JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Аннотация

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Введение

МС представляет собой человека заболевание, характеризующееся хроническим воспалением и нейродегенеративные ЦНС, которые, как полагают, будут обусловлены аутоиммунного ответа, направленного в сторону миелина. Потеря миелина и аксонов с течением времени приводит к постепенному снижению когнитивной и двигательной функции 1. "Экспериментальная аутоиммунный энцефаломиелит" является общим термином для животных моделях аутоиммунных заболеваний, направленной на ЦНС миелина. Как человека MS, EAE , как правило , характеризуется иммунной клеточной инфильтрацией ЦНС и, в некоторых случаях, демиелинизация 2. Тем не менее, степень, в которой любая данная модель ЕАЕ напоминает человеческую MS частично зависит от вида или штамма, используемых и по сложности нижележащей анти-миелинового аутоиммунного ответа.

Анти-миелина аутоиммунные может быть экспериментально индуцированных несколькими способами, но наиболее распространенный метод, используемый сегодня для иммунизации мышей с коротким пептидом аминокислот, имитирующих иммунодоминантный CD4 + Т - клеточный эпитоп белка миелина. Это представляет собой минимальное требование, чтобы вызвать патологическую реакцию. Пожалуй, наиболее распространенным из них является пептидным 21 амино- полученный из миелин олигодендроцитов гликопротеин (MOG 35-55), который используется для индукции EAE в C57BL / 6 мышей 3. Тем не менее, для некоторых экспериментальных целей желательно или даже необходимо вакцинировать с более крупными белковых антигенов и в самом деле есть несколько преимуществ этого более короткого иммунизации пептида. Во-первых, из-за ограничения MHC, короткие пептиды, как правило, эффективны лишь в очень ограниченном диапазоне напряжений, в то время как более крупные белковые антигены, представляющие либо весь белок или конкретный домен может быть обработан как правило, для представления в нескольких штаммов инбредных мышей или даже у разных видов 4. Во-вторых, больший белковый антиген, способный индуцировать более сложный иммунный ответ, включающий более типов лимфоцитов в распознавании антигена, а не limitinг распознавание антигена к CD4 + Т - клеток. Например, В-клетки через их B клеточного рецептора (BCR) взаимодействуют непосредственно с целым, а не обработанного белка. Мы и другие показали , что В - клетки активируются MOG 35-55 иммунизации не признают MOG белок 5. Так как В - клетки были недавно продемонстрированы играть патогенную роль в человеческом МС 6, модели EAE , которые включают В - клеток в аутоиммунной патологии приобретают все большее значение.

Несмотря на преимущества использования более крупных белковых антигенов для индукции EAE, остаются несколько коммерчески доступных источников для таких белков. В самом деле, в то время как короткие пептиды , такие как MOG 35-55 , могут быть синтезированы очень быстро и при относительно низкой стоимости, коммерческие варианты белка MOG ограничены , и стоимость значительно больше , чтобы купить. Тем не менее, существует несколько векторов экспрессии , доступных для исследовательских групп для создания MOG внеклеточный домен (MOG 1-125) сами. Howeveг, все системы экспрессии , которые мы определили в литературе, основаны на старых технологиях , которые с тех пор были заменены на более эффективные системы экспрессии 7. Кроме того, большинство из них основаны на крысиной или человеческой MOG 8. Для некоторых исследований аутоиммунные у мышей, антиген на основании мыши MOG аутоантигенов является предпочтительным. И, наконец, все MOG на основе белков , которые мы определили, либо коммерческие или как векторы экспрессии, представляют собой слитые белки , содержащие дополнительные аминокислоты к основанию MOG 1-125. Они включают в себя тег для очистки и, как правило, другие последовательности, а также, многие из которых с функцией мы не смогли определить.

Для устранения этих ограничений, мы получили новый слитый белок на основе мыши MOG внеклеточного домена , слитого с меткой , содержащей тиоредоксин для борьбы с известной нерастворимость MOG белка 5. Последовательность тэгов также содержит последовательность 6xHis для очистки и протеазы TEV НКУсайт Avage, что позволяет полного удаления всех последовательностей тегов, если это необходимо. Это единственный метод , который мы отдаем себе отчет , чтобы генерировать чистый MOG 1-125 белка. Для облегчения производства больших количеств белка, последовательность МОГ 1-125 была оптимизированными в отношении кодонов для экспрессии в бактериях и тег слитый белок МОГ был вставлен в систему экспрессии , пет-32. Здесь мы опишем подробно протокол для получения и очистки MOG тегов белка, и чистый MOG 1-125, используя неспециализированной оборудование , доступное для большинства иммунологических лабораторий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Белок Индукционная

Примечание: В следующих шагах, BL21 Escherichia бактерий палочка трансформирована пет-32 вектор , содержащий последовательность для MOG тег слитого белка (см ссылку 5 и рисунок 1) выращивают до высокой плотности , а затем индуцируют экспрессию метки белка MOG , На рисунке 2 общей шкале времени - обратите внимание , что дни являются ориентировочными и альтернативные точки останова отмечаются в протоколе. Если начиная с очищенной пет-32 MOG тег векторной ДНК, то это будет необходимо химически преобразовать его в компетентные BL21 Е. палочки бактерий с использованием селекции ампициллин, как было хорошо описано 9. Успешное преобразование может быть подтверждена путем очистки ДНК из отобранных бактерий с использованием стандартного коммерческого набора, с последующим расщеплением ферментами рестрикции Age1 и Sac1 производить полосу в 424 п.о. на агарозном геле 10.

