离心管在4500×g离心在4℃下8分钟。
    2. 通过移液弃去上清液，以避免干扰颗粒。加40毫升电荷退避到每个管中。传送管到一个摇杆，并让他们在4℃下搅拌15分钟。一旦完成后，离心管在4500×g离心在4℃下8分钟。
    3. 弃上清然后加40毫升缓冲液B对管。传送管到一个摇杆，并让他们在4℃下搅拌5分钟。一旦完成后，离心管在4500×g离心8分钟，在4℃，然后丢弃上清液。
  4. 可选:取150微升在步骤2.11中收集的溶解蛋白质的，并将其传输到1.5ml微量离心管中。标记管作为预温育，并在-20℃下以供将来SDS PAGE分析冻结这个（ 图3，粗MOG 标记 ）。
  5. 净化MOG 标记蛋白质:
    1. 转移溶解蛋白质的整个体积从步骤2.11（〜40毫升，减去小样本，在步骤3.4中删除），以从步骤3.3含镍树脂在第一管（ 图2，管1），混合，并水平放置在摇臂在4℃下1小时。
    2. 离心管在4500 XG在4℃，8分钟。一旦完成，将上清转移到第二镍树脂的管（ 图2，管2）和在先前步骤中所述孵育。在此期间，继续执行步骤3到6以下与管1。
    3. 悬浮在管1的镍树脂在40ml洗脱缓冲液和管水平地放置在摇臂4℃5分钟。然后，离心反应管以4,500 xg离心在4℃下8分钟。
    4. 含转移洗脱MOG 标签蛋白的上清液进入标有"纯MOG 标记蛋白"的250毫升一瓶，并保持这瓶在4℃。每次洗脱步骤，集中在这瓶所得上清液。
    5. 添加40毫升条缓冲器的与镍树脂和水平放置在一个摇杆在4℃5分钟。
    6. 离心管在4500 XG在4℃，8分钟。弃去上清液，然后如在步骤3.3中列出充电镍树脂。
    7. 一旦完成后，前进与第二管按步骤3.5中列出。一共有4轮溶解蛋白质的吸收期从步骤2.11到充电镍树脂和洗脱将回收大部分蛋白质虽然，如果需要的话，另外的蛋白质可以在吸收和洗脱的额外轮次回收。
  6. 一旦四个（或更多）轮的吸收和洗脱完成后，存储所述合并纯化的蛋白质在4℃下过夜。镍树脂可在4℃下直到它被再次需要被存储在40毫升20％的乙醇溶液。

4.测量蛋白质浓度

注意:有必要进一步处理之前，量化在第3节中产生纯化MOG 标记蛋白量，该值将被用于确定最终量的蛋白质集中在协议的结尾。在这里，我们描述了一个标准的Bradford法。纯化MOG 标记蛋白的浓度是通过比较连续dilut的光谱吸光度测定编MOG 标记蛋白在已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）的标准曲线。

  1. 使10倍乙酸盐缓冲液通过在3升烧杯中加入23毫升冰醋酸至8.2克醋酸钠，然后添加1.9升氧化氢以溶解乙酸钠。转移该溶液到2L量筒和添加H. 2 O直至体积达到2 L。然后将其存储在一个2升瓶在室温下。使1毫升1×醋酸缓冲液中加入100微升的10×醋酸缓冲液900微升的H 2 O
  2. 通过加入30微升1×醋酸缓冲液至孔中G2-8和60微升至G9设定为稀释的96孔板中。添加48微升1×醋酸缓冲液至H2和H3。
  3. 设立在G行的BSA标准如下初始连续稀释:添加1X醋酸盐缓冲液216微升和54微升井G1市售的2毫克/毫升BSA标准调匀。从井G1到G2以及210添加微升，调匀，然后添加180微升以及G2的很好G3。加入150μL以及G3很好的G4，调匀，并继续添加30微升至少以后每次很好，直到以及八国集团的这一趋势。 （请参阅相当于稀释因子的列表表1）。
  4. 通过转移10微升以及G1至孔A1，B1和C1，和10μl以及G2的各孔A2，B2，C2中，等建立每种稀释液一式三份样品。使用多道移液器。
  5. 要设置MOG 标签的稀释，从步骤3.6很好H1增加60微升纯化MOG 标记蛋白质。从添加H1井12微升很好H2，调匀，再加入12微升以及H2的很好H3，调匀（这将产生在上半年1倍稀释，稀释1/5在H2和1/25稀释H3） 。
  6. 通过转移阱10微升H1-H3的行D，E和F设置一式三份样品的MOG 标签稀释，如在步骤4.4中描述。
  7. 将混合料2 ml蛋白质测定染料试剂浓缩物用8ml的H 2 O加入200μl该混合物到在排A，B，C，D，E和F的所有预加载的井，用多道移液器，如果有的话。看完蛋白浓度之前在弹出用针井任何气泡。
  8. 内加入染料试剂的10分钟，测量行的A，B，C，D，E和F.所有孔的595nm处吸光度
  9. 使用行A，B和C建立标准曲线，其中1-9位置对应于0.4，0.35，0.3，0.25，0.2，0.15，0.1，0.05，和0毫克/毫升BSA。根据这一曲线，计算使用MOG 标签的稀释最适合的标准曲线MOG 标记蛋白的浓度。通常，将有MOG 标签蛋白的200至250毫克，从1升使用这里描述的协议的细菌培养物。
    注:为了使MOG 1-125从这里着手在协议末尾列出了可选的第7节。否则，继续第5节。

