Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Summary

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Abstract

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Introduction

מסך גנטי קדימה כבר בשימוש נרחב כדי ליצור מוטציות גנטיות לשבש תהליכים ביולוגיים שונים באורגניזמים מודל כגון elegans Caenorhabditis (ג elegans) ^1. ניתוח של מוטציות כאלה להוביל לגילוי של גנים חשובים מבחינה תפקודית והאיתות שלהם מסלולי ^1,2. באופן מסורתי, mutagenesis ב C. elegans מושגת באמצעות כימיקלים מוטגנים, קרינה, או transposons ^2. כימיקלים כגון methanesulfonate אתיל (EMS) ו- N -ethyl- -nitrosourea N (ENU) הם רעילים לבני אדם; קרני גאמא או אולטרה סגול (UV) mutagenesis קרינה דורש ציוד מיוחד; זני transposon-פעיל, כגון זנים המוטטורי ^3, יכולים לגרום מוטציות מיותרות במהלך תחזוקה. פיתחנו גישה פשוטה לגרום מוטציות תורשתיות באמצעות פוטוסנסיטייזר גנטית בקידוד ^4.

(Reactive oxygen species ROS) יכול לגרום נזק לדנ"א ^5.מחולל חמצן גופיה מיני (miniSOG) הוא חלבון פלואורסצנטי ירוק של 106 חומצות אמינו כי תוכננה מן LOV (אור, חמצן, ואת מתח) תחום של ארבידופסיס phototropin 2 ^6. בחשיפה לאור כחול (~ 450 ננומטר), miniSOG מייצר חמצן גופיית ROS כולל עם fl יבין mononucleotide בתור פקטור ^6-8, אשר שוהה בכל התאים. בנינו חלבון היתוך-mSOG שלו על ידי תיוג miniSOG אל C- הסופי של היסטון-72, ג elegans וריאנט של היסטון 3. אנחנו שנוצר transgene חד עותק ⁹ להביע-mSOG שלו ב germline של ג elegans. בתנאי תרבות נורמלים בחושך, התולעים המהונדסים-mSOG שלו יש גודל גוזלים נורמלי תוחלת חי ^4. בחשיפה לאור LED כחול, התולעים שלו-mSOG לייצר מוטציות תורשתיות בקרב הצאצאים שלהם ^4. הספקטרום של מוטציות מושרות כולל שינויי נוקלאוטיד, כגון G: C ל- T: A ו- G: C ל- C: G ו- chromoso הקטןלי מחיקות ^4. הליך mutagenesis זה הוא פשוט לביצוע, ודורש התקנת בטיחות במעבדה מינימאלית. כאן, אנו מתארים את התקנת תאורת LED ונהלי mutagenesis optogenetic.

Protocol

1. בנייה של ה- LED הפנס

הערה: ציוד LED הנדרש מסוכם הרשימה של חומרים. ההתקנה LED כולו הוא קטן והוא יכול להיות ממוקם בכל מקום במעבדה, אם כי מומלץ להשתמש בו יוצב בחדר חשוך לשלוט חשיפה לאור של תולעים ^4.

1. חבר את LED לבקר עם כבלים (איור 1 א, ד).
2. חבר את בקר מגבר גנרטור / פונקציה דיגיטלי באמצעות כבל BNC (איור 1 א ', ג', ד).
3. תקן 10 ס"מ הנורית מעל לבמה בעזרת בעל מותאם אישית (איור 1 א).
   הערה: עשינו בעל עם חלקי מתכת.
4. מכסה את התקנת תאורת LED חלקית, אבל למנוע הצטברות חומה (איור 1 ב '), מה שהופך תולעים חולים.
   הערה: אנו משתמשים כיסוי פלסטיק קשיח מחוייט עם העליון פתוח והתחתון (איור 1 א). הכיסוי אינו נדרש עבור mutagenesis עצמו, אך משמש to להגביל את החשיפה המיותרת של האור הכחול אל הסביבה. אנו ממליצים לא לכסות את התקנת LED לחלוטין (איור 1B) כדי למנוע התחממות יתר של התולעים.
5. יש להרכיב משקפיים בלייזר-מגן.
   הערה: אנו להרכיב משקפיים בלייזר-מגן מפני שהאור הוא בהיר מאוד. משקפי שמש יפעלו גם כן.
6. החלף את הידית של הבקר LED ל 'Int.' עבור תאורה רציפה (1D איור) ולהגדיר אותו ב 65% של הכוח המרבי (תרשים 1C).
7. השתמש פוטומטר כדי למדוד את עוצמת האור הכחולה על הבמה שבו התולעים ממוקמים באמצעות הפרוטוקול של היצרן. ההתקנה נותנת 2.0 mW / ² מ"מ תחת תאורה רציפה.

