Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

Riepilogo

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4⁺ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOG_tag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG_1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOG_tag or MOG_1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOG_tag protein. Immunization with either MOG_tag or MOG_1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

Introduzione

La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione ^1. "Encefalomielite autoimmune sperimentale" è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione ^2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante.

autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante ^{+ T epitopo cellule di una proteina mielina. Questo rappresenta il requisito minimo per indurre una risposta patogena. Forse il più comune di questi è un peptide di 21 aminoacidi derivato da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG _35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l'immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l'intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie 4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell'antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell'antigene alle cellule T CD4 +. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG _35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG 5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano 6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti.}

Nonostante i vantaggi dell'utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG _35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) _1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti ^7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG ^8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG _1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare.

Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l'insolubilità noto di MOG proteine ^5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l'unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG _1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG _1-125 era codone ottimizzato per l'espressione batterica e la proteina di fusione _tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine _tag, e puro MOG _1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Proteine ​​induzione

NOTA: Nelle seguenti passaggi, BL21 Escherichia coli trasformato con un vettore pET-32 contenente la sequenza per la proteina _tag MOG di fusione (vedi riferimento ⁵ e Figura 1) sono coltivati a densità elevate e sono quindi indotti a esprimere la proteina _tag MOG . Vedere la Figura 2 per cronologia generale - di notare che i giorni sono i punti di stop approssimativi alternativi sono indicati nel protocollo. Se a partire da purificato DNA _tag PET-32 MOG vettore, sarà necessario trasformare chimicamente in competente BL21 E. coli, batteri che utilizzano la selezione ampicillina, come è stato ben descritto ^9. Trasformazione di successo può essere confermata purificando DNA da batteri selezionati con un kit commerciale standard, seguita da digestione con gli enzimi di restrizione AGE1 e SAC1 per produrre una banda 424 bp su un gel di agarosio ^10.

1. inoculare 5 ml di brodo sterile lisogenia brodo (LB) (0,1 mg ampicillina / ml) con un BL21-MOG _tag stock di glicerolo e incubare durante la notte a 37 ° C, 200 giri al minuto.
2. Inserire due palloni 1 L Erlenmeyer contenenti 500 ml di brodo LB sterile in un incubatore a 37 ° in preparazione per il giorno successivo.
3. Aggiungere 500 pl di 100 mg / ml di ampicillina a ciascuno dei flaconi contenenti 500 ml LB dal punto 1.2 (concentrazione finale 0,1 mg / ml di ampicillina). Trasferire 1 ml della coltura overnight dal punto 1.1 a ciascuno dei due palloni di brodo LB. Incubare a 37 ° C e 200 rpm per 5 ore o fino ad una densità ottica di 0,6.
4. Prendere una 1 ml un'aliquota da uno dei flaconi e trasferirlo in un tubo separato da centrifuga da 1,5 ml. Agglomerare le cellule a 16.000 xg per 1 min e rimuovere il surnatante. Etichettare il tubo come T ₀ (pre-induzione) e poi mettere il pellet batterico in un -20 ° C freezer per il futuro sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) Analisi (vedere la sezione 8 e la Figura 3).
5. Aggiungere 0,5 ml di 1 M isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside, Isopropyl β-D-tiogalattoside (IPTG) per ogni pallone di coltura. Incubare le beute a 37 ° C, 200 rpm per 4 ore, quindi a temperatura ambiente a 75 rpm durante la notte.

2. La raccolta MOG _tag proteine

NOTA: In questa fase, i batteri avrà prodotto grandi quantità di proteine _tag MOG. Per raccogliere _tag MOG, batteri vengono prima lisate in un buffer Triton X-100 seguito da sonicazione. _Tag MOG viene poi rilasciato da corpi di inclusione e denaturato con imidazolo e guanidina, risultante in una soluzione proteica grezza contenente la proteina _tag MOG.