  1. Инокулируйте 5 мл стерильного бульона лизогении (LB) бульоне (0,1 мг ампициллина / мл) с BL21-MOG тег раствора в глицерине и инкубировать ее в течение ночи при температуре 37 ° С, 200 оборотов в минуту.
  2. Поместите два 1 колбы L Эрленмейера, содержащих 500 мл стерильного LB бульона в 37 ° C инкубаторе в рамках подготовки к следующему дню.
  3. Добавить 500 мкл 100 мг / мл ампициллина в каждую колбу, содержащую 500 мл БЛ с шагом 1,2 (конечная концентрация 0,1 мг / мл ампициллина). Передача 1 мл ночной культуры, начиная с шага 1.1 к каждой из двух колб LB бульона. Инкубируют при 37 ° С и 200 оборотов в минуту в течение 5 часов или до оптической плотности 0,6.
  4. Принимать одну 1 мл аликвоты от одной из колб и передать его в отдельный 1,5 мл центрифужную пробирку. Гранул клеток при 16000 х г в течение 1 мин и удалить супернатант. Добавьте трубку как T 0 (предварительно индукции) , а затем положить бактериальных гранул в -20 ° C морозильнике для будущего додецилсульфат натрия сульфат электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) анализ (смотри раздел 8 и рисунок 3).
  5. Добавить 0,5 мл 1 М изопропиловый бета-D-1-тиогалактопиранозид, изопропиловый β-D-тиогалактозида (IPTG) в каждую культуральную колбу. Инкубируйте колбах при температуре 37 ° С, 200 оборотов в минуту в течение 4 ч, а затем при комнатной температуре при 75 оборотах в минуту в течение ночи.

2. Заготовка MOG тег белка

Примечание: На этом этапе, бактерии будут произведены в больших количествах MOG тегов белка. Для сбора MOG тег, бактерии сначала лизируют в буфере Triton X-100 с последующей обработкой ультразвуком. МОГ тег затем высвобождается из телец включения и денатурированный с имидазолом и гуанидина, в результате чего в раствор неочищенного белка , содержащего метку белка MOG.

  1. Принимать одну 1 мл аликвоты от одного из ночных культур от стадии 1.5, и передать его в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Гранул клеток при 16000 х г в течение 1 мин и удалить супернатант. Добавьте в ваннуе T O / N (после индукции) , а затем поместить бактериальных гранул в -20 ° C морозильнике для будущего анализа страниц SDS (Рисунок 3).
  2. Распределите культуры равномерно среди 250 мл бутылки, совместимые с высокой скоростью центрифугирования и держать их на льду с этого момента. Гранул бактериальных клеток при 22000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  3. Удалите супернатант. Хранить Бактериальные осадки при -20 ° С или перейти к шагу 2.4.
  4. Готовят буфер для лизиса (0,1 мг / мл из куриных яиц, лизоцим, 0,1% Triton-X (об / об) в фосфатно-солевом буфере (PBS)) путем добавления 60 мкл тритона Х-100 и 120 мкл 50 мг / мл куриного яйца лизоцима Маточный раствор до 60 мл PBS.
  5. Ресуспендируют и объединить все бактериальные окатышей с шага 2.3 в общей сложности 30 мл буфера для лизиса. Передача этого тома круглым дном 50 мл трубки, способной высокоскоростного центрифугирования. Поместите эту трубку в водяной бане при 30 ° С в течение 30 мин. Во время инкубации, трясти трубкудважды ресуспендирования клеток.
  6. После инкубации передать трубку на лед и разрушать ультразвуком раствор при 20 кГц, амплитуда 70%, пульс на 3 сек, пульс от 3 сек, и пять импульсов за раунд. Разрушать ультразвуком решение в течение шести полных раундов, и дайте раствору остыть на льду в промежутках между раундами.
  7. Центрифуга решение при 24000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант и повторите шаги 2.5-2.7 раз. Хранить гранулы при температуре -20 ° С или перейти к шагу 2.8.
  8. Подготовка буфера А (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ имидазола, рН 7,9), добавляя 0.8766 г NaCl, 0.09456 г Трис-HCl, и 0.01021 г имидазола в химический стакан емкостью 100 мл. Добавить H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 28 мл , затем довести рН раствора до 7,9. Затем перенесите раствор до 100 мл мерный цилиндр и добавляют H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 30 мл.
  9. Ресуспендируют осадок из шага 2.7 в 30 мл буфера А и инкубировать этот раствор при температуре 4 ° С в течение 3 часов. В течение этого времениотвешивают 17,2 г гуанидин-HCl.
  10. Разрушать ультразвуком раствора на льду, используя те же параметры, что и в шаге 2.6. Затем добавляют 17,2 г гуанидин-HCl к раствору. Выдержите это на льду в течение 1 ч до солюбилизации белка MOG тегов.
  11. Центрифуга решение при 24000 х г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Собирают супернатант и не хранить супернатант при температуре 4 ° С до очистки белка.

