Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Резюме

Генетически-кодируемый гистона-miniSOG индуцирует генома наследуемые мутации в голубой светло-зависимым образом. Этот метод мутагенеза является простым, быстрым, свободным от токсичных химических веществ, а также хорошо подходит для прямого генетического скрининга и интеграции трансгена.

Аннотация

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Введение

Форвард генетический скрининг широко используются для создания генетических мутантов разрушающие различные биологические процессы в модельных организмах , таких как Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) ^1. Анализ таких мутантов приводят к открытию функционально важных генов и их сигнальных путей ^1,2. Традиционно мутагенеза в C. Элеганс достигается за счет использования мутагенных химических веществ, радиации или транспозонов ^2. Химические вещества , такие как этиловый эфир метансульфоната (EMS) и N - этил - N -nitrosourea (ENU) являются токсичными для человека; гамма-лучей или ультрафиолетового (УФ) излучения мутагенеза требует специального оборудования; и транспозонов-активные штаммы, такие как мутаторов штаммов ^3, может вызвать ненужные мутации во время технического обслуживания. Мы разработали простой подход , чтобы вызвать наследуемые мутации с использованием генетически закодированного фотосенсибилизатора ^4.

Активных форм кислорода (ROS) может привести к повреждению ДНК ^5.Мини - Синглетно генератор кислорода (miniSOG) представляет собой зеленый флуоресцентный белок из 106 аминокислот , который был сконструированных из LOV (света, кислорода, и напряжение) области Arabidopsis phototropin 2 ^6. Под воздействием синего света (~ 450 нм), miniSOG генерирует РОС в том числе синглетный кислород с фл Авин мононуклеотид как кофактор ^6-8, который присутствует во всех клетках. Мы сконструировали гибридный белок His-mSOG помечая miniSOG на С-конце гистона-72, в C. Элеганс вариант гистона 3. Мы создали одностраничный копию трансгена ⁹ , чтобы выразить Его-mSOG в зародышевую C. Элеганс. При нормальных условиях культивирования в темноте, трансгенные черви Его-mSOG имеют нормальный размер выводка и срок службы ^4. При воздействии синей подсветкой, черви His-mSOG производят наследуемые мутации среди их потомства ^4. Спектр индуцированных мутаций включает в себя нуклеотидные изменения, такие как G: C Т: А и G: C к C: G и небольшой chromosoя делеции ^4. Эта процедура мутагенеза проста для выполнения, и требует минимальной настройки безопасности лаборатории. Здесь мы опишем установку светодиодной подсветки и процедуры для оптогенетика мутагенеза.

протокол

1. Конструкция светодиодной подсветки

Примечание: Необходимое оборудование LED резюмируется в списке материалов. Вся светодиодная установка мал и может быть размещен в любом месте в лаборатории, хотя мы рекомендуем быть размещены в темной комнате , чтобы контролировать освещенность червей ^4.

1. Подключить светодиод к контроллеру с кабелями (Рисунок 1А, D).
2. Подключение контроллера к цифровому функции генератора / усилителя с помощью кабеля BNC (Рисунок 1A, C, D).
3. Закрепите светодиодные на 10 см выше стадии , используя пользовательский держатель (Рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сделали держатель с металлическими частями.
4. Накройте светодиодной подсветки установки частично, но избежать накопления тепла (рис 1б), что делает черви больных.
   Примечание: Мы используем заказные жесткий пластиковый кожух с открытой верхней и нижней (рис 1А). Крышка не требуется для самого мутагенеза, но используется то ограничить ненужное воздействие синего света на окружающую среду. Мы рекомендуем , чтобы не покрыть полностью светодиодную установку (Рисунок 1B) для предотвращения перегрева червей.
5. Носите лазерные защитные очки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы носим лазерные защитные очки, потому что свет очень яркий. Солнцезащитные очки могут работать, как хорошо.
6. Переключите рычаг светодиодного контроллера "Int." для непрерывного освещения (рис 1D) и установить его на уровне 65% от максимальной мощности (рис 1C).
7. Используйте фотометр для измерения интенсивности синего света на сцене, где черви размещены с использованием протокола производителя. Установка дает 2,0 мВт / мм ² при непрерывном освещении.