1. Prendere un 1 ml un'aliquota da una delle culture durante la notte dal punto 1.5 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Agglomerare le cellule a 16.000 xg per 1 min e rimuovere il surnatante. Etichettare la vascae T _{O / N} (post-induzione) poi mettere il pellet batterico in una -20 ° C per una futura analisi della pagina SDS (Figura 3).
2. Distribuire le culture in modo uniforme tra le bottiglie da 250 ml compatibile con l'alta velocità e la centrifugazione tenerli in ghiaccio da questo punto in avanti. Agglomerare le cellule batteriche a 22.000 xg per 15 min a 4 ° C.
3. Eliminare il surnatante. Conservare il pellet batterici a -20 ° C o continuare al punto 2.4.
4. Preparare tampone di lisi (0,1 mg / ml di lisozima uovo di gallina, 0,1% Triton-X (v / v) in tampone fosfato (PBS)) aggiungendo 60 ml di Triton X-100 e 120 ml di 50 mg / ml uovo di gallina lisozima soluzione stock di 60 ml di PBS.
5. Risospendere e combinare tutti i pellet batterici dal punto 2.3 in un totale di 30 ml di tampone di lisi. Trasferire questo volume ad un tubo a fondo tondo da 50 ml in grado di alta centrifugazione velocità. Inserire questo tubo in un bagnomaria C 30 ° per 30 min. Durante il periodo di incubazione, agitare il tubodue volte per risospendere le cellule.
6. Dopo l'incubazione, trasferire il tubo sul ghiaccio e sonicare la soluzione a 20 kHz, l'ampiezza del 70%, su impulso di 3 secondi, il polso fuori 3 sec, e cinque impulsi per giro. Sonicare la soluzione per sei turni totali e consentire la soluzione raffreddare sul ghiaccio in-tra un round.
7. Centrifugare ad 24.000 xg per 15 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e ripetere i passaggi 2,5-2,7 una volta. Conservare il pellet a -20 ° C o continuare al punto 2.8.
8. Preparare tampone A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, pH 7,9) aggiungendo 0,8766 g di NaCl, 0,09,456 mila g di Tris-HCl e 0,01,021 mila g di imidazolo ad un becher da 100 ml. Aggiungere H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 28 ml quindi regolare il pH della soluzione a 7,9. Poi, trasferire la soluzione in 100 ml cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino al volume di 30 ml.
9. Risospendere il pellet dal punto 2.7 in 30 ml di tampone A e incubare questa soluzione a 4 ° C per 3 ore. Durante questo periodopesare 17,2 g di guanidina-HCl.
10. Sonicare la soluzione su ghiaccio con le stesse impostazioni come al punto 2.6. Aggiungere quindi 17,2 g di guanidina-HCl alla soluzione. Incubare questo in ghiaccio per 1 ora per solubilizzare la proteina _tag MOG.
11. Centrifugare ad 24.000 xg per 30 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare il surnatante a 4 ° C fino purificazione della proteina.

3. purificazione delle proteine

NOTA: Nelle seguenti fasi della proteina _tag MOG sarà purificato attraverso 4 giri di assorbimento su resina nichel carica (tramite il His-tag) e eluizione.