2. טיפול תכלת

הערה: השתמש זן CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) III ⁴ זן זמין. במרכז גנטיקה Caenorhabditis (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

1. שמירה על זן-mSOG שלו בחושך על מדיום הגידול נמטודות סטנדרטי (NGM) צלחות עם E. coli OP50 בא פרוטוקול סטנדרטי ^10,11.
   הערה: תחת אור הסביבה, זנים המכילים juSi164 אינם מציגים שיעור מוטציות מעל שיעור ספונטני ^4. מעבר למתח שיגרתי באמצעות היקף ניתוחים עם מנורת הלוגן בדרך כלל אינו גורם מוטציות גם כן. עם זאת, יש להיזהר כדי למנוע חשיפה מיותרת לאור, למשל, שמירה על זני חממה כהה בתוך סטנדרטית, או כיסוי הזנים עם רדיד. מומלץ להקפיא aliquots של המתח לאחר שקיבל אותה במקרה מיותר מוטציות לצבור לאורך זמן.
2. פיק הרה להולדת מבוגרים צעירים (כ 12 שעות לאחר-L4) חיות עם תולעת לאסוף ^11.
   הערה: בעלי חיים צעירים להראות פחות מוטגנים אפקט ^4, בעוד בעלי חיים מבוגרים יכולים להיות גודל גוזלים נמוך.
3. חותכים p מסנןaper כדי להתאים צלחת 60 מ"מ עם 25 מ"מ x 25 מ"מ חור מרובע ומניחים על צלחת unseeded (איור 1E).
   הערה: אגרוף מרובע ניתן להשתמש אך בגודל של אגרוף לא חייב להיות מדויק.
4. זרוק 100 μL של 100 מ"מ CuCl ₂ על נייר הסינון שווה להגביל תולעים בתוך החור המרובע על הצלחת.
5. פיק מספר רצוי של הרמפרודיטים מבוגרים צעירים הרה להולדת (ראה שלב 3 עבור דוגמא) ולהעביר למרכז הצלחת ₂ CuCl.
6. יש להרכיב משקפיים בלייזר מגן.
7. להדליק את הנורית ואת מחולל פונקציה.
8. החלף את הידית של בקר LED ל 'שלוחה.' כדי לשלוט בו על ידי מחולל אותות (1D איור).
9. הגדר את בקר ב 65% של הכוח המרבי ואת מחולל פונקציה כמו גל סינוס, 4 הרץ (תרשים 1C).
10. מניחים את הצלחת ₂ CuCl משלב 2.5 ללא מכסה על הבמה תחת LED (איור 1 א </ Strong>).
11. להאיר את החיות עם אור כחול עבור 30 דקות.
12. העבר מחפשים תולעים בריאים לצלחת זורעי ע _0.
    הערה: המספר הרצוי של P ₀ תלוי בסוג של המסך. ראה שלב 3 עבור דוגמה. תולעי P ₀ עשויים להיראות חסר קואורדינציה מייד לאחר טיפול אור יתאוששו לאורך זמן.
13. שמור תולעים המכוסים באמצעות רדיד באינקובטור או בחושך; ופעל לפי הנוהל המקובל להתחיל הקרנה פנוטיפים רצוי בקרב הצאצאים שלהם ^2,10.

דוגמא 3. של מסך גנטי קדימה

הערה:. זוהי דוגמא של המסך המשובט עם 120 גנומים הפלואידים לבדוק אם LED והמתח עובדים איור 2 מראה סכמטי של ההליך.

1. [Day1] לאחר טיפול באור כחול, לאסוף חמישה תולעים ובריאים לצלחת NGM עם OP50 כמו P _0, לשמור אותם בתוך חממת 20 ° C, ולתת להם להטיל ביצים עבור 1ד (צלחת 'Day1').
2. [יום 2] העברת P ₀ לצלחת חדשה זורעת (הצלחת 'יום 2').
3. [Day3] פיק ולהרוג P ₀ על הצלחת 'יום 2' על ידי שריפת אותם.
4. [Day4] פיק 30 בוגרים צעירים הרה להולדת F ₁ מהצלחת 'Day1' ולהעבירם לצלחות בודדים (30 צלחות F ₁ עבור 'Day1').
5. [Day5] חזור על שלב 3.4 עבור הצלחת 'יום 2' (30 F ₁ צלחות עבור 'יום 2').
6. [Day7-9] בדוק את מורפולוגיות ו / או התנהגות חריגה של F ₂ תולעים בהשוואה לזן WT (איור 3 א) תחת סטראו רגיל כאשר הם הופכים למבוגרים.
   הערה: מציג מוטציה תורשתית כרבע תולעים עם אותו הפנוטיפ בין F ₂ כאשר הוא רצסיבי עם חדירות גבוהות. עם זאת, כמה מוטציות עשויות לגדול לאט ו / או להציג חדירות חלקיות. לכן, יתכן כי פחות מרבע של מוטציות ניתן למצוא עלצַלַחַת.
7. פיק תולעים עם פנוטיפים גלויים בנפרד ולבדוק התורשתיות של הפנוטיפ בדור הבא.