5。透析

注:透析被执行以从含有纯化，变性MOG 标签 ，以允许蛋白质再折叠溶液逐渐除去胍。必须注意在此步骤作为MOG本身是非常不可溶的，并且在这是通过硫氧还蛋白标签的存在改善，但仍容易出现出来的溶液作出。因此，重折叠应逐步进行，并在相对低的MOG 标记浓度。

  1. 开始透析前，稀释用缓冲液B（缓冲液B如在步骤3.1中列出可制成）纯化MOG 标记蛋白，直至浓度为0.5毫克/毫升或更少，基于MOG 标签的第4计算出的数量。
  2. 切约为30厘米SnakeSkin透析管，并通过折叠蛇皮三倍以上的端部和夹紧用止血钳的折叠端固定一端与锁定止血。填充用稀释的蛇皮MOG 标记蛋白然后通过迫使它们从开口端从蛇皮去除气泡（60至90毫升，每管MOG 标记蛋白的之间）。最后，密封件使用第二锁定止血所述管的另一端。
  3. 重复步骤5.2填补透析管的附加部分，直到所有MOG 标记蛋白已转入蛇皮透析管。确保没有任何泄漏。
  4. 通过称出382.12克盐酸胍和加入100毫升10×乙酸盐缓冲液在步骤4.1作出一个2L烧杯使1倍乙酸用4M胍。加0.5升的H 2 O操作烧杯中，并允许胍-HCl溶解。一旦溶解后，将溶液转移到一个1升的量筒和添加H. 2 O直至体积达到1L。重复此配方是要求每个2蛇皮。
  5. 如下进行透析:填一个大水桶（最小10 L）与步骤5.4的4M胍1升1X醋酸盐缓冲液。放上ŧ含O MOG 标签放入桶中透析管，留有余地磁力搅拌棒的2段旋转在底部无人之境。把水桶在4℃的室温在磁力搅拌板并打开一个缓慢的旋转速度（ 即不高，刚够移动液体）:
    注:执行以下步骤，以逐渐减少在缓冲胍的量。搅拌时间给定为最小值，而是可以放置过夜。透析将至少需要3天，但是这可以根据需要延长。定期检查，以确保管道完好无损，并在两端紧。
    1. 让斗坐，搅拌4-5小时。
    2. 1升1×醋酸缓冲液（100毫升10倍乙酸盐缓冲液和900毫升水2 O的）添加到每个桶。
    3. 重复步骤5.5.1和5.5.2中所述桶共4升缓冲液，共3次。
    4. 丢弃一半的缓冲桶中，并用1L 1X醋酸缓冲液再填充（100毫升10X乙酸盐缓冲液和900毫升H 2 O，NO胍），并成立了管和搅拌棒。
    5. 重复步骤5.5.1和5.5.2一次（ 即 ，直到有一个总的在桶4升缓冲液中）。
    6. 最后，替换用4升新鲜的1X乙酸盐缓冲液的桶全部4升容积，让搅拌4-5小时。对于最好的效果，对蛋白质浓度的一天，这个步骤。
    7. 小心地取出复性与MOG 标签透析管，弃去斗缓冲区。