3. Белок Очистка

Примечание: В следующих шагах тег белка MOG будет очищен через 4 раундов поглощения на заряженной никелевого смолы (через Его тэгом) и элюирования.

  1. Сделайте следующие буферы:
    1. Подготовка буфера В (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ имидазола, 6 м гуанидин-HCl, рН 7,9). Добавить 5,844 г NaCl, 0.6304 г Трис-HCl, 0.0681 г имидазола и 114.64 г гуанидин-HCl в химический стакан емкостью 500 мл. Затем добавьте H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл и доведения рН до 7,9. Передача зольдо социологическое загрязнение 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 200 мл.
    2. Подготовка буфера для элюции (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 0,5 М имидазола, 6 М гуанидин-HCl, рН 7,9). Добавить 5,844 г NaCl, 0.6304 г Трис-HCl, 6.808 г имидазола и 114.64 г гуанидин-HCl в 500 мл химический стакан. Добавить H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл и довести рН до 7,9. Перелить раствор в 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 200 мл.
    3. Готовят Strip буфера (500 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl, 100 мМ ЭДТА, рН 7,9). Добавить 5,844 г NaCl, 0.6304 г Трис-HCl, 40 мл 500 мМ ЭДТА до 500 мл химический стакан. Добавить H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл и доведения рН до 7,9. Перелить раствор в 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не составляет 200 мл.
    4. Готовят Charge буфер (0,1 М сульфат никеля). Добавить 5,257 г сульфата никеля в химическом стакане емкостью 500 мл и добавляют H 2 O до тех пор , пока не достигнет 190 мл (осторожно, не обрабатывают никелемСульфат за пределами вытяжкой до сульфата никеля было растворяли в H 2 O). После того , как сульфат никеля растворится, перенесите раствор до 250 мл мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 200 мл.
  2. Разделить 10 мл никелевой смолы между двумя коническими 50 мл центрифужные пробирки, способных выдерживать центробежные силы свыше 4500 мкг (5 мл в каждую пробирку).
  3. Зарядить и уравновешивают никелевого смолы:
    1. Промыть смолу добавлением 40 мл H 2 O в каждую пробирку , содержащую смолу. Прокладывать трубы горизонтально на качалку и пусть перемешивать в течение 5 мин при 4 ° С. После завершения, центрифужные пробирки при 4500 мкг в течение 8 минут при температуре 4 ° С.
    2. Удалите супернатант с помощью пипетки, чтобы не потревожить осадок. Добавьте 40 мл заряда буфера в каждую пробирку. Передача трубок на качалке, и пусть они перемешивать в течение 15 мин при 4 ° С. После завершения, центрифужные пробирки при 4500 мкг в течение 8 минут при температуре 4 ° С.
    3. Удалите супернатант затем добавляют 40 мл буфера В в пробирки. Передача трубок на качалке, и пусть они перемешивать в течение 5 мин при 4 ° С. После завершения, центрифуге трубки при 4500 мкг в течение 8 мин при 4 ° С, затем отбросить супернатанты.
  4. Дополнительно: Возьмите 150 мкл солюбилизированного белка, собранной на этапе 2.11 и перенести его на 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Этикетка трубки в качестве предварительной инкубации и заморозить это при -20 ° С для последующего анализа страниц SDS (Рисунок 3, сырой MOG тег).
  5. Очищают MOG тег белка:
    1. Перенести весь объем солюбилизированного белка из стадии 2,11 (~ 40 мл, минус небольшой образец , удаленный на шаге 3.4) к первой трубке (рисунок 2, труба 1) , содержащий никель смолу с шага 3.3, перемешать и поместить в горизонтальном положении на качалку при 4 ° С в течение 1 часа.
    2. Центрифуга трубки на 4,500 х г в течение 8 мин при температуре 4 ° С. После завершения, передавать супернатант ко второмутрубка (рисунок 2, трубка 2) из никелевого смолы и инкубировать , как описано в предыдущем шаге. В то же время, по-прежнему с шагом от 3 до 6 ниже с трубкой 1.
    3. Ресуспендируют никель смолы в трубе 1 в 40 мл буфера для элюции и поместите трубку в горизонтальном положении на качалке при температуре 4 ° С в течение 5 мин. Затем, отцентрифугировать пробирку при 4500 х г в течение 8 мин при температуре 4 ° С.
    4. Передача супернатант , содержащий белок , элюированный МОГ тег в мл флакон 250 меченого 'очищенный МОГ тег белок "и сохранить эту бутылку при температуре 4 ° С. С каждым шагом элюирования, объединяют полученный супернатант в этой бутылке.
    5. Добавить 40 мл буфера полосы к никелевой смолы и разместить в горизонтальном положении на качалке в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
    6. Центрифуга трубки на 4,500 х г в течение 8 мин при температуре 4 ° С. Удалите супернатант, затем зарядите никель смолы, как указано в пункте 3.3.
    7. После завершения, двигаться вперед со второй трубой, как указано в пункте 3.5. В общей сложности 4 раундаs поглощения солюбилизированного белка из стадии 2,11 на заряженном никелевой смолы и элюирование будет восстановить большую часть белка, хотя, если желательно, дополнительный белок может быть восстановлен в дополнительных раундах поглощения и элюирования.
  6. После того, как четыре (или более) раундов поглощения и элюирования являются полными, хранить и объединял очищенный протеин, при 4 ° С в течение ночи. Никель смола может храниться в 40 мл 20% -ного раствора этанола при температуре 4 ° С до тех пор, пока снова не будет необходимости.

