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Resumo

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Resumo

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introdução

A esclerose múltipla é uma doença humana caracterizada pela inflamação crónica e neurodegeneração do SNC, que é pensado para ser impulsionado por uma resposta auto-imune dirigida à mielina. A perda de mielina e axônios ao longo do tempo como resultado a redução gradual da função cognitiva e motora 1. "Encefalomielite autoimune experimental" é um termo genérico para modelos animais de doença auto-imune dirigida para a mielina do SNC. Como MS humanos, a EAE é tipicamente caracterizada pela infiltração de células imunes do sistema nervoso central e, em alguns casos, 2 desmielinização. No entanto, o grau a que um determinado modelo de EAE se assemelha a MS humana, em parte, depende da espécie ou estirpe utilizada e da complexidade da resposta auto-imune anti-mielina subjacente.

auto-imunidade anti-mielina pode ser experimentalmente induzida de várias maneiras, mas o método mais comum utilizado hoje em dia é para imunizar ratinhos com um péptido curto de aminoácidos imitando o CD4 imunodominante + epítopo de célula T de uma proteína de mielina. Isto representa o requisito mínimo para induzir uma resposta patogénica. Talvez o mais comum destes é um péptido de 21 aminoácidos derivado de glicoproteína de mielina de oligodendrócitos (MOG 35-55), que é utilizado para induzir a EAE em ratinhos C57BL / 6 3. No entanto, para alguns fins experimentais é desejável ou mesmo necessário para imunizar com antígenos proteicos maiores e, de fato, existem várias vantagens para este mais de imunização com péptido curto. Em primeiro lugar, devido à restrição de MHC, os péptidos curtos são geralmente eficazes apenas num intervalo muito limitado de estirpes, enquanto antigénios proteicos maiores que representa tanto toda a proteína ou um domínio específico pode ser processada normalmente para a apresentação em múltiplas estirpes de ratinhos consanguíneos ou mesmo em diferentes espécies 4. Em segundo lugar, um antigénio de proteína maior é capaz de induzir uma resposta imune mais complexo que incorpora mais tipos de linfócitos no reconhecimento do antigénio, em vez de limiting reconhecimento do antigénio às células T CD4 +. Por exemplo, as células B através do seu receptor de célula B (BCR) interagir directamente com todo e não processadas proteína. Nós e outros autores mostraram que as células B activadas por MOG 35-55 imunização não reconhecem proteínas MOG 5. Uma vez que as células B foram recentemente demonstrado desempenhar um papel patogénico no MS humano 6, modelos de EAE que incorporam as células B na patologia auto-imune são cada vez mais importante.

Apesar das vantagens da utilização de antigenes de proteínas maiores para induzir a EAE, continuam a existir algumas fontes comercialmente disponíveis para essas proteínas. Com efeito, enquanto que os péptidos curtos como MOG 35-55 pode ser sintetizada muito rapidamente e com um custo relativamente baixo, as opções para a proteína comerciais MOG são limitados e custo substancialmente mais para comprar. No entanto, existem vários vectores de expressão disponíveis para grupos de pesquisa para gerar MOG domínio extracelular (MOG 1-125) próprios. however, todos os sistemas de expressão que identificamos na literatura são baseados em tecnologias mais antigas que já foram substituídos por sistemas de expressão mais eficientes 7. Além disso, a maioria são baseados em rato ou humana MOG 8. Para algumas investigações de auto-imunidade em ratinhos, um antigénio com base no auto-antigénio de rato MOG é preferível. Finalmente, todas as proteínas baseados no MOG que identificámos, quer comerciais ou como vectores de expressão, são proteínas de fusão contendo aminoácidos adicionais para a base de MOG 1-125. Estes incluem um tag para a purificação e, geralmente, outras sequências, bem como, muitos dos quais com uma função não fomos capazes de identificar.

Para resolver estas limitações, geramos uma proteína de fusão romance baseado no mouse MOG domínio extracelular fundido a um tag contendo tioredoxina para combater a insolubilidade conhecida de proteína MOG 5. A sequência de marcador contém ainda uma sequência de 6xHis para a purificação e uma protease TEV CLEAvage local que permite a remoção completa de todas as sequências de marcador, se desejado. Este é o único método que estamos cientes de gerar pura proteína MOG 1-125. Para facilitar a produção de grandes quantidades de proteína, a sequência de MOG 1-125 foi codões optimizados para a expressão bacteriana e a proteína de fusão tag MOG foi inserida no sistema de expressão pET-32. Aqui, descrevemos detalhadamente o protocolo para produzir e purificar proteínas tag MOG, e MOG puro 1-125, usando equipamentos não-especializados disponíveis para a maioria dos laboratórios de imunologia.