1. Effettuare le Buffer seguenti:
   1. Preparare tampone B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 0,0681 g di imidazolo e 114.64 g guanidina-HCl in un becher da 500 ml. Quindi aggiungere H ₂ O fino a raggiungere 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire il solution ad un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino a quando il volume è di 200 ml.
   2. Preparare Elution Buffer (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazolo, 6 M guanidina-HCl, pH 7.9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 6,808 g di imidazolo e 114.64 g guanidina-HCl a un becher da 500 ml. Aggiungere H ₂ O fino a raggiungere 190 ml e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino a quando il volume è di 200 ml.
   3. Preparare Striscia tampone (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Aggiungere 5,844 g di NaCl, 0,6304 g di Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA ad un becher da 500 ml. Aggiungere H ₂ O fino a raggiungere 190 mL e regolare il pH a 7,9. Trasferire la soluzione in un 250 ml cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino a quando il volume è di 200 ml.
   4. Preparare carica tampone (0,1 M di nichel solfato). Aggiungere 5,257 g di nichel solfato ad un bicchiere da 500 ml ed aggiungere H ₂ O, fino a raggiungere 190 ml (ATTENZIONE, non maneggiare nichelsolfato di fuori di una cappa aspirante fino al solfato di nichel è stato sciolto in H ₂ O). Una volta che il solfato di nichel è dissolta, trasferire la soluzione in 250 ml cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 200 ml.
2. Split 10 ml di resina al nichel tra due provette coniche da 50 ml centrifuga capaci di resistere forze centrifughe oltre 4.500 xg (5 ml in ciascun tubo).
3. Caricare ed equilibrare la resina al nichel:
   1. Lavare la resina con l'aggiunta di 40 ml di H ₂ O per ogni provetta contenente resina. Posare i tubi in orizzontale su una sedia a dondolo e farli agitare per 5 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
   2. Eliminare il surnatante pipettando per non disturbare il pellet. Aggiungere 40 ml di tampone di carica per ogni provetta. Trasferire i tubi su una sedia a dondolo e farli agitare per 15 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
   3. Eliminare il surnatante poi aggiungere 40 ml di tampone B per i tubi. Trasferire i tubi su una sedia a dondolo e farli agitare per 5 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, centrifugare le provette a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C poi scarta il surnatante.
4. Opzionale: Prendete 150 ml di proteina solubilizzato rilevati nella fase 2.11 e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Etichettare il tubo come pre-incubazione e congelare questo a -20 ° C per una futura analisi della pagina SDS (Figura 3, Crude MOG _tag).
5. Purificare il _tag MOG Proteine:
   1. Trasferire l'intero volume di proteine solubilizzato dal punto 2.11 (~ 40 ml, meno il piccolo campione rimosso al punto 3.4) per il primo tubo (Figura 2, il tubo 1) contenente resina nickel dal punto 3.3, mescolare e posizionare orizzontalmente su una sedia a dondolo a 4 ° C per 1 ora.
   2. Centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C. Una volta terminato, trasferire il surnatante al secondotubo (Figura 2, il tubo 2) di resina nichel e incubare come descritto nel passaggio precedente. Nel frattempo, continua con i passaggi da 3 a 6 di seguito con il tubo 1.
   3. Risospendere la resina nickel in tubo 1 in 40 ml di tampone di eluizione e posizionare il tubo orizzontalmente su un bilanciere a 4 ° C per 5 min. Poi, centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C.
   4. Trasferire il surnatante contenente eluito proteina _tag MOG in un flacone da 250 ml con l'etichetta 'purificata _tag MOG proteine' e mantenere questa bottiglia a 4 ° C. Ad ogni passo di eluizione, in comune il surnatante risultante in questa bottiglia.
   5. Aggiungere 40 ml di tampone striscia alla resina nichel e posizionare orizzontalmente su un bilanciere per 5 minuti a 4 ° C.
   6. Centrifugare la provetta a 4.500 xg per 8 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante, quindi ricaricare la resina nichel come elencato nel passaggio 3.3.
   7. Una volta terminato, andare avanti con il secondo tubo come elencato nel passaggio 3.5. Un totale di 4 rotondas di assorbimento della proteina solubilizzata dal punto 2.11 sulla resina nickel carica e eluizione recupererà maggior parte della proteina, sebbene, se desiderato, proteina aggiuntiva potrebbe essere recuperato in ulteriori cicli di assorbimento e di eluizione.
6. Dopo quattro (o più) cicli di assorbimento e eluizione sono completi, memorizzare la proteina purificata pool a 4 ° C durante la notte. resina Nichel può essere memorizzato in 40 ml di una soluzione di etanolo al 20% a 4 ° C fino al suo utilizzo nuovo.

4. misurazione della proteina Concentrazione

NOTA: Prima di procedere oltre è necessario quantificare la quantità di proteina purificata _tag MOG generato nella sezione 3. Viene utilizzato questo valore per determinare il volume finale di concentrare la proteina alla fine del protocollo. Descriviamo un Bradford test standard di qui. La concentrazione di proteine _tag MOG purificata è determinata confrontando l'assorbanza spettrale di serie diluted MOG _{etichetta proteica} ad una curva standard di albumina sierica bovina (BSA) ad una concentrazione nota.