4. Измерение концентрации белка

Примечание: Прежде чем продолжить, необходимо определить количество очищенного белка MOG тега генерируемой в разделе 3. Это значение будет использовано для определения конечного объема до концентрации белка в конце протокола. Мы опишем стандартный Бредфорда здесь. Концентрация очищенного белка MOG тега определяется путем сравнения спектральной поглощательной серийно dilutEd МОГ тег белка со стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина (БСА) в известной концентрации.

  1. Сделать 10x ацетатного буфера путем добавления 23 мл ледяной уксусной кислоты до 8,2 г ацетата натрия в 3 л лабораторный стакан , а затем добавить 1,9 л H 2 O для растворения ацетата натрия. Перенесите этот раствор в 2 л мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 2 L. Затем сохранить его в 2 - литровую бутылку при комнатной температуре. Сделать 1 мл буфера ацетата 1x путем добавления 100 мкл 10х буфера ацетата в 900 мкл H 2 O.
  2. Настройка 96-луночный планшет для разведений путем добавления 30 мкл ацетатного буфера 1х в лунки G2-8 и 60 мкл до G9. Добавить 48 мкл буфера ацетата 1x до H2 и H3.
  3. Настройка начального серийного разведения стандарта БСА в строке G следующим образом: Добавить 216 мкл буфера ацетата 1x и 54 мкл коммерчески доступного 2 мг стандарта / мл БСА в хорошо G1 и тщательно перемешать. Добавить 210 мкл из скважины G1 в лунку G2, тщательно перемешать,а затем добавить 180 мкл скважины G2 хорошо G3. Добавьте 150 мкл скважины G3 до скважины G4, тщательно перемешать, и продолжить эту тенденцию добавления 30 мкл меньше для каждой последующей скважины до скважины G8. (Приведены в таблице 1 для списков эквивалентных коэффициентов разведения).
  4. Настройка трех образцов каждого разведения путем переноса 10 мкл скважины G1 в лунки А1, В1 и С1, а также 10 мкл скважины G2 в лунки A2, B2 и C2, и так далее. Используйте многоканальную пипетку.
  5. Чтобы настроить разведений MOG тега, добавьте 60 мкл очищенного белка MOG тега из шага 3.6 в лунку H1. Добавьте 12 мкл из скважины H1 хорошо H2, тщательно перемешать, а затем добавить 12 мкл скважины H2 хорошо H3, тщательно перемешать (это производит 1x разведение в H1, 1/5 разбавления в H2 и 1/25 разведение в H3) ,
  6. Установка трех образцов для МОГ тегов разведений путем переноса 10 мкл скважин Н1-Н3 по строкам D, E, и F, как описано в пункте 4.4.
  7. Смешайте 2 мл красителя для анализа белковКонцентрат реагента с 8 мл H 2 O. Добавить 200 мкл этой смеси во все лунки с предварительно загруженными в строках А, В, С, D, Е, F и, используя многоканальную пипетку, если таковые имеются. Поп все пузырьки в лунках с помощью иглы, прежде чем читать концентрации белка.
  8. В течение 10 мин после добавления реагента красителя, измерения 595 нм абсорбцию во всех лунках в строках A, B, C, D, E и F.
  9. Используйте Ряды A, B, и C, чтобы установить стандартную кривую, где позиции 1-9 соответствуют 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 и 0 мг / мл БСА. На основе этой кривой, вычислить концентрацию MOG тега белка с помощью разбавления MOG тега , который наилучшим образом соответствует стандартной кривой. Как правило, будет от 200 до 250 мг MOG тега белка из 1 л бактериальной культуры с использованием протокола , описанный здесь.
    Примечание: Для того, чтобы MOG 1-125 перейти отсюда к дополнительному разделу 7 перечисленных в конце протокола. В противном случае перейдите к разделу 5.