6.集中MOG 标记蛋白

注:在最后的步骤中，重折叠MOG 标签蛋白浓缩至用于存储的工作稀释度。由于MOG 标签是非常不溶性的，它不应该超过5毫克/毫升。此浓度是0.4毫克/毫升MOG 35-55肽，其通常用于诱导EAE小鼠中（混合1近似等摩尔:1与弗氏完全adjuv蚁（CFA））。在浓缩过程中，它是不寻常的蛋白质少量出来的溶液中的白色沉淀物的形式。过度沉淀是一个问题，但是。

  1. 计算最终所需体积达到5毫克/毫升的MOG 标记浓度的基础上，在第4计算的值。
  2. 线用铝箔盘中并覆盖用聚乙二醇（PEG）3350和PEG 8000在1铝箔:1的比例。将PEG 3350掺入这种混合物，因为它可以帮助防止浓缩过程中的蛋白聚集，是一种有效cyropreservative 11。
  3. 把蛇皮管（带内MOG 标签蛋白）在铝箔的顶部和用PEG 8000覆盖让此仰卧在室温和定期检查音量直到体积等于或低于估计最终体积（在步骤计算6.1），实际量将在下一步骤进行测量。如果油锅变得在浓缩过程与水过饱和，设置与铝箔和PEG 3350和PEG 8000新鲜锅。
  4. 洗蛇皮的外侧用H 2 O和使用血清吸管的MOG 标签蛋白质转移到一个独立的玻璃瓶中。保持量的轨道作为蛋白质被转移到确保的体积是正确的。
    1. 如果卷已经降低所估计的最终体积下，直至达到所需的体积添加1倍乙酸盐缓冲液。如果卷是估计的最终体积以上，转移MOG 标签蛋白质放回透析管并继续浓度（步骤6.2-6.3）。
    2. 分发MOG 标记蛋白之间1.5毫升管（0.5毫升，每管），直到需要管在-80℃保存。为了诱导EAE，混合此卷1:1 CFA。
  5. 运行的SDS PAGE凝胶上，以确认使用第1步骤取得的样本中的MOG 标记蛋白的表达。4，2.1，3.4，以及来自步骤6.4的纯化MOG蛋白。

7.生成MOG 1-125从MOG 标签中使用TEV蛋白酶（可选）

注意:此可选步骤从步骤4.如果MOG 1-125没有任何额外的标签序列是必需的，该标记序列可以使用TEV蛋白酶被移除（ 图4）的端部延续。据我们所知，有能够产生纯MOG 1-125的任何其他表达系统。然而，应该指出的是，无硫氧还蛋白标签，MOG 1-125是高度不溶性的和纯化和处理过程中，这可能引起问题，因为这个原因删除标记如果绝对必要的实验的原因。需要几个步骤生成纯MOG 1-125。 MOG 标签第一透析到TEV蛋白酶裂解缓冲。以下用TEV蛋白酶消化，体积减小与后来纯化ST以有助于EPS，然后透析至缓冲液B，然后将含有His标签的标签序列是使用镍树脂除去。最后，蛋白进行定量和纯MOG 1-125浓缩至最终浓度。