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Protocolo

Indução 1. Proteína

NOTA: Nos passos seguintes, as bactérias Escherichia coli BL21 transformada com um vector pET-32 que contém a sequência para a proteína de fusão tag MOG (ver referência 5 e a Figura 1) são cultivadas a elevadas densidades e são então induzidas para expressar a proteína com cauda MOG . Veja a Figura 2 para o cronograma geral - note que dias são pontos de parada aproximados e suplentes são anotados no protocolo. Se começando com ADN de pET-32 MOG vector tag purificada, será necessário transformá-lo em quimicamente competente BL21 E. bactérias coli utilizando selecção de ampicilina, como tem sido bem descrito 9. A transformação bem sucedida pode ser confirmada por meio de purificação de ADN a partir de bactérias seleccionadas usando um kit comercial padrão, seguido por digestão com as enzimas de restrição AGE1 e Sac1 para produzir uma banda de 424 pb num gel de agarose de 10.

  1. inocular 5 ml de caldo estéril Lisogenia Broth (LB) (0,1 mg de ampicilina / ml) com um tag de estoque de glicerol BL21-MOG e incubar durante a noite a 37 ° C, 200 rpm.
  2. Coloque dois frascos de 1 L de Erlenmeyer contendo 500 ml de caldo LB estéril num incubador de 37 ° C em preparação para o próximo dia.
  3. Adicionar 500 uL de 100 mg / ml de ampicilina para cada um dos frascos contendo 500 ml de LB a partir do passo de 1,2 (concentração final de 0,1 mg / ml de ampicilina). Transferir 1 ml da cultura durante a noite a partir do passo 1.1 para cada um dos dois frascos de caldo LB. Incubar a 37 ° C e 200 rpm durante 5 horas ou até uma densidade óptica de 0,6.
  4. Tomar uma alíquota de 1 ml a partir de um dos frascos e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 1,5 ml separado. Agregar as células a 16.000 xg durante 1 min e remover o sobrenadante. Rotular o tubo como T 0 (pré-indução) e depois colocar o pellet bacteriano em um congelador -20 ° C para dodecil de sódio eletroforese em gel de poliacrilamida futuro (SDS-PAGE) análise (ver secção 8 e Figura 3).
  5. Adicionar 0,5 ml de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido, isopropilo β-D-tiogalactósido (IPTG) a cada frasco de cultura. Incubar os frascos a 37 ° C, 200 rpm, durante 4 h, depois à temperatura ambiente durante a noite a 75 rpm.

2. A colheita MOG tag Protein

NOTA: Nesta fase, as bactérias produziram grandes quantidades de proteína tag MOG. Para colher MOG marcação, as bactérias são lisadas num primeiro tampão de Triton X-100 seguido por sonicação. MOG etiqueta é então libertado a partir de corpos de inclusão e com imidazol desnaturado e guanidina, resultando numa solução de proteína em bruto contendo a proteína com cauda MOG.

  1. Tomar uma alíquota de 1 ml de uma das culturas durante a noite a partir do passo 1.5 e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Agregar as células a 16.000 xg durante 1 min e remover o sobrenadante. Rotular o banheirae T O / N (pós-indução), em seguida, colocar o pellet bacteriano em um congelador -20 ° C para futura análise de página SDS (Figura 3).
  2. Distribua as culturas igualmente entre 250 ml garrafas compatíveis com alta centrifugação velocidade e mantê-los no gelo a partir deste ponto em diante. Agregar as células bacterianas em 22.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
  3. Descartar o sobrenadante. Armazenar as pastilhas bacterianas a -20 ° C ou continuar para o passo 2.4.
  4. Preparar tampão de lise (0,1 mg / ml de lisozima de ovo de galinha, 0,1% de Triton-X (v / v) em tampão fosfato salino (PBS)) por adição de 60 ul de Triton X-100 e 120 ul de 50 mg / mL de lisozima de ovo de galinha solução de estoque a 60 ml de PBS.
  5. Ressuspender e combinar todos os peletes bacterianas a partir do passo 2.3 em um total de 30 ml de tampão de lise. Transferir este volume para um tubo ml de fundo redondo de 50 capaz de centrifugação a alta velocidade. Colocar este tubo num banho de água a 30 ° C durante 30 min. Durante o tempo de incubação, agitar o tuboduas vezes para voltar a suspender as células.
  6. Após a incubação, transferir o tubo em gelo e sonicar a solução a 20 kHz, amplitude de 70%, em pulso 3 seg, pulso fora 3 seg, e cinco pulsos por rodada. Sonicar a solução durante seis voltas totais e deixar a solução arrefecer em gelo no meio rodadas.
  7. Centrifugar a solução a 24000 xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e repita os passos 2,5-2,7 uma vez. Armazenar o sedimento a -20 ° C ou continuar para o passo 2.8.
  8. Preparar tampão A (NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20, imidazole 5 mM, pH 7,9) por adição de 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl, e 0,01021 g de imidazol a uma proveta de 100 ml. Adicionar H2O até o volume atinge 28 ml, em seguida ajustar o pH da solução para 7,9. Em seguida, transferir a solução para um 100 ml cilindro graduado e adicionar H 2 O até que o volume é de 30 ml.
  9. Ressuspender o sedimento do passo 2.7 em 30 mL de tampão A e incuba-se esta solução a 4 ° C durante 3 h. Durante este tempopesar 17,2 g de guanidina-HCl.
  10. Sonicate a solução em gelo usando as mesmas configurações como na etapa 2.6. Em seguida, adicionar 17,2 g de guanidina-HCl para a solução. Incubar em gelo durante este 1 hora para solubilizar a proteína com cauda MOG.
  11. Centrifugar a solução a 24000 xg durante 30 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e guardar o sobrenadante a 4 ° C até à purificação de proteínas.