2. Синий свет Лечение

Примечание: Используйте штамм CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (ТВВ-2) + Cb-ункции-119 (+)] ункции-119 (ed3) III ⁴ Штамм доступно. на Caenorhabditis генетический центр (CGC, HTTP: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. Поддерживайте напряжение Его-mSOG в темноте на стандартной среде роста нематода (NGM) пластины с E. палочка OP50 после стандартного протокола ^10,11.
   Примечание: Под окружающего света, -содержащие штаммы juSi164 не отображать частоту мутаций выше скорости спонтанного ^4. Регулярное прохождение деформации, используя рассекает область с галогенной лампой, как правило, не вызывает мутации, а также. Тем не менее, следует соблюдать осторожность , чтобы избежать ненужного воздействия света, например, сохранение штаммов в стандартной темно-внутри инкубатора, или покрытие штаммов с фольгой. Рекомендуется заморозить аликвот штамма после его получения в случае ненужные мутации накапливаются с течением времени.
2. Встреча беременной молодых взрослых (приблизительно 12 ч после L4) животных с червяком забрать ^11.
   Примечание: Более молодые животные показывают менее мутагенный эффект ^4, в то время как более старые животные могут иметь меньший размер выводка.
3. Вырезать фильтр ркабан , чтобы соответствовать 60 мм пластины с с 25 мм на 25 мм квадратное отверстие в и место на качестве затравки пластины (рис 1E).
   Примечание: Квадратный перфоратор может быть использован, но размер пуансона не должен быть точным.
4. Отбросьте 100 мкл 100 мМ CuCl ₂ на фильтровальную бумагу равномерно , чтобы ограничить червей в квадратное отверстие на пластине.
5. Выберите нужное количество икряных молодых взрослых гермафродитов (шаг 3 для примера) и передать в центр пластины CuCl _2.
6. Носите лазерные защитные очки.
7. Переключатель на светодиодном и функционального генератора.
8. Переключите рычаг светодиодного контроллера "Ext. контролировать ее с помощью функции генератора (рис 1D).
9. Установите контроллер на 65% от максимальной мощности и функцию генератора в качестве синусоиды, 4 Гц (рис 1C).
10. Поместите пластину CuCl ₂ с шагом 2.5 без крышки на сцене под LED (рис 1А </ Сильный>).
11. Осветить животных с синим светом в течение 30 мин.
12. Передача здоровый вид червей на ракетке пластину , как P _0.
    Примечание: Требуемое количество P ₀ , зависит от типа экрана. См шаг 3 для примера. В P ₀ черви могут оказаться несогласованными сразу после легкой обработки и будет восстанавливаться в течение долгого времени.
13. Держите черви, покрытые с помощью фольги в инкубаторе или в темное время суток; и следовать стандартной процедуре , чтобы начать скрининг желаемых фенотипов среди их потомства ^2,10.

3. Пример Форвард генетическом скрининге

Примечание:. Это является примером клонального экрана с 120 гаплоидных геномов , чтобы проверить , если светодиод и деформации работают На рисунке 2 показана схема процедуры.

1. [Day1] После синего света лечения, выбрать пять здоровый вид червей на тарелку NGM с OP50 как P _0, держать их в 20 ° C инкубатор, и пусть они откладывают яйца в течение 1d (пластинка 'DAY1').
2. [Day2] Передача P ₀ на новую ракетке пластины (пластина 'DAY2').
3. [Day3] Pick и убить P ₀ на табличке 'DAY2', сжигая их.
4. [Day4] Pick 30 молодых взрослых беременной F ₁ из пластины в 'DAY1' и передавать их на отдельные пластины (30 F ₁ пластин для 'DAY1').
5. [Число 5 число] Повторите шаг 3.4 для пластины в 'DAY2' (30 F ₁ пластины для 'DAY2').
6. [Day7-9] Проверьте ненормальные морфологию и / или поведение F ₂ червей по сравнению со штаммом WT (рис 3А) под стандартной стереомикроскопа , когда они становятся взрослыми.
   Примечание: наследственная мутация отображает около четверти червей с одинаковым фенотипом среди F ₂ , когда он является рецессивным с высокой пенетрантностью. Тем не менее, некоторые мутанты могут расти медленно и / или показать частичную пенетрантность. Поэтому, вполне возможно, что менее четверти мутантов можно найти напластина.
7. Pick червей с видимыми фенотипы индивидуально и проверить наследственность фенотипу в следующем поколении.