  1. 通过加入1.861克EDTA 44.4克亚磷酸三盐酸，和26.5克亚磷酸三到2L烧杯中让1升10×TEV切割缓冲液（500mM的Tris-盐酸，5毫摩尔EDTA）的。添加H. 2 O直至体积达到990毫升然后将pH调节至8以溶解EDTA中。转移溶液至1L的量筒，并使用H 2 O使体积达1升
  2. 从步骤3.6稀释MOG 标记蛋白质到0.5毫克/毫升使用缓冲液B（在步骤3.1中所述的相同的缓冲液中）的基础上，如所描述4.转移120毫升稀释MOG 标记蛋白与蛇皮透析管中部分所计算蛋白质的量步骤5.2至5.3。体积可以按比例放大然而TEV蛋白酶的裂解所有MOG 标记蛋白的所需要的量将分电站微分方程边值问题的。
  3. 按照步骤5.5中列出的透析协议，除非在步骤7.1 10X做出乳沟TEV缓冲器取代10X乙酸盐缓冲液。
  4. 转移MOG 标签 ，现在在TEV切割缓冲液中，以一个新的250ml玻璃瓶和监测透析量的增加。加入1μlβ巯基乙醇，每向瓶中加入每MOG2.85毫升的标记蛋白。 （5毫克/毫升的库存TEV溶液）每50毫克的MOG 标记蛋白的至少添加1毫克TEV蛋白酶的（TEV蛋白酶可以被添加到1:10 TEV:MOG蛋白比），在室温下孵育，避光至少72小时。
    注:在TEV蛋白酶孵育结束时，白色沉淀应在玻璃瓶的底部可以看到。
  5. 蛋白质转移到透析管之前，添加盐酸胍到该溶液，直到蛋白溶解，以防止蛋白质粘附到玻璃瓶沉淀。转移150微升该溶液到1.5ml微量离心管中，并贴上标签管作为"MOG与TEV"。储存在-20℃以备将来SDS-PAGE分析该溶液中。
  6. 传输所有流体从步骤7.5到透析管如步骤5.2至5.3列出。填充一个大斗2升的H 2 O和透析管放入桶中。在4℃下与光搅拌过夜孵育此。这个步骤是重要的，以稀释出胍，以允许快速地发生的蛋白质浓度，并开始从将与蛋白质纯化干扰溶液中除去EDTA。
  7. 浓缩蛋白质在透析管中的步骤列出6.2至6.3（除仅使用PEG 8000），使得该溶液的最终体积是〜40毫升洗用H 2 O透析管并除去任何残留的PEG 8000仍附着到管。这种减少的体积使得能够以适合所有消化蛋白质的入含有镍重新50ml管罪恶，如步骤3.5所述。
  8. 透析消化蛋白质缓冲液B:
    1. 填充一个大水桶，用1L缓冲液B（29.22克氯化钠，3.152克的Tris-HCl，0.3405克咪唑，573.18克盐酸胍的，pH值7.9）。
    2. 放置装有消化蛋白质从步骤7.7在桶与搅拌磁体沿（如在步骤5.5中更详细地描述）的蛇皮。把水桶到4℃冷室上的轰动板设置为慢速搅拌，让蛇皮来透析的5个或更多小时。
    3. 清空桶和另一个1升缓冲液B的补充，并让这个坐在4℃冷室上的轰动板设置为慢速搅拌，让蛇皮来透析的5个或更多小时。
  9. 如在第3节详述，与该解理标签序列将由镍树脂的束缚，留下MOG 1-125在溶液中的重要区别执行MOG 1-125蛋白质的纯化。再次，4轮纯化的将同一卷上进行的，但在这种情况下，目标是提高纯度，而不是恢复尽可能多的蛋白质可能。参见图4。
    1. 制作步骤3.1中列出的蛋白质纯化缓冲区
    2. 充电镍树脂的两个管如在步骤3.3中描述。
    3. 通过在步骤3.5详述的基本不同的是从含标签的镍树脂洗脱液被丢弃的协议净化MOG 1-125（保持150微升，以备将来SDS-PAGE分析1.5 ml离心管洗脱物），而含有MOG 1-125的溶液保留作为最终产品。
  10. 测量1-125 MOG蛋白浓度在第4节:
    1. 如步骤4.2和4.4的描述设置BSA标准曲线稀释。
    2. 如步骤4.5和4.6的说明设置MOG 1-125的稀释液。另外，也可以是有价值的，以产生更大的范围的稀释液（1×，1/2，1/4和1/8，例如）。调整1X乙酸盐缓冲液和MOG 1-125相应的卷。
    3. 如步骤4.7至4.9执行Bradford测定和计算产生的MOG 1-125的数量。预期的收率是约4毫克或更多的蛋白质。
  11. 通过透析通过逐步取消胍复性MOG-125，在第5节。
  12. 浓缩MOG 1-125蛋白质如在部分6的终浓度描述应该2.24毫克/毫升，这是等摩尔至5毫克/毫升MOG 标记 。

8. SDS-PAGE凝胶来确认MOG 标签生产和纯度

从步骤1.4，2.1，3.4取的样品，和6.4通过标准SDS-PAGE分析，确认MOG 标签生产和纯度:注。此步骤要么MOG 标签或MOG 1-125的最后纯化之后进行。