Purificação 3. Proteína

NOTA: Nos passos a seguir a proteína tag MOG será purificado através de 4 rodadas de absorção numa resina de níquel carregada (via o His-tag) e eluição.

  1. Faça as seguintes tampões:
    1. Preparar tampão B (NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20, imidazole 5 mM, guanidina-HCl a 6, pH 7,9). Adicionar 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g de imidazole, e 114,64 g de guanidina-HCl a um copo de 500 ml. Em seguida, adicionar H2O até atingir 190 ml e ajusta-se o pH para 7,9. Transferir o Solbuição para um cilindro graduado de 250 ml e adicionar H2O até que o volume é de 200 ml.
    2. Preparar tampão de eluição (NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20, 0,5 M de imidazol, guanidina-HCl a 6, pH 7,9). Adicionar 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 6,808 g de imidazol, e 114,64 g de guanidina-HCl a um copo de 500 ml. Adicionar H2O até atingir 190 ml e ajusta-se o pH para 7,9. Transferir a solução para um cilindro graduado de 250 ml e adicionar H2O até que o volume é de 200 ml.
    3. Preparar tampão de Lavagem (NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20, EDTA a 100 mM, pH 7,9). Adicionar 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 mL de EDTA 500 mM para um copo de 500 ml. Adicionar H2O até atingir 190 ml e ajusta-se o pH para 7,9. Transferir a solução para um cilindro graduado de 250 ml e adicionar H2O até que o volume é de 200 ml.
    4. Preparar tampão de carga (sulfato de níquel 0,1 M). Adicionar 5,257 g de sulfato de níquel a um copo de 500 ml e adicionar H2O até atingir 190 ml (CUIDADO, não lidar com níquelsulfato de fora de um exaustor de fumos até que o sulfato de níquel foi dissolvida em H2O). Uma vez que o sulfato de níquel foi dissolvida, transferir a solução para uma proveta graduada de 250 ml e adicionar H2O até o volume atinge 200 ml.
  2. Dividir 10 ml de resina de níquel entre dois tubos de 50 ml de centrífuga cónicos capazes de suportar forças centrífugas mais de 4.500 xg (5 mL em cada tubo).
  3. Carregar e equilibrar a resina de níquel:
    1. Lava-se a resina por adição de 40 ml de H2O a cada tubo contendo resina. Coloque os tubos na horizontal em uma cadeira de balanço e deixá-los agitar por 5 min a 4 ° C. Uma vez terminado, centrifugar os tubos a 4500 x g durante 8 min a 4 ° C.
    2. Descartar o sobrenadante por pipetagem para evitar perturbar o sedimento. Adicionar 40 ml de tampão de carga a cada tubo. Transferir os tubos para um balancim e deixá-los agitar durante 15 min a 4 ° C. Uma vez terminado, centrifugar os tubos a 4500 x g durante 8 min a 4 ° C.
    3. Descartar o sobrenadante em seguida, adicionar 40 ml de tampão B para os tubos. Transferir os tubos para um balancim e deixá-los agitar durante 5 min a 4 ° C. Uma vez terminado, centrifugar os tubos a 4500 x g durante 8 min a 4 ° C e depois descartá-se os sobrenadantes.
  4. Opcional: Tome 150 ul da proteína solubilizada recolhidas no passo 2.11 e transferi-lo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rotular o tubo à medida que a pré-incubação e congelar esta a -20 ° C para futura análise de SDS-page (Figura 3, em bruto MOG tag).
  5. Purifica-se a proteína com cauda MOG:
    1. Transferir todo o volume de proteína solubilizada a partir do passo 2.11 (~ 40 ml, menos a pequena amostra removida no passo 3.4) para o primeiro tubo (Figura 2, o tubo 1) contendo resina de níquel a partir do passo 3.3, misturar e colocar na horizontal num agitador a 4 ° C durante 1 h.
    2. Centrifuga-se o tubo a 4.500 xg durante 8 min a 4 ° C. Uma vez terminado, transferir o sobrenadante para o segundotubo (Figura 2, o tubo 2) de resina de níquel e incubar tal como descrito no passo anterior. Enquanto isso, continue com os passos 3 a 6 abaixo com tubo 1.
    3. Ressuspender a resina de níquel no tubo 1 em 40 ml de tampão de eluição e colocar o tubo na horizontal num agitador rotativo a 4 ° C durante 5 min. Em seguida, o tubo de centrifugação a 4500 xg durante 8 min a 4 ° C.
    4. Transferir o sobrenadante contendo proteína com cauda MOG eluído em um frasco de 250 ml rotulados "proteína purificada tag MOG 'e manter o frasco a 4 ° C. Com cada passo de eluição, piscina do sobrenadante resultante nesta garrafa.
    5. Adicionar 40 ml de tampão de tira para a resina de níquel e colocar na horizontal num agitador durante 5 min a 4 ° C.
    6. Centrifuga-se o tubo a 4.500 xg durante 8 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante, em seguida, recarregar a resina de níquel como listado no passo 3.3.
    7. Uma vez terminado, avançar com o segundo tubo, conforme listado na etapa 3.5. Um total de 4 rodadas de absorção da proteína solubilizada a partir do passo 2.11 sobre a resina carregada e níquel de eluição irá recuperar a maior parte da proteína, embora, se desejado, a proteína adicional pode ser recuperado em ciclos adicionais de absorção e eluição.
  6. Depois de quatro (ou mais) ciclos de absorção e eluição estão completas, armazenar a proteína purificada reunidas a 4 ° C durante a noite. resina de níquel pode ser armazenado em 40 ml de uma solução de etanol a 20% a 4 ° C, até que seja necessário novamente.

