でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

要約

遺伝的にコードされたヒストンminiSOGは、青色光依存的にゲノムワイドな遺伝変異を誘発します。この突然変異誘発法は、高速で、単純な有毒化学物質の自由、およびフォワード遺伝子スクリーニングおよび導入遺伝子組込みに適しています。

要約

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

概要

フォワード遺伝子スクリーニングは、広くそのような線虫（C.エレガンス^）1などのモデル生物において様々な生物学的プロセスを破壊する遺伝子変異体を生成するために使用されてきました。このような変異体の分析は、機能的に重要な遺伝子およびそれらのシグナル伝達経路^1,2の発見につながります。 C.で伝統的に、突然変異誘発エレガンスは、変異原性化学物質、放射線、またはトランスポゾン^2を用いて達成されます。このようなメタンスルホン酸エチル（EMS）とN -エチル- Nの -nitrosourea（ENU）などの化学物質がヒトに対して毒性があります。ガンマ線または紫外線（UV）放射線変異誘発特別な装置を必要とします。そして、このような突然変異誘発株^3、などのトランスポゾン活性株は、保守時に不必要な突然変異を引き起こす可能性があります。我々は遺伝的にコード光増感剤^4を用いて、遺伝的変異を誘発するための簡単なアプローチを開発しました。

活性酸素種（ROS）DNA ^5に損傷^を与えることができます。ミニ一重項酸素発生器（miniSOG）がLOV（光、酸素、及び電圧）2 ⁶フォトトロピンシロイヌナズナのドメインから設計された106個のアミノ酸の緑色蛍光タンパク質である。青色光（〜450 nm）のに曝されると、miniSOG ROSは、すべての細胞に存在する補因子^6-8としてFL AVINモノ、と一重項酸素を含む生成されます。我々は、ヒストン-72、CのC末端にminiSOGをタグ付けすることによって彼の-mSOG融合タンパク質を構築しましたヒストン3のエレガンス変異体は、私たちはCの生殖細胞系列に彼-mSOGを表現するために単一コピーの導入遺伝子^9を生成しましたエレガンス。暗闇の中で、通常の培養条件の下では、彼の-mSOGトランスジェニックワームは、通常のひなのサイズと寿命^4を持っています。青色LEDの光に曝されると、彼の-mSOGワームは、それらの子孫⁴間の遺伝的変異を生成します。誘導された突然変異のスペクトルは、Gなどのヌクレオチド変化を含む：TからC：AとG：CからC：G、および小chromoso私は^4を欠失。この突然変異誘発手順は実行が簡単で、かつ最小限のラボの安全設定が必要です。ここでは、LED照明のセットアップと光遺伝学突然変異誘発のための手順について説明します。

プロトコル

LEDイルミの1建設

注：必要なLED装置は、材料のリストにまとめられています。全体LEDセットアップは小さく、我々はそれがワーム⁴の露光量を制御するために、暗い部屋に置くことをお勧めしますが、ラボのどこにでも配置することができます。

1. ケーブル（ 図1A、D）でコントローラにLEDを接続します。
2. BNCケーブルでデジタルファンクションジェネレータ/アンプ（ 図1A、C、D）にコントローラを接続します。
3. カスタムホルダー（ 図1A）を使用して、ステージ上のLEDライト10センチ修正。
   注：我々は、金属部品とホルダーを作りました。
4. 部分的にLED照明のセットアップをカバーしますが、ワームが病気になり、熱の蓄積（ 図1B）を 、避けます。
   注：私たちは、オープントップとボトム（ 図1A）とのカスタムメイドのハードプラスチック製のカバーを使用します。カバーは、突然変異誘発、それ自体のために必要とされていませんが、トン使用されていますO周囲に青色光の不要な露出を制限。私たちは、ワームの過熱を防止するために、LEDセットアップ完全に（ 図1B）を覆わないように助言します。
5. レーザー保護メガネを着用してください。
   注：光は非常に明るいですので、私たちは、レーザー保護メガネを着用してください。サングラスも同様に動作する可能性があります。
6. LEDコントローラのレバースイッチ」のIntを。」連続照明（ 図1D）および最大電力（ 図1C）の65％に設定します。
7. ワームは、製造業者のプロトコルを使用して配置され、ステージ上の青色光の強度を測定するための光度計を使用してください。セットアップは、連続的な照明の下で2.0ミリワット/ mm ²と^を与えます。

