JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.

Abstract

הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) הוא כלי יוצא דופן לחקר ultrastructure תא, כדי למקם חלבונים ולדמיין מתחמי macromolecular ברזולוציה גבוהה מאוד. עם זאת, כדי להתקרב ככל האפשר אל למצב הטבעי, שימור מדגם מושלם נדרש. קיבוע במיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונאלי (EM) עם אלדהידים, למשל, אינו מספק שימור ultrastructural טוב. החדירה האיטית של fixatives גורמת ארגון מחדש תאים ואובדן מרכיבי תא שונים. לכן, קיבוע EM קונבנציונאלי אינו מאפשר התייצבות מיידית ושימור מבנים antigenicity. הבחירה הטובה ביותר לבחינת אירועים תאיים היא להשתמש cryofixation ואחריו שיטת קיבוע הקפאה-ההחלפה שמחזיקה תאים במצב הטבעי שלהם. בלחץ גבוה הקפאה / להקפיא-החלפה, השומרת על שלמות ultrastructure הסלולר, היא השיטה הנפוצה ביותר, אך דורשת expensive ציוד. הנה, שיטת קיבוע הקפאה קלה לשימוש וזול ואחריו-החלפת הקפאה עבור תרביות תאי השעיה מוצגת.

Introduction

לדוגמא ההכנה היא קריטית להצלחה של כל מחקר במיקרוסקופ אלקטרונים. קיבוע קונבנציונלי EM היה השיטה העיקרית לתיקון רקמות או תאים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) 1. ראשית, אלדהידים ו tetroxide אוסמיום משמשים כדי לתקן את חומר כימי בטמפרטורת החדר. ואז, החומר הוא מיובש עם ממיסים אורגניים, חדרו, ומוטבעים שרף אפוקסי. שיטה זו תלויה בשיעור החדירה של fixatives לתוך התא. כתוצאה מכך, הממצאים והפקת תכני הסלולר בדרך כלל הם נצפו 2.

Cryofixation הוא בבירור אלטרנטיבה טובה יותר לשימור מבנים הסלולר 3, להשאיר אותן ללא פגע. האיכות הגבוהה ביותר של תמונות TEM 4 בסעיפי שרף דקים ניתן להשיג באמצעות שיטת החלפת cryofixation / ההקפאה. מטרת טכניקה זו היא להשיג דו מזוגגתדגימות ological ללא היווצרות גבישי קרח או גבישי קרח המכילים קטנים מספיק כדי לא לפגוע ultrastructure של התאים. בלחץ גבוה הקפאה (HPF) ו cryofixation אולטרה-מהירה, אשר נקרא גם לצלול מקפיא (PF), הן שתי שיטות cryofix דגימות. HPF שמגביל מולקולות בתא מיידי ונמנע את הנזק שנגרם על ידי קיבוע EM קונבנציונאלי. ישנם מספר סוגים של מכונות הקפאה והתקני החלפה אוטומטיות פותחו 5. מכונות ההקפאה ומתכלה (החנקן נוזלי, דגימת ספקים, וכו ') הם יקרים, אבל הם מאפשרים הפקת micrographs אלקטרונים איכותי 6, 7. PF היא טכניקה ששימשה בשנת 1950 המוקדמות והוא מתואר בספרות פשוטה וזולה 8 .During ההליך PF, המדגם מוכן קפוא בקצב מהיר כדי להשיג גבישי קרח במידות פחות מ 3 עד 5 ננומטר. לשם כך, המדגם הואצלל לתוך קריוגן נוזלי, כגון אתאן, פרופאן, או תערובת אתנית- propane. מאז 1950, שיפורים של PF נעשו כדי להפוך את הטכניקה הזו זמינה למספר גדול יותר של משתמשים. הקפאה בלחץ גבוה היא כרגע הדרך קיימא רק להקפיא מגוון רחב של דגימות עבה יותר מ 50 מיקרומטר (עד עובי של 200 מיקרומטר עבור דגימות בצורת דיסק) 5 , ואילו PF נעשה שימוש נרחב על התמונה אובייקטים קטנים (<100 ננומטר ), כגון קומפלקסים macromolecular מושעה בסרט דק של קרח אמורפי 9 . דגימות גדולות יותר, למשל תאים אוקריוטים, יכולים להיות cryofixed על ידי PF, אבל דורש מחזיקי הדגימה, כגון צינורות נחושת נימי או מערכות כריך 8 , 10 , 11 .

הנה, מהיר לשימוש, קל לשימוש ו עלות נמוכה לצלול להקפיא / להקפיא, תחליף הטכנולוגיה שמיש עבור תרבויות תאים ההשעיה שונים מוצג.