4. Medição de Concentração de Proteína

NOTA: Antes de prosseguir, é necessário para quantificar a quantidade de proteína com cauda MOG purificada gerado na secção 3. Este valor será usado para determinar o volume final para concentrar a proteína para, no final do protocolo. Nós descrevemos um Bradford ensaio padrão aqui. A concentração de proteína com cauda MOG purificado é determinada por comparação da absorvância espectral da série dilutproteína com cauda Ed MOG com uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA) a uma concentração conhecida.

  1. Adicione 10x tampão de acetato por adição de 23 ml de ácido acético glacial e 8,2 g de acetato de sódio numa proveta de 3 litros e, em seguida, adicionar 1,9 L de H 2 O para dissolver o acetato de sódio. Transferir esta solução para um 2 L cilindro graduado e adicionar H 2 O até que o volume atinge 2 L. Em seguida, armazená-lo em uma garrafa de 2 L à temperatura ambiente. Adicione 1 ml de tampão de acetato de 1x por adição de 100 ul de tampão 10X de etilo e 900 mL de H 2 O.
  2. Defina-se uma placa de 96 poços para as diluições da pela adição de 30 ul de tampão de acetato de 1x a poços G2-8 e 60 ul para G9. Adicionar 48 ul de tampão de acetato de 1x para H2 e H3.
  3. Configure a diluição em série inicial do padrão BSA na fileira G da seguinte forma: Adicionar 216 mL de tampão de acetato de 1x e 54 ul de comercialmente disponível 2 mg standard / ml BSA no G1 bem e misture bem. Adicionar 210 mL de G1 bem ao G2 bem, misture bem,e em seguida, adicione 180 mL de G2 bem ao G3 bem. Adicionar 150 mL de G3 bem ao G4 bem, misture bem, e continuar esta tendência de adicionar 30 ul menos a cada poço subsequente, até G8 também. (Ver Tabela 1 para as listas de factores de diluição equivalentes).
  4. Defina-se amostras em triplicado de cada diluição por transferência de 10 uL de G1 bem para poços A1, B1 e C1, e 10 ul de G2 bem para poços A2, B2 e C2, e assim por diante. Usar uma pipeta de canais múltiplos.
  5. Para configurar diluições de MOG tag, adicionar 60 mL de proteína tag MOG purificado a partir do passo 3.6 a H1 bem. Adicionar 12 mL de H1 poço a poço H2, misture bem, em seguida, adicionar 12 mL de H2 poço a poço H3, misture bem (isto produz uma diluição 1x em H1, 1/5 diluição em H2 e 1/25 de diluição em H3) .
  6. Defina-se amostras em triplicado para as diluições tag MOG transferindo 10 ul de poços H1-H3 para linhas D, E e F, tal como descrito na etapa 4.4.
  7. Misturar 2 ml de corante de ensaio de proteínaconcentrado de reagente com 8 ml de H 2 O. Adicionar 200 ul desta mistura a todas as cavidades pré-carregados em filas A, B, C, D, E, e F, utilizando uma pipeta de canais múltiplos, se disponível. Pop quaisquer bolhas nos poços utilizando uma agulha antes de ler a concentração de proteína.
  8. Dentro de 10 minutos da adição do reagente corante, medir a absorvância 595 nm de todas as cavidades em filas A, B, C, D, E e F.
  9. Utilizar linhas A, B, e C para criar uma curva padrão onde as posições 1-9 correspondem a 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 e 0 mg / ml de BSA. Com base nesta curva, calcular a concentração de proteína tag MOG utilizando a diluição de tag MOG que melhor se adapta a curva padrão. Geralmente, haverá de 200 a 250 mg de proteína com cauda a partir de MOG 1 L de cultura bacteriana utilizando o protocolo aqui descrito.
    NOTA: Para fazer MOG 1-125 proceder daqui para a seção opcional 7 listado no final do protocolo. Caso contrário, continue com a secção 5.