5. Диализ

Примечание: диализ выполняется , чтобы постепенно удалить гуанидин из раствора , содержащего очищенный денатурированный MOG тег , чтобы белка в повторно сворачивают. Необходимо соблюдать осторожность во время этого этапа, как сама MOG очень нерастворим, и в то время как в этом улучшается за счет присутствия тиоредоксин тега, он по-прежнему склонен к выпадать из раствора. Таким образом, повторную укладку следует проводить постепенно и при концентрации относительно низкой МОГ тега.

  1. Перед началом диализа, разбавить очищенный MOG тег белок буфером В (буфер B может быть выполнен в виде перечисленных в пункте 3.1) , пока концентрация не составляет 0,5 мг / мл или меньше, в расчете на количество MOG тега , рассчитанного в разделе 4.
  2. Отрежьте около 30 см от змеиной диализной трубки и закрепить один конец с фиксирующим кровоостанавливающего путем складывания конец змеиной кожи в три раза и зажима сложенный конец с кровоостанавливающего. Заполните змеиную разведеннымMOG тег белка (от 60 до 90 мл MOG тега белка на пробирку) , затем удалить пузырьки воздуха из змеиной, заставляя их из открытого конца. И, наконец, уплотнение другой конец трубки с помощью второй блокирующей кровоостанавливающего.
  3. Повторите шаг 5.2 , чтобы заполнить дополнительные секции диализной трубки , пока все теги белка MOG не был переведен в змеиной диализной трубки. Убедитесь в отсутствии утечек.
  4. Сделать 1x ацетат с 4 М гуанидин путем взвешивания 382.12 г гуанидина-HCl и добавлением 100 мл 10х ацетатного буфера, сделанных на шаге 4.1 до 2 л лабораторный стакан. Добавить 0,5 л H 2 O в стакан и дайте гуанидин-HCl для растворения. После растворения, переноса раствора до 1 л мерный цилиндр и добавьте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 1 L. Повторите этот рецепт на каждые 2 snakeskins, которые необходимы.
  5. Выполните диализ следующим образом: заполнить большое ведро (минимум 10 л) с 1 л ацетатного буфера 1x с 4 М гуанидин со стадии 5.4. Поместите до тO 2 секции диализной трубки , содержащей MOG тег в ведро, оставляя место для магнитной мешалки , чтобы спина беспрепятственное в нижней части . Поместите ведро в C комнате 4 ° на магнитной мешалке и включите его к медленной скорости вращения (т.е. не является высокой, достаточно просто переместить жидкость):
    Примечание: Выполните следующие шаги, чтобы постепенно уменьшить количество гуанидина в буфере. раз Размешайте приведены в качестве минимумам, но может быть оставлена ​​на ночь. Диализ займет как минимум 3-х дней, но это может быть продлен, если это необходимо. Регулярно проверяйте, чтобы убедиться, что трубка не повреждена и что концы надежно закрыты.
    1. Пусть ведро сидеть и перемешивать в течение 4-5 ч.
    2. Добавить 1 л 1x ацетатного буфера (100 мл 10х ацетатного буфера и 900 мл H 2 O) для каждого сегмента.
    3. Повторите шаги 5.5.1 и 5.5.2 в общей сложности 3 раза в общей сложности на 4 л буфера в ведро.
    4. Выбросьте половину буфера в ведро и залейте 1 л буферного раствора ацетата 1x (100 мл 10x ацетатного буфера и 900 мл H 2 O, нет гуанидин) и установить трубки и мешалку.
    5. Повторите шаги 5.5.1 и 5.5.2 один раз (то есть до тех пор, пока в общей сложности 4 л буфера в ведро).
    6. И, наконец, заменить весь объем 4 л в ведро с 4 л свежего буфера 1x ацетата и перемешивают примерно в течение 4-5 ч. Для достижения наилучших результатов, сделать этот шаг в день концентрации белка.
    7. Осторожно удалите диализной трубки с ренатурирован MOG тег и выбросить ведро буфер.

6. Сосредоточение MOG тег белка

Примечание: На конечной стадии, отогнутый белок тег МОГ концентрируют до готового раствора для хранения. Как МОГ тег очень нерастворимым, она не должна превышать 5 мг / мл. Эта концентрация составляет приблизительно эквимолярное с 0,4 мг / мл MOG 35-55 пептида, который обычно используется для индукции EAE у мышей (смешанный 1: 1 с полным adjuv Фрейндамуравей (CFA)). В процессе концентрирования это не редкость для небольшого количества белка из раствора в виде белого осадка. Чрезмерное количество осадков является проблемой, однако.