4. Пример интеграции экстрахромосомального трансгена

1. Впрыскивать интерес ДНК в CZ20310 juSi164 [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (ТВВ-2) + Cb-ункции-119 (+)] ункции-119 (ed3) и подготовить трансгенные червей с низкая скорость передачи (10-30%) после стандартного протокола ^12,13 инъекции.
   Примечание: В качестве альтернативы, установленные экстрахромосомные массивы могут быть скрещены в штаммы juSi164. Чтобы избежать генотипирование для juSi164, juSi164 гетерозиготы могут быть использованы в качестве P ₀ , хотя эффективность может снижаться. Метод генотипирования для juSi164 описана в разделе 5.
2. [Day1] Treat ~ 20 трансгенных животных , как P ₀ с синим светом , как описано в шаге 2.
   Примечание: Более P ₀ черви необходимы в зависимости от тр Скорость ansmission. Трансгенов могут быть идентифицированы с помощью фенотипов или соинжекцию маркера ^12,13.
3. Pick 10 здоровый вид P ₀ на отдельные пластины, держать их в 20 ° C инкубатор, и пусть они откладывают яйца в течение нескольких дней (P ₀₎ плиты
4. [Day4] Одиночные из 20 трансгенной F ₁ червей из каждого P ₀ пластины на отдельные пластины и пусть они откладывают яйца. (20 F ₁ х 10 P ₀ = 200 пластины F ₁ пластины в общей сложности.)
5. [День7] Найти F ₁ пластины с> 75% F ₂ , имеющих трансгены.
6. Возьмите пять трансгенных животных от скорости передачи данных > 75% F ₁ пластины (F ₂ пластины).
7. [Дни 10] Keep F ₂ пластины со 100% скорости передачи в качестве потенциальных интегрированных линий.
8. Скрещивание потенциальные интегрированные линии , используя стандартную процедуру ¹⁰ для проверки Менделя сегрегации и устранить возможные фоновые мутации.

ле "> 5. генотипирование

1. Lyse 20 ауткроссной F ₂ червей в буфере для лизиса с использованием стандартного протокола ^14.
2. Выполните ПЦР с использованием праймеров для MosSCI вставки ^9, juSi164, (таблица 1) с температурой отжига 58 ° С ниже стандартного протокола ^14.
   Примечание: Нет необходимости генотипу КСН-119 (ed3) , потому что ункции-119 (ed3) можно обнаружить с помощью несогласованного поведения после удаления спасая трансген (juSi164) в следующих шагах 5.4 и 5.5.
3. Запуск электрофореза в агарозном геле ¹⁵ и изучить размеры полос (таблица 1) , чтобы найти WT для juSi164.
4. Проверьте , если потомство F ₂ парализовала червей из - за существования КСН-119 (ed3).
5. Если несогласованные черви находятся на стадии 5.4, одиночные несколько nonuncoordinated червей для получения всех nonuncoordinated червей в следующем поколении.

Результаты

Мы провели вперед генетический экран с CZ20310 juSi164 КСН-119 (ed3) с использованием 30 мин воздействия света в соответствии со стандартным протоколом , описанным в разделах 2 и 3. Среди 60 F ₁ пластин , соответствующих 120 мутагенезу гаплоидных геномов, мы нашли 8 F ₁ пл...

Обсуждение

Здесь мы опишем подробно процедура оптогенетика мутагенеза с использованием His-mSOG выражается в зародышевой линии и представляют собой пример малого масштаба вперед генетического экрана. По сравнению со стандартным химического мутагенеза, этот оптогенетика метод мутагенеза имеет не?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K