5. Diálise

NOTA: A diálise é realizada para remover gradualmente guanidina a partir da solução purificada contendo, tag MOG desnaturado para permitir que a proteína a renaturar. Deve ser tomado cuidado durante este passo como o próprio MOG é muito insolúvel e, enquanto esta é melhorada pela presença da marca de tioredoxina, é ainda propensa a sair da solução. Portanto, o re-enrolamento deve ser realizada gradualmente e a uma concentração relativamente baixa tag MOG.

  1. Antes de iniciar a diálise, dilui-se a proteína com cauda MOG purificado com tampão B (tampão B pode ser feita como listado no passo 3.1) até que a concentração é de 0,5 mg / ml ou menos, com base na quantidade de MOG tag calculada na Secção 4.
  2. Cortar aproximadamente 30 cm de tubagem de diálise de pele de cobra e garantir uma extremidade com uma pinça hemostática bloqueio por dobragem da extremidade da pele de cobra durante três vezes e de prender a extremidade dobrada com a pinça hemostática. Encha a pele de cobra com diluídoProteína tag MOG (entre 60 a 90 ml de proteína tag MOG por tubo), em seguida, remover as bolhas de ar a partir da pele de cobra, forçando-os para fora da extremidade aberta. Finalmente, selar a outra extremidade do tubo, utilizando um segundo hemostato de fecho.
  3. Repita o passo 5.2 para preencher seções adicionais de tubo de diálise até que todas as proteínas tag MOG foi transferido para tubos de pele de cobra diálise. Certifique-se de que não há vazamentos.
  4. Adicione acetato de 1x com guanidina 4 M de pesagem de 382,12 g de guanidina-HCl e adição de 100 ml de 10x tampão de acetato feitas no passo 4.1 para um copo de 2 litros. Adicionar 0,5 L de H 2 O para o recipiente e permitir que a guanidina-HCl para dissolver. Uma vez dissolvido, transferir a solução para um cilindro graduado de 1 L e adicionar H2O até o volume atinge um L. Repetir esta receita para cada 2 peles de cobra que são necessários.
  5. Executar a diálise como se segue: encher um balde grande (mínimo 10 L) com 1 L de tampão de acetato de 1x com 4 M de guanidina do passo 5.4. Coloque-se to 2 seções de tubo de diálise contendo tag MOG dentro do balde, deixando espaço para uma barra de agitação magnética a girar sem entraves na parte inferior. Coloque o balde em um quarto de 4 ° C numa placa de agitação magnética e ligá-lo a uma taxa de rotação lenta (ou seja, não é alto, apenas o suficiente para mover o fluido):
    NOTA: Execute os seguintes passos para reduzir gradualmente a quantidade de guanidina no buffer. Agitar vezes são dadas como mínimos, mas pode ser deixada durante a noite. Diálise terá um mínimo de 3 dias, mas isso pode ser estendido, se desejar. Verifique regularmente para certificar-se de que a tubulação está intacta e que os fins são bem fechada.
    1. Deixe o balde de sentar-se e agita-se durante 4-5 horas.
    2. Adicionar 1 L de tampão de acetato de 1x (100 ml de 10x tampão de acetato e 900 mL de H 2 O) para cada cubeta.
    3. Repita os passos 5.5.1 e 5.5.2 com um total de 3 vezes para um total de 4 L de tampão no balde.
    4. Descartar metade do tampão no recipiente e voltar a encher com 1 L de tampão de acetato de 1x (100 ml de 10x tampão de acetato e 900 ml de H 2 O, não guanidina) e configurar a barra de tubos e mexa.
    5. Repita os passos 5.5.1 e 5.5.2 uma vez (ou seja, até que haja um total de 4 L de tampão no balde).
    6. Finalmente, substituir todo o volume de 4 L no balde com 4 L de tampão de acetato de 1x fresco e deixou-se agitar durante 4-5 h. Para melhores resultados, realizar esta etapa na data da concentração de proteína.
    7. Retire cuidadosamente o tubo de diálise com tag MOG redobrado e descartar tampão balde.

6. Concentrar tag Protein MOG

NOTA: Para o passo final, redobrada proteína com cauda MOG é concentrada para a diluição de trabalho para o armazenamento. Como MOG marcação é muito insolúvel, não deve exceder os 5 mg / ml. Esta concentração é aproximadamente equimolar com 0,4 mg / ml MOG 35-55 péptido, que é comumente utilizada para induzir a EAE em ratinhos (misturadas 1: 1 com adjuv completo de Freundformiga (CFA)). Durante o processo de concentração, não é incomum para uma pequena quantidade de proteína a sair da solução na forma de precipitado branco. precipitação excessiva é um problema, no entanto.

