暴跌冻结:在透射电子显微镜的超微结构和免疫组化研究工具悬架细胞

摘要

此手稿描述了通过透射电子显微镜可视化用混悬剂细胞中易于使用和低成本的冷冻固定方法。

摘要

透射电子显微镜（TEM）是研究细胞超微结构，以本地化的蛋白质和以非常高的分辨率可视化大分子复合物不平凡的工具。但是，要获得尽可能接近原生状态，需要完善的样品保存。与醛常规电子显微镜（EM）固定，比如，不能提供良好的超微结构保存。固定剂的缓慢渗透诱导细胞重组和各种细胞成分的损失。因此，常规EM固定不允许结构和抗原性的瞬时稳定和保存。审查细胞内事件的最佳选择是使用冷冻固定，然后，保持细胞的天然状态的冷冻替代固定方法。高压冷冻/冻干取代，其保留细胞的超微结构的完整性，是最常用的方法，但需要expensi已经装备。这里，易于使用和低成本的冷冻固定方法进行冷冻取代悬浮细胞培养物呈现。

引言

样品制备为任何电子显微镜研究成功的关键。常规EM固定是用于固定的组织或细胞进行透射电子显微镜^（TEM）1的主要方法。首先，醛和四氧化锇用于化学固定在室温下该材料。然后，将材料脱水用有机溶剂，渗透，并包埋在环氧树脂中。此方法取决于固定剂的渗透速率进入细胞。因此，细胞内容物中的工件和提取通常被观察到²个。

冷冻固定显然是细胞结构³保存一个更好的选择，让他们完好。可以使用冷冻固定/冷冻置换方法来获得在薄树脂切片TEM图像⁴的最高质量。这种技术的目的是为了获得玻璃化的双ological样品没有冰晶形成或含有冰晶小到足以不损伤细胞的超微结构。高压冷冻（HPF）和超快速冷冻固定，其也被称为切入冷冻（PF），两种方法来cryofix样品。 HPF在单元固定不动的分子瞬时且避免了由常规EM固定的损害。几种类型的冷冻机和自动替换设备已经开发^5。冷冻机器和消耗品（液氮，标本的载体，等等）是昂贵的，但它们允许生产高品质的电子显微照片^6,7。 PF是已在50年代初采用和在文献中简单和便宜⁸ .During的PF程序，将制备的样品以很快的速度冷冻，得到冰晶尺寸小于3至5nm，描述了一种技术。为此，所述样品是陷入液态制冷剂，如乙烷，丙烷，或乙烷 - 丙烷混合物。自50年代以来，PF的改进已经完成，以使这项技术提供给用户更大的数字。高压冷冻目前冻结大量的各种样品的厚度大于50微米（最多为盘形样品的厚度为200微米^）5的唯一可行的办法，而PF被广泛地用于图像的小物体（<100nm的），如悬浮于无定形冰⁹的薄膜大分子复合物。较大的样品，例如真核细胞，可以通过PF cryofixed，但需要试样保持器，如毛细管铜管或三明治系统^{8，10，11。}

这里，快速，易于使用和可用于各种悬浮细胞培养物的低成本暴跌冷冻/冻干替代技术被呈现。

研究方案

1.福尔瓦网格薄膜的制备

注意:在使用个人防护设备（手套，实验室外套，眼镜）在通风橱下执行氯仿操纵。使用400个目电子显微镜铜网格。与其他类型的网格（其它的网孔尺寸，金和镍网格），冷冻的质量较差。