    <利>通过加入1.576克的Tris-HCl的制作2×SDS-PAGE上样缓冲液以2毫升H 2 O和将pH设定为6.8。添加0.4克SDS到的Tris-HCl溶液，然后加入H 2Ø，直到量达到7毫升。
  1. 添加0.2克溴酚蓝至10毫升的 H 2的O再加入1毫升这对在步骤8.1所作的溶液。最后，加2ml甘油以完成2×SDS-PAGE上样缓冲液。当存储该溶液，保持在4℃下并避光长达3个月。
  2. 从步骤1.4和2.1以及来自步骤3.4和6.4在室温下将溶解的MOG 标签蛋白解冻细菌的冷冻等分试样。
  3. 通过加入60微升的每个的蛋白质脱盐柱去除在步骤3.4和6.4中收集的溶液中的盐。净化下列制造商的说明蛋白质。
  4. 添加β巯基乙醇的20微升至1ml，在步骤8.2的溶液。加入40微升这两个BACterial从步骤8.3粒料和60微升至脱盐蛋白质从步骤8.4和孵育这些在95℃下进行10分钟。
  5. 通过称重超过了5克三，28.8克甘氨酸和1g SDS使1×SDS PAGE电泳缓冲液。这些添加到1升烧杯中，加入500毫升H 2 O操作溶解一切。一旦溶解，将溶液转移到一个1升量筒并用H 2 O充满直至体积达到1L。
  6. 设置了12％聚丙烯酰胺凝胶中的凝胶装置然后1倍的SDS-PAGE电泳缓冲液添加到凝胶装置以使得运行缓冲液是刚好在上面的凝胶孔的顶部。吹打50微升缓冲液至孔中每五次的洗涤凝胶的孔中。
  7. 放入10微升蛋白质梯进第一口井，然后从步骤8.5分离井加10微升煮解决方案。运行在115伏凝胶60分钟。
  8. 从该装置中取出凝胶，并转移到一个小容器中。填写CONTA用100ml纯的 H 2的O INER和容器转移到缓慢旋转平台8分钟。 8分钟后，倾倒水，并用H 2 O洗凝胶两次以上
  9. 转储从容器轰2 O和100毫升快速染色试剂添加到该容器中。这让坐在一个缓慢旋转平台上过夜，用铝箔覆盖。
  10. 转储快速染色试剂并加入约100毫升的 H 2 O操作的容器。允许该坐一个旋转平台上为8分钟。转储H 2 O和重复轰2 O洗两次。
  11. 图像使用考马斯蓝染色的成像器的凝胶。寻找一个带围绕31.86 kDa的（MOG 标记蛋白）和63.72 kDa的（MOG 标签二聚体）一个微弱带。

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结果

一旦纯化完成后，收集在步骤1.4，2.1，3.4的样品，并从步骤6.4最终产物应在蛋白凝胶（ 图3A）中运行。 MOG 标签应首先出现当T O / N样品中的31.86 kDa带，但不是T 0，并应在最终纯产物的唯一频带。为了测试MOG 标记蛋白是否已经正确折叠时，MOG 标签蛋白可用于通过FACS标记MOG蛋白特异性B细胞。通过用1标记小鼠淋巴细胞:MOG ...

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讨论

这里，我们已经描述了协议用于生产MOG 标记蛋白以及如何产生来自MOG 标签蛋白质纯MOG 1-125的。这个协议是基于两个标准His标签的蛋白质的纯化方法，以及用于一个较旧的基于MOG蛋白15的产生先前描述的方案。虽然没有在这里描述的，MOG 标签蛋白的主要用途是通过与蛋白质抗原免疫以诱导EAE。描述的EAE是如何在小鼠，这是与MOG 标签蛋白兼容诱导的?...

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披露声明

The authors declare no competing financial interests.

致谢

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labThese bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth millerBioshopLBL407.1
Ampicillinbio basicAB0028Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTGBioshopIPT002.5Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozymeBioshopLYS702.10Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Phosphate buffered salinelife technologies20012-027Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chlorideBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidine-HClSigmaG3272The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
Nickel (II) sulfateBioshopNIC700.500
His bind resinEMD Millipore69670-3Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanolCommercial AlcoholsP016EAANDilute with water as needed.
Glacial acetic acidBioshopACE222.1
Sodium acetate trihydrateBioshopSAA305.500
bovine serum albumin standardbio-rad500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentratebio-rad500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrateFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubingThermoscientific68700
2-mercaptoethanolSigmaM3148-25mlThis reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350BioshopPEG335.1
polyethyleneglycol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plateebioscience44-2404-21
SonicatorFisher scientificFB-120-110
Eon microplate spectrometerBiotek11-120-611This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis softwareBioTek
sodium dodecyl sulphateBioshopSDS001
bromophenol blueBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
Protein desalting columnsThermoscientific89849
GlycineBioshopGLN001
precast 12% polyacrylamide gelbio-rad456-1045
Rapid stain reagentEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
White Light Sample Traybio-rad1708272 Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladderbio-rad1610375

参考文献

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