Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Özet

Genetik olarak kodlanmış histon miniSOG mavi ışığa bağımlı bir şekilde genom kalıtsal mutasyonlara neden olur. Bu mutajenez yöntemi, hızlı, basit toksik kimyasalların serbest ve ileri genetik tarama ve transgen entegrasyonu için çok uygundur.

Özet

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Giriş

Ileri genetik ekranlar yaygın olarak Caenorhabditis elegans (C. ^{elegans: 1)} gibi model organizmaların çeşitli biyolojik süreçleri bozarak genetik mutantlarını üretmek için kullanılmıştır. Bu tür mutantlar analizleri işlevsel olarak önemli genlerin keşfi yol ve sinyalizasyon ^1,2 yolaklarıyla. Geleneksel olarak, C. mutagenez elegans mutajenik kimyasallar, radyasyon, veya transpozonlar ² kullanılarak elde edilir. Örneğin etil metansülfonat (EMS) ve N-etil-N -nitrosourea (TRK) insanlar için toksik olduğu gibi kimyasalları; gama ışını ya da ultraviyole (UV) radyasyon mutagenez özel ekipman gerektirir; ve Mutator suşları ³ gibi transpozon aktif suşları, bakım sırasında gereksiz mutasyonlara neden olabilir. Biz genetik olarak kodlanmış foto ⁴ kullanılarak kalıtsal mutasyonlar ikna etmek için basit bir yaklaşım geliştirdik.

Reaktif Oksijen Türleri (ROS) DNA ⁵ zarar verebilir.Mini Singlet Oksijen Jeneratörü (miniSOG) DL (Işık, Oksijen ve Voltaj) için tasarlanmış olan 106 amino asit Arabidopsis phototropin 2 ⁶ etki bir yeşil floresan protein. Mavi ışık (~ 450 nm), miniSOG maruz kalma üzerine ROS bütün hücrelerde mevcut olan bir kofaktör ^6-8 olarak fl avin mononükleotid singlet oksijen de dahil olmak üzere oluşturur. Bu histon-72, bir C, C-terminaline miniSOG etiketleyerek bir His-MSOG füzyon proteinini inşa Histon 3. elegans varyantı Bunun C tohum çizgisinden Onun-MSOG ifade etmek için bir tek kopya transgen ⁹ oluşturulan elegans. karanlıkta normal kültür koşulları altında, His-MSOG transgenik solucanlar, normal kuluçka büyüklüğü ve ömrü ⁴ var. Mavi LED ışığına maruz kalma üzerine, His-MSOG solucanlar soylarına ⁴ arasında kalıtsal mutasyonlara üretir. T: C: A ve G: C C: G ve küçük chromoso indüklenen mutasyon spektrumu, G gibi nükleotid değişiklikleri içerirBana ⁴ silmeleri. Bu mutagenez prosedürü gerçekleştirmek için basit ve minimal laboratuvar güvenliği kurulum gerektirir. Burada, optogenetic mutagenez için LED aydınlatma kurulum ve prosedürler açıklanmaktadır.

Protokol

LED Aydınlatıcı 1. İnşaat

NOT: Gerekli LED ekipman Malzeme Listesi'nde özetlenmiştir. Tüm LED kurulum küçük ve biz solucanlar ⁴ ışık pozlama kontrolü için karanlık bir odada yerleştirilmesi önerilir rağmen, laboratuarda herhangi bir yere yerleştirilebilir.

1. Kablolar (Şekil 1A, D) ile bir denetleyiciye LED bağlayın.
2. Bir BNC kablosu (Şekil 1A, C, D) ile bir dijital fonksiyon jeneratörü / amplifikatör kontrolörü bağlayın.
3. Özel bir tutucu (Şekil 1A) kullanarak aşamada yukarıda LED ışık 10 cm düzeltildi.
   NOT: Biz metal parçalar ile tutucu yaptı.
4. Kısmen LED aydınlatma kurulum Kapak, ancak solucanlar hasta ediyor ısı birikimini (Şekil 1B), kaçının.
   NOT: Açık Üst ve alt (Şekil 1A) ile bir ısmarlama sert plastik kapak kullanın. Kapak mutagenez kendisi için gerekli değildir, ancak t kullanılano çevreye mavi ışık gereksiz maruz kalma sınırı. Biz solucan aşırı ısınmasını önlemek için LED kurulumu tamamen (Şekil 1B) kapsamaz tavsiye ederiz.
5. lazer koruyucu gözlük kullanın.
   NOT: Işık çok parlak olduğu için biz lazer koruyucu gözlük. Güneş de çalışabilir.
6. LED kontrolör kolu Anahtarı 'Int.' ve sürekli aydınlatma (Şekil 1D) için maksimum güç (Şekil 1C)% 65 olarak ayarlayın.
7. solucanlar üreticinin protokolü kullanılarak yerleştirilir sahnede mavi ışık yoğunluğunu ölçmek için bir fotometre kullanın. Kurulum sürekli aydınlatma altında 2.0 mW / mm ² verir.