1. 制备0.3％的聚乙烯醇缩甲醛的氯仿100mL的溶液。允许不搅拌溶解过夜。
2. 把400目在玻璃小瓶中电子microscopycopper网格（直径3.05毫米）（高度为3厘米，直径为2厘米）含丙酮（每平方英寸的孔数）。搅拌与手的圆形运动的玻璃小瓶中。用塑料移液管除去丙酮。允许溶剂蒸发5分钟。通过倾倒它们放到滤纸转移网格和使其干燥5分钟。
3. 通过用无绒布直到发亮/滑擦拭抛光76×26 ^平方毫米的载玻片。
4. 取结晶（直径15厘米，高度:7厘米，容量1200mL）中，并将其填充到用蒸馏水的边缘。通过使玻璃棒表面上两次以除去灰尘清洁水表面。
5. 保持两个手指之间的载玻片上并在几秒钟的聚乙烯醇缩甲醛溶液蘸。拿着它直立的倒杯下干燥5分钟。
6. 当膜是干的，得分载玻片的边缘用锋利的剃刀刀片以限定膜的极限，以从滑动地移位。
7. 深吸一口气，呼气巨资到幻灯片上和电影渲染影片稍微有点不透明，提升其知名度得到下水蒸气层。
   1. 由具有大约30°的角度接触滑动的底部立即浮在薄膜上结晶水的表面。让从滑动膜释放和剥开到结晶器的水表面。轻轻一拉片脱落与镊子，如果需要的话。
8. 轻轻地将栅格面朝下放在膜漂浮在水面上是适当的厚度（约10nm）和没有皱纹的区域。
9. 通过覆盖与约瑟夫纸栅格拿起膜作为它们漂浮在结晶器水面上。
   1. 保持的约瑟夫纸用一只手，触摸约瑟夫纸的一端到膜的一端。等到约瑟夫纸是完全湿透。与粘在网格中取出约瑟夫纸。
10. 放置网格用于在覆盖的培养皿中进行最后干燥并在室温下在使用前储存24个小时。

2.冻结取代介质的制备

注:将四氧化锇（OSO _4）和醋酸铀是危险化学品。处理它们在通风橱而穿着适当的个人防护设备（PPE），其包括实验室外套和手套。 FOLLOW处理的安全警告（OSO _4）和乙酸双氧铀。使用O形环的冷冻管，以避免的OsO ₄的泄漏。

1. 超微结构研究
   1. 把玻璃的OsO ₄安瓿在玻璃烧瓶中。
   2. 通过晃动瓶打破安瓿。
   3. 添加丙酮的适当体积的100％，得到4％的最终浓度。
   4. 搅拌和分配1.5毫升等分试样到1.8毫升离心管。
2. 蛋白质免疫标记
   1. 放置0.05克乙酸双氧铀的在玻璃烧瓶中。
   2. 加入50mL 100％丙酮中。
   3. 搅拌用磁力搅拌器将溶液。当溶液变得澄清，用0.2μm过滤器过滤。
   4. 分配1.5毫升分装成1.8毫升离心管。
      注:事先准备含有冷冻置换介质的冷冻管的切入冷冻过程，并保存在-84℃冷冻机中。反转玻璃烧瓶扔掉₄的OsO安瓿的危险废物。