2.ブルーライト治療

注：[miniSOG-3'UTR（TBB-2）:: Pmex-5-HIS-72 + CB-UNC-119（+）]株CZ20310 juSi164を使用して、UNC-119（ED3）III ⁴株が利用可能です。線虫遺伝学センター（CGCでは、http：//www.cgc.cbs.umn.edu/）。

1. E.と標準線虫の増殖培地（NGM）プレート上に暗闇の中のHis-mSOG株を維持標準プロトコル^10,11以下の大腸菌 OP50。
   注：周辺光の下では、juSi164含有株は自然発生率⁴以上の突然変異率を表示しません。ハロゲンランプと解剖スコープを使用してルーチン歪み通路は、一般的に、同様の突然変異を引き起こすことはありません。それにもかかわらず、注意が標準暗い内部のインキュベーター中で株を維持、またはホイルで株をカバーし、例えば 、光への不要な暴露を避けるために注意すべきです。不必要な変異は時間をかけて蓄積する場合には、それを受信した後、株のアリコートを凍結することをお勧めします。
2. ワームに妊娠若年成人（約12時間後にL4）の動物を選んで^11を選択^します。
   注：古い動物は低いひなサイズを有することができる若い動物は、より少ない変異原効果^4を示します。
3. フィルタpをカットAPERは25ミリメートル×25 mm角の穴が60ミリメートルプレートに適合し、播種していないプレート（ 図1E）上に配置します。
   注：正方形のパンチを使用することができるが、パンチの大きさが正確である必要はありません。
4. プレート上の四角い穴の中にワームを制限するために均等にろ紙上の100mMのCuCl ₂の100μLをドロップします。
5. 妊娠若年成人雌雄同体の所望の数を選択してください（例えばステップ3を参照）とのCuCl ₂板の中央に移します。
6. レーザー保護メガネを着用してください。
7. LEDとファンクション・ジェネレータをオンにします。
8. LEDコントローラのレバースイッチの内線を。」関数発生器（ 図1D）によってそれを制御します。
9. 最大電力の65％で、コントローラおよび正弦波、4ヘルツ（ 図1C）などのファンクション・ジェネレータを設定します。
10. の下にステージ上で蓋をせずにステップ2.5からのCuCl ₂プレートを置きます （ 図1A/強いです>）。
11. 30分間の青色光で動物を照らします。
12. P ₀としてシードのプレートに健康探してワームを転送します。
    注：P ₀の所望の数が画面の種類によって異なります。例えば、ステップ3を参照してください。 P ₀のワームは、光処理後すぐに調整されていないように見えることがあり、時間の経過とともに回復します。
13. インキュベーター内または暗闇の中で箔を使用して覆われたワームをキープ。そしてそれらの子孫^2,10の間で希望の表現型をスクリーニングを開始するための標準的な手順に従ってください。

前方遺伝画面の3例

注：これはLEDや歪みが機能しているかどうかを確認するために120半数体ゲノムを有するクローン画面の例である図2は、手順の概略を示しています。

1. 【1日目】青色光処理後、P ₀としてOP50とNGMプレート上に5人の健常探してワームを選ぶ20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを1産卵しましょうD（「1日目」板）。
2. [2日目]新しいシードされたプレート上に転送P _0（ '2日目」板）。
3. [3日目]、それらを燃焼させることによって「2日目」板にP _0を選択し、殺します。
4. 【Day4] '1日目」のプレートから30産卵期の若い成人F _1を選択し、個々のプレート（' 1日目」の30 F ₁プレート）上に転送します。
5. 「2日目」板用【Day5]を繰り返し、ステップ3.4（「2日目」の30 F ₁のプレート）。
6. 【Day7-9]彼らが大人になる、標準的な実体顕微鏡下でのWT株（ 図3A）と比較して、異常な形態および/またはF ₂ワームの動作を確認してください。
   注：それは高い浸透と劣性であるF ₂間で同じ表現型を持つワームの約四分の一遺伝変異が表示されます。しかし、いくつかの変異体は、ゆっくりと成長および/または部分的な浸透度を示すことができます。したがって、変異体未満の四半期に見つけることができる可能性がありますプレート。
7. 個別に見える表現型とワームを選択し、次の世代の表現型の遺伝を確認してください。