2. Mavi Işık Tedavisi

NOT:. [CB-unc-119 (+) Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) +] unc-119 (ED3) III ⁴ streyn mevcuttur suşu CZ20310 juSi164 kullanın Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC de http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. E. standart nematod büyüme ortamı (NGM) karanlıkta His-MSOG gerginlik korumak plakalar E. coli OP50 standart bir protokol ^10,11 aşağıdaki.
   NOT: Ortam ışığı altında, juSi164 ihtiva-eden suşlar kendiliğinden oranı ⁴ üzerinde bir mutasyon oranını görüntüler yok. genellikle de mutasyona neden olmayan bir halojen lamba ile bir diseksiyon kapsamı kullanarak rutin zorlanma geçit. Bununla birlikte, bakım standart karanlık iç inkübatör suşları tutmak veya folyo ile suşları kapsayan, örneğin ışığa maruz kalmasını gereksiz önlemek için alınmalıdır. Gereksiz mutasyonlar zamanla birikir durumda aldıktan sonra zorlanma hacimde dondurmak için tavsiye edilir.
2. Gebe genç yetişkin almak bir solucan (yaklaşık 12 saat sonrası L4) hayvanlar ¹¹ seçin.
   NOT: Büyük hayvanların düşük kuluçka boyutuna sahip olurken genç hayvanlar, daha az mutajenik etkisi ⁴ göstermektedir.
3. Bir filtre p Cutaper 25 mm x 25 mm kare delik olan 60 mm plaka uyacak ve bir dereceye giremeyen plaka (Şekil 1E) üzerine yerleştirin.
   NOT: Bir kare zımba kullanılabilir, ancak bu zımbanın büyüklüğüne hassas olması gerekmez.
4. Plaka üzerinde kare deliğin içindeki solucanlar kısıtlamak için eşit filtre kağıdı üzerinde 100 mM CuCl ₂ 100 mcL bırakın.
5. Gebe genç yetişkin çift cinsiyetli istenilen sayıda (bir örnek için Adım 3) almak ve CuCl ₂ plakanın merkezine transfer.
6. Lazer koruyucu gözlük kullanın.
7. LED ve fonksiyon jeneratörü AÇIN.
8. LED kontrolör kolu Anahtarı 'Ext.' fonksiyon üreteci (Şekil 1D) tarafından kontrol etmek.
9. Maksimum güç% 65 denetleyicisi ve sinüs dalga 4 Hz (Şekil 1C) olarak işlev jeneratör ayarlayın.
10. LED (Şekil 1A sahnede bir kapaksız Adım 2.5 den CuCl ₂ tabak yerleştirin/ Strong> ').
11. 30 dakika boyunca mavi ışıkla hayvanları aydınlatır.
12. P ₀ olarak seribaşı plaka sağlıklı görünen solucanlar aktarın.
    NOT: P ₀ istenen numarası ekranın türüne bağlıdır. Örnek için Adım 3'e bakın. P ₀ solucanlar ışık tedavisi hemen sonra koordinasyonsuzluk görünebilir ve zamanla iyileşir.
13. bir kuluçka veya karanlık folyo kullanarak kapalı solucanlar tutun; ve onların döl ^2,10 arasında istenen fenotipleri tarama başlamak için standart prosedürü izleyin.

Bir İleri Genetik Ekran 3. Örnek

Not:. Bu LED ve zorlanma çalışma olup olmadığını kontrol etmek 120 haploid genomlar ile klonal ekranın bir örneği Şekil 2 prosedürün şemasını göstermektedir.

1. [Day1] mavi ışık tedavisinden sonra, P ₀ olarak OP50 ile NGM plaka üzerine beş sağlıklı görünümlü solucanlar almak 20 ° C inkübatör tutmak ve bunları 1 için yumurtalarını izind ( 'DAY1' plaka).
2. [Day2] Yeni numaralı seribaşı plaka üzerine Transferi P ₀ ( 'DAY2' plaka).
3. [Day3] seçin ve yakarak 'DAY2' plaka üzerinde P ₀ öldürmek.
4. [Day4] 'DAY1' plaka 30 gebe genç erişkin F ₁ Pick up ve bireysel plakalar ( 'DAY1' için 30 F ₁ tabak) üzerine aktarabilirsiniz.
5. 'DAY2' plaka için [Day5] Adımı tekrarlayın 3.4 ( 'Day2' için 30 F ₁ tabak).
6. Onlar yetişkin olunca [Day7-9] standart stereomikroskop altında anormal morfolojiye ve / veya WT suşu (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında F ₂ solucanlar davranışını kontrol edin.
   NOT: yüksek penetrans ile resesif F ₂ arasında aynı fenotipe sahip solucanlar yaklaşık dörtte bir kalıtsal mutasyon görüntülenir. Bununla birlikte, bazı mutantlar yavaş büyür ve / veya kısmi bir penetrans gösterebilir. Nedenle, mutantların az dörtte bir bulunabilir olması mümkündürplaka.
7. ayrı ayrı görünür fenotipleri ile solucanlar almak ve gelecek nesil fenotip kalıtım kontrol edin.