3.细胞的制备

注:此步骤是该方法成功的关键。对于所有类型的细胞，培养细胞获得细胞的数量表示。离心机中在指定的时间和速度指示管。

1. 为了获得从不同的细胞类型的颗粒的适当的一致性，生长的细胞如下:
   1. 酿酒酵母和粟酒裂殖酵母 ，在5mL最小或完全液体介质的接种酵母。在28℃下，旋转（180 rpm）的孵育过夜。测量在过夜培养物在600nm（OD _600）的光密度。稀释的酵母细胞至0.2在50毫升新鲜的选择性培养基的OD _600。继续在28℃孵育细胞，旋转，以获得1×10 ⁹酵母细胞^7。
   2. 利什曼原虫鞭毛，鲍在5mL的AM介质culate寄生虫用7.5％FCS（胎牛血清）。在24℃，旋转（180 rpm）的孵育过夜。测量过夜培养的OD _600。稀释寄生虫细胞至0.2在50毫升新鲜的选择性培养基的OD _600。继续在24℃下温育细胞，旋转，以获得5×10 ⁸细胞寄生虫^12。
   3. 对于布氏锥虫 ，寄生虫接种在5mL SDM-79培养基含10％FCS和30μg/ mL潮霉素。在27℃下，旋转（180 rpm）的孵育过夜。测量过夜培养的OD _600。稀释寄生虫细胞在50毫升新鲜的选择性培养基的0.2 OD _600。继续在27℃下温育细胞，旋转，以获得5×10 ⁸细胞寄生虫^13。
   4. 对于大肠杆菌 ，接种细菌在5ml含有100μg/ mL氨苄青霉素DYT培养基。在37℃下孵育过夜，旋转（180转）。测量过夜培养的OD _600。稀释的细菌细胞至0.2在50毫升新鲜的选择性培养基的OD _600。继续在37℃下孵育细胞，旋转，以获得5×10 ^10个细菌细胞^14。
      注:过夜孵育后，将细胞在培养可在任一对数或稳定生长期。非常缓慢生长的细胞株可能需要比一晚，或细胞的更大数量的接种更长的温育时间，如凭经验确定。
2. 对于所有的细胞类型，在1500×g下将含有细胞的培养基转移到50ml聚丙烯管中离心3分钟。
3. 除去上清，重悬的所有细胞类型的沉淀在1ml的有关细胞培养基。
4. 离心机中在3900×g下1分钟的微量离心管中的所有细胞类型。彻底去除上清。
5. 置于冰上的细胞。

4。丙烷的液化

注:处理液氮小心。使用包括cryogloves和谷歌的个人防护装备。丙烷是潜在爆炸性，所以在一个通风良好的房间或下通风橱进行液化。禁止明火被允许。

1. 把约150毫升的液体氮的在聚苯乙烯托盘中。放置一个黄铜杯（高度3.6厘米，直径为2厘米，厚1.5毫米）液氮冻结它。不要让液体氮渗入铜杯。
2. 等到泡沫消退，以确保黄铜杯被冻结。
3. 放置成与黄铜杯壁接触连接到所述气缸丙烷软管。
4. 轻轻打开丙烷气缸阀。
   注:在此步骤中，液化丙烷在铜杯。
5. 通过关闭丙烷气​​瓶阀和快速除去气体软管停止液化。
6. 充满液体NI聚苯乙烯托盘从黄铜杯顶部可达5毫米。不要让液氮渗透到黄铜杯中。

5.样品冻结

1. 在聚苯乙烯托盘中放入约200 mL液氮。将小黄铜杯（高1.5厘米，直径2.5厘米，厚度1毫米）放入液氮中。将一个杯子放入一个悬浮液样品中。小心不要混合样品。为此，将样品1放入杯子1，杯子2中的样品2 等 。
2. 通过将尖端浸入液氮中来冻结镊子。
3. 在3.5中获得的颗粒中插入双刃解剖针。
4. 使用镊子，取第一部分制备的形状为400目的铜网显微镜网格。
5. 使用解剖针，将一滴3.5中获得的颗粒放在网格上。尝试不同的液滴尺寸（ 例如 2,5和10μL）。
6. 将镊子保持的电网迅速浸入液态丙烷基因额定在部分4，并搅拌以圆形运动的网格为几秒钟。
7. 迅速用镊子转移冷冻格在5.1节冻结的小黄铜杯。
   注:对于每个样品，进行至少3个格。采取了铜网之前，请务必冻结镊子。