1. Rendere 10x tampone acetato aggiungendo 23 ml di acido acetico glaciale a 8,2 g di sodio acetato in 3 L bicchiere e aggiungere 1,9 L di H ₂ O per sciogliere l'acetato di sodio. Trasferire questa soluzione in un 2 L cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 2 L. Poi conservarlo in una bottiglia 2 L a temperatura ambiente. Rendere 1 ml di tampone acetato 1x aggiungendo 100 ml di 10x tampone acetato a 900 ml di H ₂ O.
2. Impostare una piastra a 96 pozzetti per diluizioni con l'aggiunta di 30 ml di tampone acetato 1x a pozzi G2-8 e 60 ml di G9. Aggiungere 48 ml di tampone acetato 1x a H2 e H3.
3. Impostare la diluizione in serie iniziale della serie BSA in fila G come segue: Aggiungere 216 ml di tampone acetato di 1x e 54 ml di disponibile in commercio 2 mg di serie / ml di BSA in ben G1 e mescolare accuratamente. Aggiungere 210 ml da ben G1 a ben G2, mescolare accuratamente,e quindi aggiungere 180 ml di ben G2 per bene G3. Aggiungere 150 ml di ben G3 a G4 bene, mescolare accuratamente, e continuare questo trend di aggiungere 30 ml meno a ogni successivo e fino a ben G8. (Vedi Tabella 1 per le liste di fattori di diluizione equivalenti).
4. Impostare campioni triplicato di ciascuna diluizione trasferendo 10 ml di ben G1 nei pozzetti A1, B1 e C1, e 10 ml di ben G2 per pozzi A2, B2, C2 e, e così via. Utilizzare una pipetta multicanale.
5. Per impostare diluizioni di _tag MOG, aggiungere 60 ml di proteine _tag MOG purificata dal passaggio 3,6 a ben H1. Aggiungere 12 ml di ben H1 a H2 bene, mescolare accuratamente, quindi aggiungere 12 ml di ben H2 a H3 bene, mescolare accuratamente (questo produce una diluizione 1x nel 1 ° semestre, 1/5 di diluizione in H2 e H3 1/25 diluizione) .
6. Impostare campioni triplicato per le diluizioni _tag MOG trasferendo 10 ml di pozzi H1-H3 alle righe D, E e F, come descritto al punto 4.4.
7. Mescolare 2 ml di colorante dosaggio proteineConcentrato reagente con 8 ml di H ₂ O. Aggiungere 200 pl di questa miscela a tutti i pozzetti precaricati in righe A, B, C, D, E, e F, con una pipetta multicanale, se disponibile. Pop eventuali bolle nei pozzetti usando un ago prima di leggere la concentrazione di proteine.
8. Entro 10 minuti di aggiunta del reagente colorante, misurare l'assorbanza 595 nm di tutti i pozzetti in righe A, B, C, D, E e F.
9. Utilizzare righe A, B, e C per impostare una curva standard in cui le posizioni 1-9 corrispondono a 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 e 0 mg / ml di BSA. Sulla base di questa curva, calcolare la concentrazione di proteine _tag MOG utilizzando la diluizione del _tag MOG che meglio si adatta alla curva standard. Solitamente, ci saranno 200 a 250 mg di proteina _tag MOG da 1 L di coltura batterica utilizzando il protocollo qui descritto.
   NOTA: per rendere MOG _1-125 procedere da qui alla sezione facoltativa 7 elencati alla fine del protocollo. In caso contrario, continuare con la sezione 5.

5. Dialisi

NOTA: dialisi viene eseguita per rimuovere gradualmente guanidina dalla soluzione contenente purificata, _tag denaturato MOG per consentire la proteina a ripiegare. Si deve prestare attenzione durante questa fase come MOG è molto insolubile, e mentre questo è migliorata dalla presenza del tag tioredossina, è ancora incline a venire dalla soluzione. Pertanto, ripiegando dovrebbe essere eseguita gradualmente e ad una concentrazione relativamente bassa _tag MOG.

1. Prima di iniziare la dialisi, diluire la proteina _tag MOG purificata con tampone B (tampone B può essere fatto come elencato nel passaggio 3.1) finché la concentrazione è di 0,5 mg / ml o meno, in base alla quantità di _tag MOG calcolato nella sezione 4.
2. Tagliare circa 30 cm di snakeskin tubo di dialisi e fissare una estremità con una pinza emostatica bloccaggio piegando la fine della pelle di serpente oltre tre volte e bloccaggio alla fine piegato con la pinza emostatica. Riempire il serpente con diluito_Tag MOG proteine (tra 60 e 90 ml di MOG _tag proteine per provetta) quindi rimuovere le bolle d'aria dalla pelle di serpente da costringendoli fuori dalla estremità aperta. Infine, sigillare l'altra estremità del tubo con una seconda pinza emostatica bloccaggio.
3. Ripetere il passaggio 5.2 per riempire sezioni aggiuntive di tubo di dialisi fino a quando tutte le proteine _tag MOG è stato trasferito in tubi di pelle di serpente di dialisi. Assicurarsi che non vi siano perdite.
4. Fare acetato 1x con 4 M guanidina pesando 382,12 g di guanidina-HCl e l'aggiunta di 100 ml di 10x tampone acetato fatte nella fase 4.1 a 2 L bicchiere. Aggiungere 0,5 L di H ₂ O nel becher e consentire la guanidina-HCl sciogliere. Una volta disciolto, trasferire la soluzione in un 1 L cilindro graduato e aggiungere H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 1 L. Ripetere questa ricetta per ogni 2 pelli di serpente necessari.
5. Eseguire la dialisi come segue: riempire un secchio di grandi dimensioni (minimo 10 L) con 1 L di tampone acetato 1x con 4 M guanidina dal punto 5.4. Mettere su to 2 sezioni di tubo di dialisi contenenti _tag MOG nel secchio, lasciando spazio ad un ancoretta magnetica a girare senza ostacoli sul fondo. Mettere il secchio in una camera a 4 ° C su una piastra di agitazione magnetica e accenderlo per una velocità di rotazione lenta (cioè non elevata, quanto basta per spostare il fluido):
   NOTA: eseguire le seguenti operazioni per ridurre gradualmente la quantità di guanidina nel buffer. Mescolare volte sono dati come minimi, ma possono essere lasciati durante la notte. Dialisi avrà un minimo di 3 giorni, ma questo può essere esteso se lo si desidera. Controllare regolarmente per assicurarsi che il tubo sia intatto e che le estremità sono chiusi in modo sicuro.
   1. Lasciate che il secchio sedersi e mescolare per 4-5 ore.
   2. Aggiungere 1 L di tampone acetato 1x (100 ml 10x tampone acetato e 900 ml di H ₂ O) per ciascun segmento.
   3. Ripetere i punti 5.5.1 e 5.5.2 un totale di 3 volte per un totale di 4 L di tampone nel secchio.
   4. Eliminare la metà del buffer nel secchio e riempire con 1 L di tampone acetato 1x (100 ml 10x tampone acetato e 900 ml di H ₂ O, senza guanidina) e impostare la barra di tubo e mescolare.
   5. Ripetere i punti 5.5.1 e 5.5.2, una volta (cioè fino a quando c'è un totale di 4 L di tampone nel secchio).
   6. Infine, sostituire l'intero volume 4 L nel secchio con 4 L di tampone 1x acetato di fresco e lasciare mescolare per 4-5 ore. Per ottenere i migliori risultati, fare questo passo il giorno della concentrazione proteica.
   7. Rimuovere con attenzione il tubo di dialisi con _tag MOG ripiegata e scartare tampone secchio.

6. Concentrare MOG _tag proteine

NOTA: Nella fase finale, ripiegata proteina _tag MOG è concentrata per la diluizione di lavoro per la conservazione. Come _tag MOG è molto insolubile, non deve superare i 5 mg / ml. Questa concentrazione è approssimativamente equimolare con 0,4 mg / ml MOG _35-55 peptide, che è comunemente usato per indurre EAE nei topi (misti 1: 1 con assoluta adjuv di Freundformica (CFA)). Durante il processo di concentrazione non è raro che una piccola quantità di proteine ​​per uscire soluzione sotto forma di precipitato bianco. la precipitazione eccessiva è un problema, però.

1. Calcolare il volume finale desiderato per ottenere una concentrazione _variabile MOG 5 mg / ml, sulla base del valore calcolato nella sezione 4.
2. Linea un tegame con un foglio di alluminio e coprire il foglio di alluminio con polietilenglicole (PEG) 3350 e PEG 8000 in un rapporto 1: 1. Il PEG 3350 è incorporato in questa miscela in quanto può aiutare a prevenire l'aggregazione delle proteine durante la concentrazione ed è un efficace cyropreservative ^11.
3. Mettere il tubo di serpente (con MOG _tag proteine all'interno) sulla parte superiore del foglio di alluminio e coprire con PEG 8000. Che questa riposare a temperatura ambiente e verificare la quantità regolarmente finché il volume è uguale o inferiore al volume finale stimato (calcolato al passo 6.1), il volume effettivo sarà misurato nel passaggio successivo. Se la pentola diventatroppo saturi con acqua durante il processo di concentrazione, impostare una padella fresco con un foglio di alluminio e PEG 3350 e PEG 8000.
4. Lavare l'esterno delle pelli di serpente con H ₂ O e trasferire la proteina _tag MOG ad una bottiglia di vetro separata con una pipetta sierologica. Tenere traccia del volume come la proteina viene trasferita per garantire il volume sia corretto.
   1. Se il volume è stato ridotto al di sotto del volume finale stimato, aggiungere 1x tampone acetato fino a raggiungere il volume desiderato. Se il volume è superiore al volume finale stimato, trasferire la proteina _tag MOG indietro nel tubo di dialisi e continuare la concentrazione (passi 6,2-6,3).
   2. Distribuire la proteina _tag MOG tra provette da 1,5 ml (0,5 ml per provetta), conservare le provette a -80 ° C fino al momento dell'uso. Per indurre EAE, mescolare questo volume 1: 1 con il CFA.
5. Eseguire un gel SDS PAGE per confermare l'espressione della proteina _tag MOG utilizzando i campioni prelevati nei passaggi 1.4, 2.1, 3.4, e la proteina MOG purificata dal punto 6.4.

7. Generazione MOG _1-125 da _tag MOG Utilizzando TEV proteasi (opzionale)

NOTA: Questa operazione facoltativa continua a partire dalla fine del punto 4. Se è necessaria MOG _1-125 senza sequenze di tag in più, le sequenze di tag possono essere rimossi con TEV proteasi (Figura 4). Per quanto a nostra conoscenza, non c'è nessun altro sistema di espressione in grado di generare puro MOG _1-125. Tuttavia, va notato che senza il tag tioredossina, MOG _1-125 è altamente insolubile e questo può causare problemi durante la purificazione e la manipolazione, e per questo rimuovere il tag se assolutamente necessario per motivi sperimentali. Sono necessari diversi passaggi per generare puro MOG _{1-125. Tag} MOG viene prima dializzata in TEV buffer di proteasi scissione. Dopo digestione con proteasi TEV, il volume viene ridotto per aiutare con la purificazione dopo steps, poi dializzati in tampone B, e poi il His-tag contenenti sequenza di tag viene rimosso con resina nichel. Infine, la proteina viene quantificata e pura MOG _1-125 viene concentrata a concentrazione finale.

1. Rendere 1 L di 10x tampone di scissione TEV (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA) aggiungendo 1.861 g di EDTA, 44,4 g Tris-HCl, e 26,5 g Tris a 2 L becher. Aggiungere H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 990 ml quindi regolare il pH a 8 per sciogliere l'EDTA. Trasferire la soluzione ad un 1 L cilindro graduato e portare il volume fino a 1 L con H ₂ O.
2. Diluire proteine _tag MOG dalla fase 3.6 a 0.5 mg / ml utilizzando tampone B (stesso tampone descritto al punto 3.1), in base alla quantità di proteine calcolato nella sezione 4. Trasferire 120 ml di proteina _tag MOG diluito a snakeskin tubo di dialisi come descritto in passi 5.2 a 5.3. Il volume può essere scalata fino tuttavia la quantità di TEV proteasi richiesto per fendere tutte le proteine _tag MOG sarà SOSTANZEntial.
3. Seguire il protocollo di dialisi elencati al punto 5.5, ad eccezione di sostituire il tampone 10x di acetato con buffer di scissione 10x TEV fatto in fase 7.1.
4. Trasferire il _tag MOG, adesso TEV buffer di scissione, in un flacone di vetro da 250 ml e monitorare l'aumento del volume della dialisi. Aggiungere 1 ml di β-mercapto-etanolo per ogni 2,85 ml di MOG _tag proteine aggiunte alla bottiglia. Aggiungere almeno 1 mg di TEV proteasi (soluzione TEV a 5 mg / ml) per ogni 50 mg di proteina _tag MOG (TEV proteasi può essere aggiunto fino a 1:10 TEV: rapporto proteine MOG) ed incubare a temperatura ambiente, riparo dalla luce per almeno 72 ore.
   NOTA: Al termine dell'incubazione proteasi TEV, precipitati bianchi dovrebbero essere visti nella parte inferiore della bottiglia di vetro.
5. Prima di trasferire la proteina tubo di dialisi, aggiungere guanidina-HCl alla soluzione fino a quando le proteine ​​sciogliere per impedire la proteina precipita di attaccarsi alla bottiglia di vetro. Trasferire 150 ml diquesta soluzione in una provetta da 1,5 ml ed etichetta tubo come "MOG con TEV". Conservare la soluzione a -20 ° C per future analisi SDS-PAGE.
6. Trasferire tutto il fluido dal passaggio 7,5 nel tubo di dialisi come elencato in passi 5.2 a 5.3. Riempire un secchio con 2 L di H ₂ O e porre il tubo di dialisi nel secchio. Incubare questo a 4 ° C con luce agitazione per una notte. Questo passaggio è importante per diluire la guanidina per consentire la concentrazione proteica avvenga rapidamente e di iniziare a rimuovere l'EDTA dalla soluzione che interferirà con la purificazione della proteina.
7. Concentrare la proteina nel tubo di dialisi come elencato in passi 6.2 al 6.3 (tranne usare solo PEG 8000) tale che il volume finale della soluzione è ~ 40 ml. Lavare il tubo di dialisi con H ₂ O e rimuovere qualsiasi residuo di PEG 8000 ancora attaccato al tubo. Questa riduzione del volume permette di montare tutte le proteine ​​digerito in una provetta da 50 ml contenente nichel reil peccato, come descritto al punto 3.5.
8. Dializzare Protein digerito a tampone B:
   1. Riempire un grande secchio con 1 L di tampone B (29,22 g di NaCl, 3.152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazole, 573,18 g di guanidina-HCl, pH 7,9).
   2. Posizionare le pelli di serpente contenenti proteine ​​digerite dal punto 7.7 nel secchio insieme con un magnete stir (come descritto in maggior dettaglio nel passo 5.5). Mettere il secchio in un 4 ° C stanza fredda su un piatto mescolare impostato scalpore lento e permettono le pelli di serpente per Dializzare per 5 o più ore.
   3. Svuotare il secchio e riempirlo con un altro 1 L di tampone B e lasciare che questo sedersi nella stanza fredda C 4 ° su un piatto mescolare impostato scalpore lenta e consentire le pelli di serpente per Dializzare per 5 o più ore.
9. Eseguire purificazione della proteina _1-125 MOG come descritto nella sezione 3, con l'importante differenza che le sequenze di tag clivati saranno vincolati dalla resina al nichel, lasciando MOG _1-125 in soluzione. Anche in questo caso, 4 giri di purificazione sarannoeseguita nello stesso volume, ma in questo caso l'obiettivo è quello di migliorare la purezza, piuttosto che di recuperare il più possibile proteine. Vedere la Figura 4.
   1. Rendere i buffer di purificazione di proteine ​​di cui al punto 3.1
   2. Caricare entrambi i tubi di resina al nichel come descritto al punto 3.3.
   3. Purificare MOG _1-125 dal protocollo in dettaglio nel passo 3.5, con l'eccezione essenziale che l'eluato dalla resina di nichel contenente tag viene scartato (tenere 150 ml di eluato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga per future analisi SDS-PAGE), mentre la soluzione contenente MOG _1-125 viene mantenuta come prodotto finale.
10. Misurare la concentrazione di MOG _1-125 proteine come descritto nella Sezione 4:
    1. Impostare le diluizioni curva standard BSA come descritto ai punti 4.2 e 4.4.
    2. Impostare le diluizioni del MOG _1-125 come descritto ai punti 4.5 e 4.6. In alternativa, può essere utile per generare un intervallo maggioredi diluizioni (1x, 1/2, 1/4, e 1/8, per esempio). Regolare volumi di tampone acetato di 1x e MOG _1-125 conseguenza.
    3. Eseguire la Bradford test come descritto nei punti 4,7-4,9 e calcolare la quantità di MOG _1-125 generato. Il rendimento atteso è di circa 4 mg o più proteine.
11. Ripiegare MOG _1-125 da un graduale rimozione di guanidina tramite dialisi, come descritto nella sezione 5.
12. Concentrato MOG _1-125 proteine come descritto nel paragrafo 6. La concentrazione finale dovrebbe essere 2,24 mg / ml, che è equimolare di 5 mg _tag / mL MOG.

8. SDS-PAGE gel di Conferma MOG _tag Produzione e Purezza

NOTA: I campioni prelevati da piazza di 1.4, 2.1, 3.4, e 6.4 vengono analizzati dalla norma SDS-PAGE per confermare la produzione di _tag MOG e purezza. Questa operazione deve essere eseguita dopo la purificazione finale di una _tag MOG o MOG _1-125.

1. Fare una tampone di caricamento 2x SDS-PAGE aggiungendo 1,576 g di Tris-HCl a 2 ml di H ₂ O e impostare il pH a 6,8. Aggiungere 0,4 g SDS nella soluzione Tris-HCl e quindi aggiungere H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 7 ml.
2. Aggiungere 0,2 g di blu di bromofenolo a 10 ml di H ₂ O quindi aggiungere 1 ml di questa alla soluzione fatta nel passaggio 8.1. Infine, aggiungere 2 ml di glicerolo per finire il tampone di caricamento 2x SDS-PAGE. Quando si conserva questa soluzione, mantenere a 4 ° C e proteggerlo dalla luce per un massimo di 3 mesi.
3. Scongelare le aliquote congelate di batteri dai passi 1.4 e 2.1, nonché il solubilizzato MOG _tag proteina da passi 3.4 e 6.4 a temperatura ambiente.
4. Rimuovere i sali dalle soluzioni raccolti in passi 3.4 e 6.4 con l'aggiunta di 60 ml di ogni proteina alle colonne dissalazione. Purificare le proteine ​​seguenti istruzioni del produttore.
5. Aggiungere 20 ml di β-mercapto-etanolo per 1 ml di soluzione fatta nel passaggio 8.2. Aggiungere 40 ml di questo ai due bacriale pellet dal punto 8.3 e 60 ml di proteine ​​dissalate dal punto 8.4 e incubare questi a 95 ° C per 10 min.
6. Fare 1x tampone esecuzione pagina SDS pesando 5 g di Tris, 28,8 g glicina, e 1 g di SDS. Aggiungere questi ad un 1 L becher da 500 ml H ₂ O per sciogliere tutto. Una volta disciolto, trasferire la soluzione in un 1 L cilindro graduato e riempire con H ₂ O fino a quando il volume raggiunge 1 L.
7. Impostare un gel di poliacrilammide al 12% in un apparato gel quindi aggiungere il tampone di corsa SDS-PAGE 1x all'apparato gel tale che il tampone di corsa è appena sopra la parte superiore dei pozzetti nel gel. Lavare i pozzetti del gel pipettando 50 ml di tampone di corsa nei pozzetti cinque volte ciascuno.
8. Carico 10 ml di scala delle proteine ​​nel primo pozzo e aggiungere 10 ml di soluzioni bollito dal punto 8.5 pozzetti. Attivare il gel a 115 V per 60 min.
9. Rimuovere il gel dall'apparecchio e trasferirlo ad un piccolo contenitore. Riempire la container con 100 ml di puro H ₂ O e trasferire il contenitore per una piattaforma rotante lentamente per 8 min. Dopo l'8 min, scaricare l'acqua e lavare il gel altre due volte con H ₂ O.
10. Cassone H ₂ O dal contenitore e aggiungere 100 ml di rapido reattivo macchia al contenitore. Lasciare questo a sedersi su una piattaforma rotante lentamente durante la notte, coprire con un foglio di alluminio.
11. Dump il reagente macchia rapida e aggiungere circa 100 ml di H ₂ O al contenitore. Lasciare questo a sedersi su una piattaforma rotante per 8 min. Cassone H ₂ O e ripetere il lavaggio H ₂ O due volte.
12. Immagine il gel utilizzando un imager per le macchie blu Coomassie. Cercare una fascia intorno 31.86 kDa (proteina _tag MOG) e una banda debole a 63.72 kDa (MOG _tag dimeri).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Dopo la purificazione è completo, i campioni raccolti in passi 1.4, 2.1, 3.4, e il prodotto finale dal punto 6.4 devono essere eseguiti su un gel proteico (Figura 3A). _Tag MOG deve prima apparire come un kDa banda 31.86 nel campione T _{O / N,} ma non t _0, e dovrebbe essere l'unica band nel prodotto puro finale. Per verificare se la proteina _tag MOG ha correttamente piegato, la proteina _tag MOG può essere usato pe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo per la produzione di MOG _{etichetta proteica} e come generare puro MOG _1-125 dalla proteina _tag MOG. Questo protocollo si basa sia sulla base metodi di purificazione delle proteine standard di His-tag, così come un protocollo precedentemente descritto per la generazione di una proteina MOG-based anziani ^15. Anche se non è qui descritta, l'utilizzo primaria della proteina _tag MOG è indurre EAE attraverso l'immunizzazione ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller	Bioshop	LBL407.1
Ampicillin	bio basic	AB0028	Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme	Bioshop	LYS702.10	Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Phosphate buffered saline	life technologies	20012-027	Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride	Bioshop	SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA	bioshop	EDT111.500
Nickel (II) sulfate	Bioshop	NIC700.500
His bind resin	EMD Millipore	69670-3	Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol	Commercial Alcohols	P016EAAN	Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid	Bioshop	ACE222.1
Sodium acetate trihydrate	Bioshop	SAA305.500
bovine serum albumin standard	bio-rad	500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate	bio-rad	500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate	Fisher scientific	BP120-500
Tris-base	Bioshop	TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing	Thermoscientific	68700
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148-25ml	This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease	lifetechnologies	12575-015	Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyethyleneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate	ebioscience	44-2404-21
Sonicator	Fisher scientific	FB-120-110
Eon microplate spectrometer	Biotek	11-120-611	This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software	BioTek
sodium dodecyl sulphate	Bioshop	SDS001
bromophenol blue	Bioshop	BRO777
Glycerol	Bioshop	GLY001
Protein desalting columns	Thermoscientific	89849
Glycine	Bioshop	GLN001
precast 12% polyacrylamide gel	bio-rad	456-1045
Rapid stain reagent	EMD Millipore	553215
Gel dock EZ imager	bio-rad	1708270
White Light Sample Tray	bio-rad	1708272	Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder	bio-rad	1610375