Protocol

1. הכנת Formvar Grid לקולנוע

הערה: בצע מניפולציה כלורופורם תחת במנדף שימוש בציוד מגן אישי (כפפות, חלוק מעבדה, משקפיים). השתמש 400 רשתות נחושת מיקרוסקופ אלקטרוני רשת. עם סוגי רשת אחרים (בגדלי רשת אחרים, זהב רשתות ניקל), איכות ההקפאה היא גרועה.

  1. כן פתרון 100 מיליליטר של 0.3% formvar כלורופורם. אפשר לו להתמוסס בין לילה ללא תסיסה.
  2. שים 400 רשת (מספר חורים לאינץ 'מרובע) רשתות אלקטרונים microscopycopper (בקוטר 3.05 מ"מ) בקבוקון זכוכית (בגובה 3 ס"מ קוטר 2 ס"מ) המכיל אצטון. מערבב את בקבוקון הזכוכית עם תנועה מעגלית של היד. הסר את אצטון עם טפטפת העברת פלסטיק. אפשר ממס להתאדות עבור 5 דקות. מעביר את הרשתות על ידי שפיכה אותם על גבי נייר סינון ולאפשר להם להתייבש במשך 5 דקות.
  3. פולנית זכוכית שקופית 76 x 26 מ"מ 2 על ידי מנגב אותו עם מטלית נטולת סיבים עד מבריק / חלקלק.
  4. קחו crystallizer (קוטר 15 ס"מ, גובה: 7 ס"מ קיבולת 1200 מ"ל) ולמלא אותו עד אפס מקום עם מים מזוקקים. נקו את משטח המים על ידי העברת בר זכוכית מעל פני השטח פעמיים כדי להסיר אבק.
  5. החזק את שקופית הזכוכית בין שתי אצבעות ולטבול אותו בתמיסת formvar במשך כמה שניות. החזק אותו זקוף לייבש תחת כוס הפוכה עבור 5 דקות.
  6. כאשר הסרט הוא יבש, להבקיע את הקצוות של שקופית הזכוכית עם סכין גילוח חד להגדיר את הגבולות של הסרט להיעקר משקופית.
  7. קח נשימה עמוקה מתנשף בכבדות לשקופית כדי לקבל שכבה של אדי מים על ומתחת לסרט להפוך את הסרט אטום מעט ולשפר את הנראות שלה.
    1. מיד לצוף הסרט על פני המים crystallizer ידי נגיעה בתחתית המגלשה עם בזווית של כ 30 מעלות. תן שחרור הסרט משקופית לקלף אותו על פני מי crystallizer. משוך בעדינות את הסרט עםפינצטה, במידת הצורך.
  8. בעדינות להניח את הרשתות עם פנים כלפי מטה על הסרט צף על פני המים באזורים שנמצאים של בעובי הנכון (כ 10 ננומטר) וללא קמטים.
  9. תרים את הסרט על ידי כיסוי הרשתות עם נייר יוסף כפי שהם צפים על פני מי crystallizer.
    1. החזקת הנייר יוסף ביד אחת, לגעת בקצה אחד של נייר יוסף אל קצה אחד של הסרט. חכה עד שהנייר יוסף הוא רטוב לגמרי. הסר את הנייר יוסף עם הרשתות התקועות על.
  10. מניח את הרשתות עבור 24 h בצלחת פטרי מכוסה לייבוש סופי ואחסון לפני השימוש בטמפרטורת חדר.

2. הכנת בינוני Freeze-החלפה

הערה: tetroxide אוסמיום (OSO 4) ו אצטט uranyl הם כימיקלים מסוכנים. טפל אותם במנדף תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כולל חלוק מעבדה וכפפות. fOLLאווה אזהרות הבטיחות לטיפול (OSO 4) ו יצטט uranyl. השתמשו cryovials O-Ring כדי למנוע דליפה של Oso 4.

  1. מחקרים ultrastructural
    1. שים אמפולה 4 כוס Oso בבקבוק זכוכית.
    2. לשבור את האמפולה ידי ניעור הבקבוק.
    3. הוספת נפח מתאים של אצטון 100% כדי להשיג ריכוז 4% סופי.
    4. מערבבים ומוציאים 1.5 aliquots מ"ל לתוך 1.8 מ"ל cryovials.
  2. immunolabeling חלבון
    1. מניחים 0.05 גרם של אצטט uranyl בבקבוק זכוכית.
    2. להוסיף 50 מ"ל של 100% אצטון.
    3. מערבבים את הפתרון עם בוחש מגנטי. כאשר הפתרון מתברר, לסנן אותו באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
    4. לוותר 1.5 aliquots מ"ל לתוך 1.8 cryovials מ"ל.
      הערה: הכן את cryovials המכיל בינוני הקפאה-החלפה לפני תהליך הקפאת הצעד ולשמור אותם במקפיא -84 מעלות צלזיוס. הפוך את בקבוק הזכוכית להשליך אתOSO 4 אמפולה של פסולת מסוכנת.