6.冷冻取代

注:四氧化锇是潜在的易失性，所以使用空气净化呼吸器与蒸气墨盒。冷冻在跳水冷冻前液氮固定剂也是一种解决方案。

1. 对于超微结构研究，打开包含在节2.1制备冷冻置换介质的1.8毫升离心管的管。用于免疫定位研究，打开包含在2.2节制备的冷冻置换介质的1.8毫升离心管的管。广场上的冷冻管帽。
2. 通过在液氮中切入其尖端冻结镊子。
3. 迅速取下瓶盖和转移冻结的网格我扎成使用镊子将冷冻管。
4. 把盖子重新拧上冷冻管。
5. 重复该操作对每个样品的每个网格。
6. 关闭所有的帽和搅拌冷冻管与所述手的一个圆周运动，以确保样品在冷冻置换介质。
7. 在冷冻 - 置换处理放置在冷冻管用于在-84℃冷冻机中3天气密箱。

7.样品变暖

1. 超微结构的研究
   1. 携带在聚苯乙烯托盘中的冷冻管（以避免温度的突然上升）到-30℃冷冻机中。将它们放置在-30℃冷冻1个小时。
   2. 放置在-15℃的冰箱中的冷冻管中2小时。放置在4℃下将样品2个小时，然后在室温下30分钟。
   3. 除去用塑料移液管冷冻置换介质。添加约500 100％丙酮的μL。
   4. 搅拌1.8毫升冷冻小瓶与手的一个圆周运动，并迅速倒入含有在玻璃小瓶中的网格（高度为3厘米，直径为2厘米）的丙酮（1.5mL）中。
   5. 冲洗用1mL 100％丙酮的相同冷冻小瓶，以确保已经传送的所有的网格。搅拌与手的圆形运动的冷冻小瓶，倒入离心管的内容到玻璃小瓶中。
   6. 冲洗每个玻璃小瓶用3mL的100％丙酮3次，持续10分钟。
   7. 按照嵌入和包容的操作程序^，15说明。浸渍在丙酮中用增加环氧树脂的浓度（25％，50％和75％）的样品，并嵌入在明胶胶囊中100％环氧树脂的样品。
2. 免疫标记研究
   1. 携带在聚苯乙烯托盘中的1.8毫升离心管（以避免温度的突然上升）到-30℃冷冻机中。
   2. 放置2小时的冷冻管在-30℃冷冻机中。
   3. 在一个-30° C冰箱，搅动冷冻小瓶与手的一个圆周运动，并迅速倒在聚丙烯小瓶（高度5厘米，直径的1.5厘米）的冷冻置换介质。
   4. 用2毫升的新鲜冷冻置换介质的更换冷冻置换介质。
   5. 放置聚丙烯小瓶在-30℃的冰箱中2小时。
   6. 冲洗1个小时聚丙烯小瓶用2mL 100％丙酮中，并为用2mL的100％乙醇1个小时三次。
   7. 按照嵌入和包容的操作程序^，15说明。含浸丙烯酸树脂浓度的增加（25％，50％，在丙酮中75％）将样品和与嵌入在明胶胶囊中100％的丙烯酸树脂的样品。

8.可视化样本

1. 嵌入后，使样品为80nm的超薄切片用超薄切片。对比用2％的柠檬酸铅切片在室温下进行1分钟屁股= "外部参照"> 15。
2. 使用80千伏或120千伏电子显微镜观察部分^15。

结果

在本文中，提出了一种用于超微结构（ 图1和图2）和免疫标记（ 图3）的研究一种易于使用和低成本的暴跌冷冻方法。我们证明，这是没有必要有专用设备冷冻置换程序，该程序升温只需不到6个小时，而不是使用专用系统的24个小时。

PF /冷冻置换方法导致在<...

讨论

TEM是细胞器，细胞，和组织的超微结构观测的有效方法。冷冻固定/冷冻取代是目前两种超微结构和蛋白的抗原性的保存的最佳方法。化学固定剂渗透和行动非常缓慢，从而使结构重组的超微结构²的完全稳定之前。相反，冷冻固定/冷冻置换瞬间稳定蜂窝结构^4。然而，冷冻固定/冷冻替代技术包括了许多限制和困难从而限制了它们的应用范围的。这涉及样品，冷?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11