  1. Рассчитывают конечного целевого объема для достижения концентрации МОГ тега 5 мг / мл, на основании значения , рассчитанного в разделе 4.
  2. Линия кастрюлю с алюминиевой фольгой и покрывают алюминиевой фольгой с полиэтиленгликолем (ПЭГ) 3350 и ПЭГ 8000 в соотношении 1: 1. ПЭГ 3350 включена в эту смесь , как это может помочь предотвратить агрегацию белка во время концентрирования и является эффективным cyropreservative 11.
  3. Поместите змеиной трубку (с MOG тегом белка внутри) на верхней части алюминиевой фольги и накрыть ПЭГ 8000. Пусть это постоять при комнатной температуре и проверить объем регулярно до тех пор , пока объем не равен или ниже расчетного конечного объема ( в расчете на этапе 6.1), фактический объем будет измеряться в следующем шаге. Если сковорода становитсяперенасыщен водой в процессе концентрации, установите свежий кастрюлю с алюминиевой фольгой и ПЭГ 3350 и ПЭГ 8000.
  4. Вымойте внешнюю сторону snakeskins с H 2 O и передача белка MOG тег в отдельную стеклянную бутылку с использованием серологических пипетки. Следите объема, как белок передается, чтобы обеспечить объем правильно.
    1. Если объем был уменьшен ниже предполагаемого конечного объема, добавьте 1x ацетатный буфер до тех пор, пока не будет достигнут желаемый объем. Если объем выше расчетного конечного объема, передавать метки белка MOG обратно в диализной трубки и продолжают концентрацию (шаги 6,2-6,3).
    2. Распределить тег белка MOG среди 1,5 мл пробирки (0,5 мл на пробирку), хранить трубы при температуре -80 ° С до тех пор , пока это необходимо. Для того, чтобы побудить EAE, смешать этот объем 1: 1 с CFA.
  5. Запуск PAGE гель SDS для подтверждения экспрессии белка тега MOG с использованием образцов , взятых с шагом 1.4, 2,1, 3,4, и очищенный белок МОГ с шага 6.4.

7. Создание MOG 1-125 из MOG тега Использование TEV протеазой (Необязательно)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг продолжается с конца шага 4. Если MOG 1-125 без каких - либо дополнительных последовательностей тегов требуется, последовательности тегов могут быть удалены с помощью TEV протеазы (рисунок 4). Насколько нам известно, не существует другая система экспрессии , способную генерировать чистую MOG 1-125. Тем не менее, следует отметить , что без тиоредоксин тега, МОГ 1-125 очень плохо растворим , и это может вызвать проблемы в процессе очистки и обработки, и по этой причине удалить тег , если это абсолютно необходимо для экспериментальных причинам. Необходимо выполнить несколько шагов для создания чистого MOG 1-125. MOG тег сначала диализуют в буфере TEV расщепления протеазы. После расщепления с TEV протеазы, объем уменьшается, чтобы помочь с очистки позже улEPS, затем подвергают диализу в буфере В, а затем His-метка, содержащая последовательность тег удаляется с использованием никелевой смолы. И, наконец, белок количественно и чистый МОГ 1-125 концентрируют до конечной концентрации.