  1. Calcular o volume final desejado para atingir uma concentração tag MOG de 5 mg / ml, com base no valor calculado na secção 4.
  2. Linha de uma bandeja com uma folha de alumínio e cobrir a folha de alumínio com polietileno glicol (PEG) 3350 e PEG 8000 a uma razão de 1: 1. O PEG 3350 é incorporado esta mistura, pois ele pode ajudar a prevenir a agregação de proteínas durante a concentração e é um eficaz cyropreservative 11.
  3. Colocar o tubo de pele de cobra (com proteína com cauda dentro MOG) na parte superior da folha de alumínio e cobrir com PEG 8000. Que este esteja à temperatura ambiente e verificar o volume regularmente até que o volume é igual ou inferior ao volume final estimada (calculada na etapa 6,1), o volume real será medido no passo seguinte. Se o recipiente se tornasaturado com água durante o processo de concentração, configurar uma nova panela com papel alumínio e PEG 3350 e PEG 8000.
  4. Lavar o exterior das peles de cobra com H 2 O e transferir a proteína com cauda MOG para um frasco de vidro em separado, utilizando uma pipeta serológica. Mantenha o controle de volume como a proteína é transferida para garantir o volume está correto.
    1. Se o volume foi reduzido abaixo do volume final estimado, adicionar tampão de acetato de 1x até que o volume desejado é atingido. Se o volume for superior ao volume final estimado, transferir a proteína com cauda MOG de volta para o tubo de diálise e continuar a concentração (passos de 6,2-6,3).
    2. Distribuir a proteína com cauda MOG entre tubos de 1,5 ml (0,5 ml por tubo), armazenar os tubos a -80 ° C até ser necessário. Para induzir a EAE, misture este volume 1: 1 com CFA.
  5. Executar um gel de SDS-PAGE para confirmar a expressão da proteína com cauda MOG utilizando as amostras colhidas nos passos 1.4, 2.1, 3.4, e a proteína purificada a partir de MOG passo 6.4.

7. Geração de MOG 1-125 da tag MOG Usando TEV Protease (Opcional)

NOTA: Este passo opcional continua a partir do final do passo 4. Se MOG 1-125, sem quaisquer sequências de marcação adicional é necessário, as sequências de etiqueta pode ser removida utilizando protease de TEV (Figura 4). Tanto quanto sabemos, não existe nenhum outro sistema de expressão capaz de gerar pura MOG 1-125. No entanto, deve notar-se que sem a etiqueta de tioredoxina, MOG 1-125 é altamente insolúvel e isto pode causar problemas durante a purificação e manuseamento, e por esta razão remover a etiqueta, se absolutamente necessário por razões experimentais. Vários passos são necessários para gerar pura MOG 1-125. MOG etiqueta é primeiro dialisado contra tampão de clivagem de protease de TEV. Após a digestão com protease de TEV, o volume é reduzido para ajudar com a posterior purificação stEPS, em seguida, dialisada em tampão B, e, em seguida, a sequência de marcador de His-tag contendo resina é removida utilizando níquel. Por fim, a proteína é quantificado e puro MOG 1-125 é concentrada para a concentração final.