דוגמה 4. של אינטגרציה extrachromosomal transgene

1. להזריק את ה- DNA של עניין לתוך CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + CB-UNC-119 (+)] UNC-119 (ed3) ולהכין תולעים מהונדס עם שיעור התמסורת נמוך (10-30%) בעקבות ^12,13 פרוטוקול זריקה רגילה.
   הערה: לחלופין, מערכי extrachromosomal הוקמו ניתן חצו לתוך זני juSi164. כדי למנוע גנוטיפ עבור juSi164, heterozygotes juSi164 עשוי לשמש P ₀ אם כי היעילות להצטמצם. שיטת גנוטיפ עבור juSi164 מתואר בסעיף 5.
2. [Day1] פנקו ~ 20 חיות טרנסגניות ע ₀ עם אור כחול כמתואר שלב 2.
   הערה: תולעי P ₀ פרטים נוספים נחוצים תלוי tr שיעור ansmission. Transgenes ניתן לזהות על ידי פנוטיפים או coinjection סמן ^12,13.
3. פיק 10 מחפש P ₀ בריא לצלחות פרט, לשמור אותם בתוך חממת C 20 °, ולתת להם להטיל ביצים במשך כמה ימים (P ₀ צלחות)
4. [Day4] יחיד מתוך 20 מהונדס F ₁ תולעים מכל צלחת P ₀ לצלחות הפרט ולתת להם להטיל ביצים. (20 F ₁ x 10 P ₀ צלחות = 200 F ₁ צלחות בסך הכל.)
5. [יום 7 ג] מצא F ₁ צלחות עם> 75% F ₂ transgenes שיש.
6. פיק חמש חיות טרנסגניות משיעור העברת 75%> F ₁ צלחות (F ₂ צלחות).
7. [Day10] שמור F ₂ צלחות עם שיעור תמסורת 100% כקווים משולבים פוטנציאליים.
8. Outcross הקווים פוטנציאל המשולבים באמצעות הליך סטנדרטי ¹⁰ לבדוק את פרדת מנדל וכדי להסיר מוטציות רקע פוטנציאליות.

le "> 5. Genotyping

1. Lyse 20 outcrossed F ₂ תולעים חיץ תמוגה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ^14.
2. בצע PCR באמצעות פריימרים עבור MosSCI הכנסת ^9, juSi164, (טבלה 1) עם טמפרטורה חישול של C ° 58 בעקבות פרוטוקול סטנדרטי ^14.
   הערה: אין צורך גנוטיפ UNC-119 (ed3) כי UNC-119 (ed3) יכולים להיות מזוהים על ידי התנהגות לא מתואמת לאחר הסרת transgene ההצלה (juSi164) בשלבים הבאים 5.4 ו -5.5.
3. הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose ¹⁵ ולבחון את הגדלים הלהקה (טבלה 1) כדי למצוא את WT עבור juSi164.
4. בדוק אם צאצאי F ₂ שתקו תולעים בשל קיומו של UNC-119 (ed3).
5. אם תולעים מתואמים נמצאים על צעד 5.4, אחת כמה תולעים nonuncoordinated להשיג את כל התולעים nonuncoordinated בדור הבא.

תוצאות

ביצענו מסך גנטי קדימה עם CZ20310 juSi164 UNC-119 (ed3) באמצעות חשיפה לאור 30 דקות בעקבות פרוטוקול סטנדרטי האמור בסעיפים 2 ו -3 בין 60 צלחות F ₁ המתאים 120 גנומים הפלואידים mutagenized, מצאנו 8 F ₁ צלחות עם F ₂ תולעים מוצגות פנוטיפים גלויים כגון פגם לגודל ג...

Discussion

כאן אנו מתארים הליך מפורט של mutagenesis optogenetic באמצעות שלו-mSOG לידי ביטוי germline ולספק דוגמה של מסך גנטי קדימה בקנה מידה קטן. לעומת mutagenesis כימי סטנדרטי, שיטת mutagenesis optogenetic זה יש מספר יתרונות. ראשית, זה לא רעיל, ובכך שמירה על אנשי המעבדה הרחק מוטאגנים כימיים רעילים כגון EMS, ENU ו trime...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultra High Power LED light source	Prizmatix	UHP-mic-LED-460	460 ± 5 nm
LED controller	Prizmatix	UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier	PASCO	PI-9587C	PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male	THORLABS	CA3136
USB-TTL interface	Prizmatix		Optional
Photometer	THORLABS	PM50 and Model D10MM
Filter paper	Whatman	1001-110
Stereomicroscope	Leica	MZ95
NGM plate			Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0).
Lysis solution			10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K