  1. Сделать 1 л 10х буфера TEV расщепления (500 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА), добавляя 1.861 г ЭДТА, 44,4 г трис-HCl, и 26,5 г Трис до 2 л лабораторный стакан. Добавить H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 990 мл , затем довести рН до 8 , чтобы растворить EDTA. Переносят раствор в 1 л мерный цилиндр и довести объем до 1 л с помощью H 2 O.
  2. Развести MOG тег белка с шагом 3,6 до 0,5 мг / мл с использованием буфера В ( один и тот же буфер , описанный на шаге 3.1), на основе количества белка , рассчитанного в разделе 4. Перенесите 120 мл разбавленного белка MOG тег в змеиной диализной трубке , как описано с шагом 5.2 до 5.3. Объем может быть расширен , однако количество TEV протеазы требуется , чтобы расщепить все тега белка MOG будет substantial.
  3. Следуйте протоколу диализный указанный на шаге 5.5, за исключением замены буфера 10x ацетата с 10x TEV буфера расщепления, сделанные в шаге 7.1.
  4. Перенести MOG тег, в настоящее время в TEV расщепления буфере, к новой бутылке 250 мл стекла и следить за увеличенного объема от диализа. Добавить 1 мкл бета-меркапто-этанола на каждые 2,85 мл MOG тега белка добавляют к бутылке. Добавить по крайней мере , 1 мг TEV протеазы (маточный раствор ТРВ в дозе 5 мг / мл) на каждые 50 мг MOG тега белка (ТРВ протеазы могут быть добавлены до 1:10 ТРВ: соотношение белка MOG) и инкубировать при комнатной температуре, защищенном от света месте в течение по крайней мере 72 часов.
    Примечание: В конце инкубации протеазы TEV, белые преципитаты следует рассматривать в нижней части стеклянной бутылки.
  5. Перед переносом белка в диализной трубке, добавляют гуанидин-HCl к раствору до тех пор, пока белки растворяются, чтобы предотвратить белок выпадает в осадок от прилипания к стеклянной бутылке. Передача 150 мклэто решение для трубки микроцентрифужных 1,5 мл и маркировать трубку как "MOG с ТРВ". Хранить раствор при -20 ° С для последующего анализа в SDS-PAGE.
  6. Передача всей текучей среды со стадии 7.5 в диализной трубке, как указано в пунктах 5.2 до 5.3. Заполните большое ведро с 2 л H 2 O и поместите диализную трубку в ведро. Выдержите это при 4 ° С с легким перемешиванием в течение ночи. Этот шаг важен для разбавления из гуанидина, чтобы концентрация белка происходить быстро и, чтобы начать удаление ЭДТА из раствора, который будет мешать очистки белков.
  7. Концентрат белка в диализной трубке, как указано в пунктах 6.2 до 6.3 (за исключением того, только используют PEG 8000) так, чтобы конечный объем раствора составляет ~ 40 мл. Промыть диализной трубки с H 2 O и удалить любой остаточный ПЭГ 8000 все еще прикреплены к трубке. Это уменьшение объема позволяет соответствовать всем переваренной белка в 50 мл пробирку, содержащую никель повторноГрех, как описано в пункте 3.5.
  8. Диализировать Протеин переваривается в буфер B:
    1. Заполните большое ведро с 1 л буфера В (29.22 г NaCl, 3,152 г трис-HCl, 0.3405 г имидазола, 573.18 г гуанидина-HCl, рН 7,9).
    2. Поместите snakeskins содержащих переваренный белок с шага 7.7 ​​в ведре вместе с перемешивающим магнитом (как описано более подробно на шаге 5.5). Поместите ведро в 4 ° C холодной комнате на мешалке, установленной на медленный размешать и позволить snakeskins диализировать в течение 5 или более часов.
    3. Опорожнить ведро и залейте его с другим 1 л буфера В и пусть это сидеть в 4 ° C холодном помещении на мешалке, установленной на медленный размешать и позволить snakeskins диализировать в течение 5 или более часов.
  9. Выполните очистку MOG 1-125 белка , как описано в разделе 3, с той существенной разницей , что сколотую последовательности тегов будет связано никелевой смолы, оставляя MOG 1-125 в растворе. Опять же, 4 раундов очистки будетвыполняются на том же самом объеме, но в этом случае цель состоит в том, чтобы улучшить чистоту, вместо того, чтобы восстановить как можно больше белка, насколько это возможно. Смотри рисунок 4.
    1. Сделайте буферы очистки белков, перечисленных в пункте 3.1
    2. Зарядка обе трубки никелевой смолы, как описано на стадии 3.3.
    3. Очищают MOG 1-125 протоколом , детально описанной в шаге 3.5, с существенным исключением , что элюат из никелевой смолы , содержащей тег отбрасывается (держать 150 мкл элюата в 1,5 мл микроцентрифужных трубки для последующего анализа в SDS-PAGE), в то время как раствор , содержащий MOG 1-125 сохраняется в качестве конечного продукта.
  10. Измерить концентрацию MOG 1-125 белка , как описано в разделе 4:
    1. Настройка стандартной кривой разведений БСА, как описано в пунктах 4.2 и 4.4.
    2. Настройте разведений MOG 1-125 , как описано в пунктах 4.5 и 4.6. В качестве альтернативы, он может быть полезным, чтобы создать больший диапазонразведений (1x, 1/2, 1/4, 1/8 и, к примеру). Отрегулируйте объемы 1x ацетатного буфера и MOG 1-125 соответственно.
    3. Выполните Бредфорда , как описано в пунктах 4.7 до 4.9 и вычислить количество MOG 1-125 генерируемой. Ожидаемый выход составляет примерно 4 мг или больше белка.
  11. Рефолдинга MOG 1-125 путем постепенного удаления гуанидина с помощью диализа, как описано в разделе 5.
  12. Концентрат MOG 1-125 белка , как описано в разделе 6. Конечная концентрация должна составлять 2,24 мг / мл, что эквимолярно 5 мг / мл MOG тега.

8. SDS-PAGE гель для подтверждения MOG тегов Производство и чистота

ПРИМЕЧАНИЕ: Пробы , взятые из шагов 1.4, 2.1, 3.4, 6.4 и анализируют с помощью стандартного SDS-PAGE для подтверждения MOG производства тегов и чистоту. Этот шаг должен быть выполнен после окончательной очистки либо MOG тега или MOG 1-125.