3. הכנת תאים

הערה: שלב זה הוא קריטי להצלחת השיטה. עבור כל סוגי התאים, לגדל תאים כדי לקבל את המספר המצוין של תאים. צנטריפוגה בצינור המצוין בזמן ומהירות שצוין.

  1. כדי להשיג את העקביות המתאימה של כדורי סוגי תאים שונים, גדלי תאים כדלקמן:
    1. עבור שמר האפייה ואת שמר החלוקה, לחסן שמרים ב 5 מ"ל של מדיום נוזלי מינימלי או מלאה. דגירה לילה בשעה 28 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). מדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של תרבות הלילה. לדלל תאים שמרים כדי OD 600 של 0.2 ב 50 מ"ל מדיום סלקטיבית טרי. המשיכו דגירת תאים ב 28 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 1 x 10 9 תאי שמרים 7.
    2. עבור השוטון שושנת יריחו, inoטפילים culate ב 5 מ"ל של AM בינוני עם 7.5% FCS (נסיוב עגל עוברית). דגירה לילה בשעה 24 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). למדוד את OD 600 של התרבות לילה. לדלל תאים טפילים ל OD 600 של 0.2 ב 50 מ"ל מדיום סלקטיבית טרי. המשיכו דגירת תאים ב 24 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 5 x 10 8 תאים טפילים 12.
    3. עבור Trypanosoma brucei, לחסן טפילים ב 5 מ"ל של מדיום SDM-79 עם 10% FCS ו 30 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin. דגירה לילה בשעה 27 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). למדוד את OD 600 של התרבות לילה. לדלל תאים טפילים ל OD 600 של 0.2 ב 50 בינוני סלקטיבית טריה מיליליטר. המשיכו דגירת תאים ב 27 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 5 x 10 8 תאים טפילים 13.
    4. עבור Escherichia coli, לחסן חיידקים 5 מ"ל של מדיום DYT עם 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין. דגירה לילה בשעה 37 ° C, מסתובבת (180 סל"ד). למדוד את OD 600 של התרבות לילה. לדלל חיידקים תאים ל OD 600 של 0.2 ב 50 מ"ל מדיום סלקטיבית טרי. המשיכו דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, מסתובב, כדי להשיג 5 x 10 10 חיידקי תאים 14.
      הערה: לאחר דגירת הלילה, תאים בתרבית עשויה להיות בשלב צמיחה או לוגריתמים או נייח. מאוד גדל לאט זני תא עשויים לדרוש פעמי דגירה ליותר מלילה אחד, או הרכבה של מספר רב יותר של תאים, כפי שנקבעו באופן אמפירי.
  2. עבור כל סוגי התאים, להעביר בינוני תרבות המכיל את התאים צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל עבור 3 דקות ב 1500 x גרם.
  3. הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה של כל סוגי התאים ב 1 מיליליטר של תרבית תאים הבינונית הרלוונטית.
  4. צנטריפוגה כל סוגי התאים בצינור microcentrifuge עבור 1 דקות ב 3900 x ז. להסיר לחלוטין את supernatant.
  5. שמור את התאים על קרח.

s = "jove_title"> 4. עיבוי של פרופאן

הערה: טפל חנקן נוזל בזהירות. יש להשתמש בציוד מגן אישי כולל cryogloves ו גוגל. פרופן הוא נפיץ, כך לבצע העיבוי בחדר מאוורר היטב או תחת במנדף. אין לפתוח באש מותרת.

  1. שים על 150 מ"ל של חנקן נוזלי ב מגש קלקר. מניחים כוס פליז (גובה 3.6 ס"מ, קוטר 2 ס"מ מ"מ 1.5 עובי) בחנקן נוזלי להקפיא אותו. אל תתנו החנקן הנוזלי לחדור לתוך כוס פליז.
  2. מתן עד הבועות להתפוגג להיות בטוח כי כוס פליז מוקפאת.
  3. שים את הצינור מחובר גליל פרופאן במגע עם קיר כוס פליז.
  4. בעדינות לפתוח את שסתום פרופאן גליל.
    הערה: בשלב זה, את זרימת הגז לנוזל בגביע פליז.
  5. עצור את ההתנזלות ידי סגירת שסתום פרופאן הגליל במהירות הסרת צינור הגז.
  6. מלא את מגש הקלקר עם ני הנוזלtrogen עד 5 מ"מ מהחלק העליון של גביע פליז. אל תתנו החנקן הנוזלי לחדור לתוך כוס פליז.