  1. Adicione 1 L de 10x tampão de clivagem de TEV (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA), adicionando 1,861 g de EDTA, 44,4 g de Tris-HCl, e 26,5 g de Tris para uma proveta de 2 litros. Adicionar H2O até o volume atinge 990 ml em seguida ajustar o pH a 8 a dissolver-se o EDTA. Transferir a solução para um cilindro graduado de 1 L e trazer o volume até 1 L utilizando H 2 O.
  2. Diluir proteína com cauda a partir da etapa MOG 3,6-0,5 mg / mL utilizando tampão B (o mesmo tampão descrito no passo 3.1), com base na quantidade de proteína calculada na secção 4. Transferir 120 ml de proteína com cauda MOG diluída para tubo de diálise de pele de cobra como descrito nas etapas 5.2 a 5.3. O volume pode ser aumentado no entanto a quantidade de protease de TEV necessária para clivar toda a proteína com cauda MOG será SUBSTÂntial.
  3. Siga o protocolo de diálise listada na etapa 5.5, exceto substituir o buffer 10x de acetato com tampão de clivagem 10x TEV feita no passo 7.1.
  4. Transferir a etiqueta de MOG, agora em tampão de clivagem de TEV, para um novo frasco de vidro de 250 ml e monitorizar o aumento de volume de diálise. Adicionar 1 ml de β-mercapto-etanol por cada proteína com cauda 2,85 ml de MOG adicionado ao frasco. Adicionar pelo menos 1 mg de protease de TEV (TEV solução mãe a 5 mg / ml) por cada 50 mg de proteína com cauda MOG (protease de TEV podem ser adicionados a um 01:10 TEV: proteína MOG) e incubar a temperatura ambiente, protegido da luz durante pelo menos 72 h.
    NOTA: No final da incubação da protease TEV, precipitados brancos devem ser vistas no fundo da garrafa de vidro.
  5. Antes de se transferir a proteína para uma tubagem de diálise, adicionar guanidina-HCI à solução até dissolver as proteínas para evitar a proteína precipita se colem ao frasco de vidro. Transferir 150 ul deesta solução para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e rotular o tubo como "MOG com TEV". Guardar a solução a -20 ° C para análise de SDS-PAGE futuro.
  6. Transferir todo o fluido a partir do passo 7.5 em tubagem de diálise, conforme listado nos passos 5.2 a 5.3. Encher um balde grande com 2 L de H 2 O e colocar o tubo de diálise para dentro do balde. Incubar este a 4 ° C com agitação durante a noite luz. Esta etapa é importante para diluir a guanidina para permitir que a concentração de proteína para ocorrer rapidamente e para iniciar a remoção do EDTA a partir da solução que vai interferir com a purificação de proteínas.
  7. Concentra-se a proteína na tubagem de diálise, como listado em passos 6,2-6,3 (excepto usar somente PEG 8000) de tal modo que o volume final da solução é de ~ 40 ml. Lava-se a tubagem de diálise com H 2 O e remover qualquer PEG 8000 residual ainda ligada ao tubo. Esta redução de volume faz com que seja possível encaixar toda a proteína digerida para um tubo de 50 mL contendo níquel resin, tal como descrito na etapa 3.5.
  8. Dializar a proteína digerido Tampão B:
    1. Encher um balde grande com 1 L de tampão B (29,22 g de NaCl, 3,152 g de Tris-HCl, 0,3405 g de imidazole, 573,18 g de guanidina-HCl, pH 7,9).
    2. Colocar as peles de cobra contendo proteína digerida a partir do passo 7.7 no balde, juntamente com um íman de agitação (tal como descrito em maior detalhe no passo 5.5). Coloque o balde em um 4 ° C câmara fria em uma placa de agitação definido para uma agitação lenta e permitir que as peles de cobra para diálise para 5 ou mais horas.
    3. Esvaziar o balde e encha-o com outro 1 L de tampão B e que este se sentar em C sala fria a 4 ° numa placa de agitação definido para uma agitação lenta e permitir que as peles de cobra para diálise para 5 ou mais horas.
  9. Execute purificação da proteína 1-125 MOG conforme detalhado na seção 3, com a importante diferença de que as sequências marcadoras clivados serão ligados pela resina de níquel, deixando MOG 1-125 em solução. Mais uma vez, 4 rodadas de purificação serárealizada no mesmo volume, mas neste caso o objectivo é o de melhorar a pureza, em vez de recuperar a maior parte da proteína quanto possível. Veja a Figura 4.
    1. Adicione os tampões de purificação de proteínas listadas na etapa 3.1
    2. Carregue ambos os tubos de resina de níquel, tal como descrito na etapa 3.3.
    3. Purifica-se MOG 1-125 pelo protocolo detalhado na etapa 3.5, com a excepção essencial que o eluato da resina de níquel contendo etiqueta é descartada (manter 150 ul do eluído num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para a análise de SDS-PAGE futuro), enquanto a solução contendo MOG 1-125 é retida como o produto final.
  10. Medir a concentração de MOG 1-125 proteína como descrito na Seção 4:
    1. Configure os BSA diluições da curva padrão como descrito nos passos 4.2 e 4.4.
    2. Configurar as diluições de MOG 1-125 como descrito nos passos 4.5 e 4.6. Alternativamente, pode ser valiosa para gerar uma gama maiorde diluições (1x, 1/2, 1/4, e 1/8, por exemplo). Ajustar os volumes de tampão de acetato de 1x e MOG 1-125 conformidade.
    3. Realizar o ensaio de Bradford, tal como descrito nos passos 4,7-4,9 e calcular a quantidade de MOG 1-125 gerado. O rendimento previsto é de aproximadamente 4 mg de proteína ou mais.
  11. Redobre MOG 1-125 pela remoção gradual de guanidina através de diálise, como descrito no capítulo 5.
  12. Concentrar MOG 1-125 proteína como descrito na secção 6. A concentração final deve ser de 2,24 mg / ml, que é equimolar a 5 mg / mL tag MOG.

8. SDS-PAGE Gel para confirmar MOG tag Produção e Pureza

NOTA: As amostras tomadas a partir passos 1.4, 2.1, 3.4 e 6.4 são analisadas por SDS-PAGE padrão para confirmar a produção tag MOG e pureza. Esta etapa deve ser realizada após a purificação final de qualquer tag MOG ou MOG 1-125.