bir kromozom dışı transgen entegrasyon 4. Örnek

1. Bir sahip CZ20310 juSi164 ilgi konusu DNA'yı enjekte [Pmex-5-His-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) hazırlamak transgenik solucanlar standart bir enjeksiyon protokolü ^12,13 aşağıdaki düşük iletim hızı (% 10-30).
   NOT: Alternatif olarak, kurulan ekstrakromozomal diziler juSi164 suşları içine geçilebilir. JuSi164 için genotipleme önlemek için, juSi164 heterozigot etkinliği azalmış olabilir, ancak P ₀ olarak kullanılabilir. JuSi164 için genotipleme yöntemi Bölüm 5'te tarif edilmektedir.
2. Aşama 2'de tarif edildiği gibi [Day1] ~, mavi ışık ile P ₀ 20 olarak transgenik hayvanların tedavi edin.
   NOT: Daha fazla P ₀ solucanlar tr bağlı olarak gerekli olan ansmission oranı. Transgenlerin fenotipleri veya ko-enjeksiyon işaretleyici ^12,13 ile tespit edilebilir.
3. Bireysel plakalar üzerine 10 sağlıklı görünümlü P ₀ pick 20 ° C inkübatör tutmak ve onları bir kaç gün (P ₀ plakaları) için yumurtalarını izin
4. [Day4] Tek: 20 transgenik F ₁ bireysel plakalar üzerine her P ₀ plaka solucanlar ve onları yumurtalarını edelim. (20 F ₁ x 10 P ₀ tabak = toplam 200 F ₁ tabak.)
5. [Day7] F>% 75 F ₂ olan transgenlerin ₁ tabak bulun.
6. F>% 75 iletim hızı ₁ tabak (F ₂ tabak), beş transgenik hayvanlar seçin.
7. [Day10] F potansiyel entegre çizgiler olarak% 100 iletim hızı ile ₂ tabak tutun.
8. Mendel ayrımını kontrol etmek ve potansiyel arka plan mutasyonları kaldırmak için standart bir prosedür ¹⁰ kullanılarak potansiyel entegre çizgiler outcross.

le "> 5. Genotiplendirme

1. Lyse 20 standart bir protokol ¹⁴ kullanılarak lizis tamponu F ₂ solucanlar outcrossed.
2. Standart bir protokol ¹⁴ Aşağıdaki 58 ° C'lik bir tavlama sıcaklığı ile MosSCI yerleştirilmesi ⁹ juSi164 (Tablo 1) primerleri kullanılarak PCR gerçekleştirin.
   NOT: unc-119 (ED3) Aşağıdaki Adımlar 5.4 ve 5.5 tahlisiye transgen (juSi164) çıkardıktan sonra koordinasyonsuzluk davranış tarafından tespit edilebilir, çünkü unc-119 (ED3) genotipinin gereksizdir.
3. Agaroz jel elektroforezi ¹⁵ çalıştırın ve juSi164 için WT bulmak için bant boyutları (Tablo 1) inceleyin.
4. F ₂ döl nedeniyle unc-119 (ED3) varlığına solucanlar felç olup olmadığını inceleyin.
5. koordinasyonsuzluk solucanlar adım 5.4 bulunursa, tek birkaç nonuncoordinated solucanlar nesil tüm nonuncoordinated solucanlar elde etmek.

Sonuçlar

Biz 120 Mutagenezli haploid genomlar karşılık gelen 60 F ₁ tabak arasında Bölüm 2 ve 3'te açıklanan standart protokol izlenerek 30 dakika ışığa maruz kullanarak CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) ile bir ileri genetik ekran gerçekleştirilen biz 8 F ₁ tabak bulundu F vücut büyüklüğü defekt (Şekil 3B), koordinasyonsuzluk hareketi (Şekil 3C), ve yetişkin öldürücülüğü (Şekil 3D) ol...

Tartışmalar

Burada, Optogenetic mutagenez ayrıntılı bir prosedür His-MSOG germline ifade ile ve küçük ölçekli bir ileri genetik ekranının bir örneğini sağlar tarif eder. standart kimyasal mutajenezi ile karşılaştırıldığında, bu Optogenetic mutajenez yöntemi, bir çok avantaja sahiptir. Öncelikle, bu sayede uzak gibi EMS, TRK gibi toksik kimyasal mutajen gelen laboratuar personelinin tutmak ve ultraviyole ışık (TMP / UV) ile Trimethylpsoralen, zehirsizdir. İkinci olarak, mutagenez deney prosedürü, p

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K