体外導入遺伝子の統合の4例

1. [72 Pmex-5-HIS-:: miniSOG-3'UTR（TBB-2）+ CB-UNC-119（+）] CZ20310 juSi164への関心のDNAを注入し、UNC-119（ED3）とを有するトランスジェニックワームを準備標準的な注入プロトコル^12,13以下の低透過率（10〜30％）。
   注：別の方法として、確立された染色体外アレイはjuSi164株に交差することができます。 juSi164ための遺伝子型決定を回避するために、juSi164ヘテロ接合体は、効率が低下する可能性があるが、P ₀として使用することができます。 juSi164ための遺伝子型決定方法は、第5章で説明されています。
2. [1日目]ステップ2で説明したように青色光とP ₀として〜20トランスジェニック動物を扱います。
   注：詳細P ₀のワームは、TRに応じて必要とされます ansmission率。導入遺伝子は、表現型または共射出マーカー^12,13によって同定することができます。
3. 、個々のプレート上に10 P ₀探して健康を選んで20℃のインキュベーターでそれらを維持し、それらを（P ₀プレート）数日間卵を産むしましょう
4. 【Day4]シングルアウト20トランスジェニックF ₁個々のプレート上に各P ₀のプレートからワーム、彼らは卵を産むしましょう。 （20 F _1×10 P ₀プレート=合計で200 F ₁プレート。）
5. 【Day7] Fを> 75％のF ₂を有する導入遺伝子を持つ₁プレートを検索します。
6. > 75％の透過率F ₁プレート（F ₂板）から5トランスジェニック動物を選択してください。
7. 【Day10]潜在的な統合されたラインとして100％の透過率とF ₂のプレートを保管してください。
8. メンデル分離を確認し、潜在的なバックグラウンドの変異を削除するには、標準的な手順^10を使用して、潜在的な統合された行を異種交配。

ル "> 5。ジェノタイピング

1. 溶解20は、標準的なプロトコル^14を使用して^、溶解緩衝液中F ₂ワームを外部交配しました。
2. 標準プロトコル¹⁴以下の58℃のアニーリング温度でMosSCI挿入^{9、juSi164、（} 表1）のためのプライマーを用いてPCRを行います。
   注：UNC-119（ED3）は、次のステップ5.4および5.5に救出導入遺伝子（juSi164）を除去した後、非協調行動によって検出することができるので、UNC-119（ED3）の遺伝子型が不要です。
3. アガロースゲル電気泳動^15を実行し、juSi164ためのWTを見つけるために、バンドのサイズ（ 表1）を調べます。
4. F ₂子孫は、UNC-119（ED3）の存在にワームを麻痺しているかどうかを調べます。
5. 非協調ワームはステップ5.4で発見された場合は、1つのいくつかのnonuncoordinatedワームは、次の世代内のすべてのnonuncoordinatedワームを取得します。

結果

私たちは8 F ₁のプレートを見つけ、120変異誘発半数体ゲノムに対応する60 F ₁のプレートのうち、第2条及び3に記載されている標準的なプロトコルに従って、30分間の露光を用いて、（ED3）CZ20310 juSi164 UNC-119とフォワード遺伝学的スクリーニングを行いましたこのようなボディサイズの欠陥（ 図3B）、非協調運動（ 図3C）、...

ディスカッション

ここで、我々は彼の-mSOGを使用して、光遺伝学の突然変異誘発の詳細な手順を説明する生殖細胞系列で発現し、小規模前方遺伝画面の例を提供します。標準的な化学的突然変異誘発と比較して、この光遺伝学突然変異誘発方法は、いくつかの利点を有します。第一に、それによって離れて、このようなEMS、ENUなどの有害化学変異誘発物質からラボの人材を維持し、紫外線（TMP / UV）とトリメチ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K