  1. Adicione um tampão de carregamento 2 x SDS-PAGE através da adição de 1,576 g de Tris-HCl a 2 ml de H2O e definir o pH para 6,8. Adicionar 0,4 g de SDS em solução de Tris-HCl e em seguida, adicionar H2O até o volume atinge 7 ml.
  2. Adicionar 0,2 g de azul de bromofenol a 10 ml de H2O, em seguida, adicionar 1 ml deste para a solução preparada no passo 8.1. Finalmente, adicionar 2 ml de glicerol a terminar o tampão de carga de SDS-PAGE 2x. Ao armazenar esta solução, manter a 4 ° C e proteger da luz por até 3 meses.
  3. Descongelar as alíquotas congeladas de bactérias a partir dos passos 1.4 e 2.1, bem como a proteína com cauda MOG solubilizada a partir dos passos 3.4 e 6.4, à temperatura ambiente.
  4. Remover os sais de as soluções recolhidas nas etapas 3.4 e 6.4 por adição de 60 ul de cada um de colunas de dessalinização da proteína. Purifica-se as proteínas com as instruções do fabricante.
  5. Adicionar 20 uL de β-mercapto-etanol a 1 ml da solução preparada no passo 8.2. Adicionar 40 ul desta aos dois bacarteriais pelotas do passo 8.3 e 60 ul para as proteínas dessalinizada a partir do passo 8.4 e incubar estes a 95 ° C durante 10 min.
  6. Adicione tampão de corrida SDS PAGE 1x por pesagem de 5 g de Tris, 28,8 g de glicina, e 1 g de SDS. Adicionar estas para uma proveta de 1 L e adicionar 500 mL de H 2 O para dissolver tudo. Uma vez dissolvido, transferir a solução para um cilindro graduado de 1 L e encher-se com H2O até ao volume de 1 L. atinge
  7. Defina-se um gel de poliacrilamida a 12% num aparelho de gel, em seguida adicionar o tampão de corrida SDS-PAGE 1x para o aparelho de gel de tal modo que o tampão de corrida é um pouco acima do topo dos poços no gel. Lavar os poços do gel por pipetagem de 50 ul de tampão de corrida para os poços cinco vezes cada um.
  8. Carga de 10 ul de escada proteína para o primeiro poço e adicionar 10 uL das soluções cozidos a partir do passo 8.5 para separar poços. Submeter o gel a 115 V por 60 min.
  9. Remover o gel a partir do aparelho e transferi-lo para um recipiente de pequenas dimensões. Encha a Container com 100 ml de H 2 O pura e transferir o contentor para uma plataforma de rotação lenta durante 8 min. Após a 8 minutos, despejar a água e lavar o gel duas vezes com H 2 O.
  10. Despejar a H2O do recipiente e adicionar 100 mL de reagente de coloração rápida para o recipiente. Permitir que isto se sentar em uma plataforma de rotação lenta durante a noite, cobrir com papel alumínio.
  11. Despejar o reagente de coloração rápida e adicionar cerca de 100 ml de H 2 O para o recipiente. Permitir que este para se sentar em uma plataforma giratória para 8 min. Despejar a H 2 O e repetir a lavagem de H 2 O duas vezes.
  12. Imagem do gel usando um gerador de imagens de manchas de azul de Coomassie. Procure uma faixa em torno de 31,86 kDa (proteína tag MOG) e uma banda mais fraca em 63,72 (dímeros tag MOG) kDa.

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Resultados

Uma vez que a purificação está completa, as amostras recolhidas nos passos 1.4, 2.1, 3.4, e o produto final da etapa 6.4 devem ser corridos num gel de proteína (Figura 3A). Tag MOG primeiro deve aparecer como uma banda de 31,86 kDa na amostra T O / N, mas não t 0, e deve ser a única banda no produto final puro. Para testar se a proteína com cauda tem MOG correctamente dobrada, a proteína com cauda MOG pode se...

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Discussão

Aqui, nós descrevemos um protocolo para a produção de proteína com cauda MOG e como gerar puro MOG 1-125 da proteína com cauda MOG. Este protocolo baseia-se tanto em métodos padrão His-tag com base de purificação de proteínas, bem como um protocolo anteriormente descrito para a geração de uma proteína com base MOG-15 mais velhos. Embora não seja descrito aqui, a utilização principal da proteína com cauda é a MOG para induzir EAE por imunização co...

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Divulgações

The authors declare no competing financial interests.

Agradecimentos

This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labThese bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth millerBioshopLBL407.1
Ampicillinbio basicAB0028Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTGBioshopIPT002.5Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozymeBioshopLYS702.10Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100SigmaT-8532
Phosphate buffered salinelife technologies20012-027Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chlorideBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidine-HClSigmaG3272The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTAbioshopEDT111.500
Nickel (II) sulfateBioshopNIC700.500
His bind resinEMD Millipore69670-3Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanolCommercial AlcoholsP016EAANDilute with water as needed.
Glacial acetic acidBioshopACE222.1
Sodium acetate trihydrateBioshopSAA305.500
bovine serum albumin standardbio-rad500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentratebio-rad500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrateFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubingThermoscientific68700
2-mercaptoethanolSigmaM3148-25mlThis reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV proteaselifetechnologies12575-015Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350BioshopPEG335.1
polyethyleneglycol 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plateebioscience44-2404-21
SonicatorFisher scientificFB-120-110
Eon microplate spectrometerBiotek11-120-611This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis softwareBioTek
sodium dodecyl sulphateBioshopSDS001
bromophenol blueBioshopBRO777
GlycerolBioshopGLY001
Protein desalting columnsThermoscientific89849
GlycineBioshopGLN001
precast 12% polyacrylamide gelbio-rad456-1045
Rapid stain reagentEMD Millipore553215
Gel dock EZ imagerbio-rad1708270
White Light Sample Traybio-rad1708272 Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladderbio-rad1610375

Referências

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