  1. Сделайте буфер загрузки 2x SDS-PAGE путем добавления 1,576 г Трис-HCl до 2 мл H 2 O и установить рН до 6,8. Добавить 0,4 г SDS в раствор трис-HCl , а затем добавить H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 7 мл.
  2. Добавьте 0,2 г бромфенола синего до 10 мл H 2 O затем прибавляют 1 мл этого раствора к созданной на шаге 8.1. Наконец, добавьте 2 мл глицерина, чтобы закончить буфер загрузки 2x SDS-PAGE. При хранении этого раствора, хранить при температуре 4 ° C и защитить его от света на срок до 3 месяцев.
  3. Растаяйте замороженные аликвоты бактерий из шагов 1.4 и 2.1, а также солюбилизированного MOG тега белка из шагов 3,4 и 6,4 при комнатной температуре.
  4. Удалить соли из растворов, собранных в пунктах 3.4 и 6.4 путем добавления 60 мкл каждого белка в обессоливания колонн. Очищают белки следующие инструкции производителя.
  5. Добавьте 20 мкл бета-меркапто-этанола к 1 мл раствора сделали в шаге 8.2. Добавьте 40 мкл этого к двум BACриал гранулы со стадии 8,3 и 60 мкл до обессоленной белков со стадии 8.4, и инкубируют их при 95 ° С в течение 10 мин.
  6. Сделать 1x SDS PAGE проточном буфере путем взвешивания 5 г Трис, 28,8 г глицина и 1 г SDS. Добавьте их в 1 л лабораторный стакан и добавьте 500 мл H 2 O , чтобы растворить все. После растворения передать раствор до 1 л мерный цилиндр и залейте H 2 O до тех пор , пока объем не достигнет 1 л
  7. Установить полиакриламидный гель 12% в устройстве гель затем добавить 1x SDS-PAGE проточном буфере в устройстве гель таким образом, что подвижный буфер чуть выше верхней части лунки в геле. Промыть лунки геля с помощью пипетки 50 мкл рабочего буфера в лунки пять раз каждый.
  8. Нагрузка 10 мкл белка трапу в первую лунку и добавляют 10 мкл отваренных растворов с шага 8.5 отдельных лунках. Запустите гель при 115 V в течение 60 мин.
  9. Удалите гель из устройства и передачи его в небольшой контейнер. Заполните ContàIner 100 мл чистого Н 2 О и передать контейнер медленно вращающейся платформе в течение 8 мин. После 8 мин, сбросить воду и мыть гель два раза больше с H 2 O.
  10. Свалка H 2 O из контейнера и добавьте 100 мл реагента быстрого красителя в контейнер. Позвольте этому сидеть на медленно вращающейся платформе в течение ночи, накрыть алюминиевой фольгой.
  11. Свалка быстрого реагента морилки и добавляют примерно 100 мл H 2 O в контейнер. Позвольте этому сидеть на вращающейся платформе в течение 8 мин. Свалка H 2 O и повторить промывку H 2 O дважды.
  12. Изображение гель с использованием тепловизора для Кумасси синего пятна. Ищите полосы вокруг 31,86 кДа (MOG тег белка) и более слабой полосы в 63,72 кДа (MOG тег димеров).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После того , как очистка завершена, образцы , собранные в пунктах 1.4, 2.1, 3.4, и конечный продукт с этапа 6.4 должен быть запущен на геле белка (фиг.3А). MOG тег должен сначала появляются как 31,86 кДа в образце T O / N, но не T 0, и должна быть единственной груп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь мы описали протокол для производства MOG белка тегов и как генерировать чистую MOG 1-125 из белка MOG тега. Этот протокол основан как на стандартных методах His-меткой на основе очистки белков, а также ранее описанного протокола для генерации старше MOG на основе белка 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labThese bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth millerBioshopLBL407.1
Ampicillinbio basicAB0028Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTGBioshopIPT002.5Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozymeBioshopLYS702.10Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Phosphate buffered salinelife technologies20012-027Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chlorideBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidine-HClSigmaG3272The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
Nickel (II) sulfateBioshopNIC700.500
His bind resinEMD Millipore69670-3Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanolCommercial AlcoholsP016EAANDilute with water as needed.
Glacial acetic acidBioshopACE222.1
Sodium acetate trihydrateBioshopSAA305.500
bovine serum albumin standardbio-rad500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentratebio-rad500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrateFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubingThermoscientific68700
2-mercaptoethanolSigmaM3148-25mlThis reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350BioshopPEG335.1
polyethyleneglycol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plateebioscience44-2404-21
SonicatorFisher scientificFB-120-110
Eon microplate spectrometerBiotek11-120-611This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis softwareBioTek
sodium dodecyl sulphateBioshopSDS001
bromophenol blueBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
Protein desalting columnsThermoscientific89849
GlycineBioshopGLN001
precast 12% polyacrylamide gelbio-rad456-1045
Rapid stain reagentEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
White Light Sample Traybio-rad1708272 Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladderbio-rad1610375

Ссылки

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470(2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Immunology116MOG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены