光遗传学随机突变用组蛋白miniSOG在<em&gt;℃。线虫</em

摘要

基因编码的蛋白，miniSOG诱导蓝光依赖性全基因组的遗传突变。这种突变方法简单，快速，免费的有毒化学物质，并非常适用于正向遗传学筛查和转基因整合。

摘要

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

引言

向前遗传筛选已广泛用来产生遗传突变破坏在模式生物的各种生物过程，如秀丽隐杆线虫（线虫^）1。这些突变体的分析导致功能重要基因的发现及其信号通路^1,2。传统上，诱变C.线虫使用诱变化学物质，辐射或转座子²来实现的。化学品，如甲磺酸乙酯（EMS）和N-乙基-N- -nitrosourea（ENU）是对人体有毒;伽玛射线或紫外线（UV）辐射诱变需要特殊的设备;和转座子活性菌株，例如突变株^3，可在维护期间造成不必要的突变。我们已经开发出一种简单的方法来诱导用基因编码的光敏剂⁴遗传突变。

活性氧（ROS）可以破坏DNA ^5。微型单线态氧发生器（miniSOG）是一个从所述LOV（光，氧气，和电压）工程106氨基酸拟南芥向光2 ⁶的结构域的绿色荧光蛋白。在暴露于蓝光（〜450纳米），miniSOG产生活性氧包括与FL AVIN单核苷酸单线态氧作为辅因子^6-8，这是存在于所有细胞中。我们通过标记miniSOG到组蛋白72，C的C末端构成一的His-mSOG融合蛋白组蛋白3. 线虫变种我们产生了一个单拷贝转基因⁹表达他-mSOG在C的生殖细胞线虫，在黑暗中正常培养条件下，他的-mSOG转基因蠕虫具有正常的育雏大小和寿命^4。在暴露于蓝光LED灯，在他的-mSOG蠕虫产生它们的后代中⁴遗传突变。诱发突变的频谱包括核苷酸变化，如G:C至T的:A和G:C 1至C:G和小chromoso我删除^4。这种诱变方法是简单的执行，且只需最少实验室安全设置。这里，我们描述了LED照明设备和程序为光遗传学诱变。

研究方案

1.在LED照明的构建

注:需要的LED设备中总结材料的清单。整个LED的设置是小，可以在实验室中的任何位置，但我们建议它被放置在一个黑暗的房间，以控制蠕虫⁴的曝光。

1. 连接LED与电缆（ 图1A，D）的控制器。
2. 该控制器连接到用一根BNC电缆（ 图1A，C，D）的数字函数发生器/放大器。
3. 固定LED灯10厘米级以上使用定制支架（ 图1A）。
   注:我们做了与金属零件的持有人。
4. 覆盖LED照明的设置部分，但要避免热量堆积（ 图1B），这使得蠕虫病。
   注:我们使用一个特制的硬质塑料盖用开放的顶部和底部（ 图1A）。盖不需要诱变本身，而是被用来吨Ø限制了蓝光对周围环境的不必要的暴露。我们建议不要覆盖LED的设置完全（ 图1B），以防止过热的蠕虫。
5. 佩戴激光防护眼镜。
   注意:我们穿的激光防护眼镜，因为光线是非常光明的。太阳镜可以正常工作。
6. 切换LED控制器的杠杆"诠释"。为连续光照（ 图1D），并在最大功率（ 图1C）的65％的设置。
7. 使用光度计来测量，其中所述蠕虫使用制造商的协议放置台上的蓝色光的强度。该设置使2.0毫瓦/毫米²下连续照明。

2.蓝光治疗

注:使用应变CZ20310 juSi164 [PMEX-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR（TBB-2）+的Cb-UNC-119（+）] UNC-119（ED3）III ⁴位的应变才是可用的。在秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC，HTTP://www.cgc.cbs.umn.edu/）。

1. 维护标准线虫生长介质（NGM）黑暗中的他，mSOG株E.板大肠杆菌 OP50以下的标准协议^10,11。
   注:在环境光照下，juSi164株含不显示自发率⁴以上的突变率。使用带有卤素灯解剖范围一般不引起突变以及常规应变通道。然而，应注意，以避免不必要的曝光， 例如，保持在一个标准暗内孵化的菌株，或覆盖所述菌株与箔。这是建议的情况下，不必要的突变随时间累积收到后冻结应变等分。
2. 妊娠挑选年轻的成年人（约12小时后L4）动物蠕虫挑^11。
   注:年轻的动物显示较少的诱变作用^4，而年长的动物可能有更低的育雏大小。
3. 切滤波器p纸张，以适应60毫米板用25毫米×25毫米的方形孔和放置到一个未播种板（ 图1E）。
   注:正方形冲头可以使用，但冲头的大小不必是精确的。
4. 在滤纸上滴100微升的100mM的CuCl ₂的均匀地在平板上的方孔中限制蠕虫。
5. 挑妊娠年轻成人雌雄同体的期望数目（参见，例如第3步），并转移到的CuCl ₂板的中心。
6. 佩戴激光防护眼镜。
7. 开关ON LED和函数发生器。
8. 切换LED控制器的杠杆"分机"。由函数发生器（ 图1D），以控制它。
9. 设置在最大功率的65％的控制器和功能发生器作为正弦波，4赫兹（ 图1C）。
10. 放置来自步骤2.5的CuCl ₂板而不在舞台上的盖的LED（ 图1A <下/ STRONG>）。
11. 照亮与蓝色光的动物30分钟。
12. 健康的转移寻找蠕虫到种子板为P _0。
    注:P ₀的所需数量取决于画面的类型。见一个例子第3步。在P ₀蠕虫可能表现为光后立即处理不协调，会随着时间恢复。
13. 保持在孵化器或在黑暗中使用覆箔蠕虫;并按照标准程序，开始他们的后代当中^2,10筛选所需的表型。

3.正向遗传筛选的例子

注意:这与120单倍体基因组克隆画面的一个例子，以检查是否在LED和应变工作图2示出的程序的示意图。

1. [第一天]在蓝光治疗，挑5看起来健康蠕虫到NGM板OP50为P _0，让他们在一个20℃的孵化器，并让它们产卵1D（'第一天'板）。
2. [第2天]转第₀到一个新的种子板块（"第2天"板）。
3. [第三天]选择，并通过焚烧他们杀上的"第2天"平板P _0。
4. [第四天]从'第一天'接盘30妊娠年轻的成年_F1和他们转移到个别板块（第30楼₁板的'第一天'）。
5. 对于"第2天"板[第五天]重复步骤3.4（第30楼₁板的"第2天"）。
6. [Day7-9]检查异常形态和/或相对于野生型菌株（ 图3A）F ₂蠕虫行为标准立体显微镜下，当他们变得成年人。
   注:遗传突变显示约四分之一与F ₂之间的同型蠕虫病毒，当它是隐性的高外显率。然而，一些突变体可以生长缓慢和/或显示部分显性。因此，它有可能小于四分之一突变体可以在找到盘子。
7. 单独挑可见表型蠕虫和检查表型的遗传下一代。

4.外的转基因整合的例子

1. 注入感兴趣的DNA导入CZ20310 juSi164 [PMEX -5- HIS-72 :: miniSOG-3'UTR（TBB-2）+的Cb-UNC-119（+）] UNC-119（ED3）和制备转基因蠕虫用以下标准注射方案^12,13低传输率（10-30％）。
   注:另外，建立外阵列可越界进入juSi164株。为了避免juSi164基因分型，juSi164杂合子可以用作在P ₀虽然效率可能被降低。对于juSi164的基因分型方法在第5描述。
2. 如步骤2中所述[第一天]治疗20〜转基因动物为P ₀与蓝色的光。
   注:更多的P ₀蠕虫取决于TR是必要的 ansmission率。转基因可通过表型或共注射标记^12,13来识别。
3. 挑选10名健康寻找P ₀到个别板块，让他们在一个20℃的孵化器，并让它们产卵几天（P ₀车牌）
4. [第四天]挑出20转f起每个P ₀到板个别板块₁蠕虫，并让他们产卵。 （20架F _1×10个P ₀ =板200°F ₁板总）。
5. 【第七天】元函数₁板具有转基因> 75％，F _2。
6. 挑5的转基因动物从> 75％的传输速率F ₁板（F ₂板）。
7. [第十天]保持F ₂板100％的传输速率作为潜在整合线。
8. 异交用标准程序¹⁰检查孟德尔遗传规律，并消除潜在的背景突变的潜在整合线。

乐"> 5。基因分型

1. 裂解20使用标准协议¹⁴异型杂交F ₂蠕虫在裂解缓冲液。
2. 使用引物对MosSCI插入^{9，juSi164，（} 表1）用以下的标准协议¹⁴的退火温度为58℃进行PCR。
   注意:这是不必要的基因型UNC-119（ED3）因为UNC-119（ED3）可以通过不协调行为除去在以下步骤5.4和5.5的抢救转基因（juSi164）后进行检测。
3. 运行琼脂糖凝胶电泳¹⁵和检查带大小（ 表1）找到WT为juSi164。
4. 检查如果F ₂后代瘫痪蠕虫由于UNC-119（ED3）的存在。
5. 如果步5.4中发现不协调蠕虫，单数nonuncoordinated蠕虫获得下一代所有nonuncoordinated蠕虫。

结果

我们用下面的第2和第3，其中对应于120诱变单倍体基因组的60架F ₁板中描述的标准协议，30分钟曝光进行与CZ20310 juSi164 UNC-119（ED3）正向遗传筛选，我们发现8 F ₁板带F ₂蠕虫显示可见的表型，如身体尺寸缺陷（ 图3B），运动不协调（ 图3C），和成人杀伤力（ 图3D）。我们没有注意到在'第一天"和"第2天"板...

讨论

在这里，我们描述了使用光遗传学诱变的详细流程的His-mSOG在种系表达并提供一个小规模向前遗传画面的一个例子。相比标准化学诱变，此光遗传学诱变方法具有几个优点。首先，它是无毒的，从而保持实验室人员从有毒的化学诱变剂如EMS，ENU路程，用紫外光（TMP / UV）trimethylpsoralen。其次，诱变的实验程序可用于一个小数目为P ₀的动物，并且可以在一小时内完成。第三，光遗传学诱变产?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K