מקפיא פלאנג 5. המדגם

  1. שים על 200 מ"ל של חנקן נוזלי ב מגש קלקר. להקפיא כוסות פליז קטנה (בגובה 1.5 ס"מ קוטר 2.5 ס"מ ועובי 1 מ"מ) על ידי הצבת אותם בחנקן נוזלי. שים כוס אחת עבור מדגם תא השעיה אחד. היזהר שלא לערבב דגימות. לשם כך, לשים מדגם 1 כוס 1, מדגם 2 בכוס 2, וכו '.
  2. להקפיא את פינצטה בצלילה טיפ שלהם בחנקן נוזלי.
  3. תתקע לו איזמל מנתחי קצה כפול הגלולה שהושגה 3.5.
  4. בעזרת פינצטה, לקחת לרשת מיקרוסקופיה נחושת 400 רשת מצופה formvar מוכן בסעיף 1.
  5. באמצעות איזמל המנתחים, במקום ירידה של הגלולה שהושגה 3.5 על הרשת. נסה גדל טיפה שונה (למשל 2, 5 ו 10 μL).
  6. מאוד במהירות לצלול לרשת שבידי פינצטה לתוך גן פרופן נוזלמדורג בסעיף 4 ומערבבים את הרשת עם תנועה מעגלית במשך כמה שניות.
  7. במהירות להעביר לרשת קפואה עם פינצטה אל הכוס הקטנה מפליז הקפוא בסעיף 5.1.
    הערה: עבור כל דגימה, לעשות לפחות 3 רשתות. תמיד להקפיא את פינצטה לפני לקיחת רשת נחושת.

6. החלפת Freeze

הערה: tetroxide אוסמיום הוא פוטנציאלי ידיף, כך להשתמש הנשמת טיהור אוויר עם מחסניות אדי. הקפאה מקבעת בחנקן נוזלי לפני הקפאת צעד היא גם פתרון.

  1. עבור מחקרי ultrastructure, לפתוח את צינורות cryovial 1.8 מיליליטר המכילים בינוני הקפאה-החלפה מוכנה בסעיף 2.1. עבור מחקרי immunolocalization, לפתוח את צינורות cryovial 1.8 מיליליטר המכילים בינוני הקפאה-החלפה מוכנה בסעיף 2.2. מניחים את הכובע על cryovials.
  2. להקפיא את פינצטה בצלילה טיפ שלהם בחנקן נוזלי.
  3. במהירות להסיר את הכובע ולהעביר את הרשתות קפואות in עד cryovials באמצעות פינצטה.
  4. שים את הכובע בחזרה על cryovials.
  5. חזור על הפעולה עבור כל רשת של כל דגימה.
  6. סגור את כל המכסים ומערבבי cryovials עם תנועה מעגלית של היד כדי להבטיח את הדוגמות הן במדיום הקפאה-ההחלפה.
  7. מניחים את cryovials בקופסה אטומה עבור 3 ימים במקפיא C -84 ° במהלך תהליך ההקפאה-החלפה.

7. התחממות לדוגמא

  1. מחקרים ultrastructure
    1. קח את cryovials ב מגש קלקר (כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה) במקפיא C -30 °. מניחים אותם במקפיא -30 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
    2. מניחים את cryovials במקפיא C -15 ° עבור 2 h. מניחים את דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ולאחר מכן למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את מדיום החלפת הקפאה עם טפטפת העברת פלסטיק. להוסיף כ 500 μL של אצטון 100%.
    4. מערבבים את 1.8 מ"ל cryovialעם תנועה מעגלית של היד במהירות לשפוך אצטון (1.5 מ"ל) המכיל את רשתות בקבוקון זכוכית (בגובה 3 ס"מ ו ס"מ קוטר 2).
    5. יש לשטוף אותו cryovial עם 1 מ"ל של אצטון 100% כדי להיות בטוח שהעברת כל רשתות. מערבב את cryovial עם תנועה מעגלית של היד ושופך את תוכן cryovial לתוך בקבוקון זכוכית.
    6. יש לשטוף כל בקבוקון זכוכית עם 3 מ"ל של 100% אצטון 3 פעמים במשך 10 דקות.
    7. פעל על פי ההליכים הטבעה והכלה כמתואר התייחסות 15. להספיג את הדגימה עם ריכוז גדל והולך של שרף אפוקסי ב אצטון (25%, 50%, ו 75%) ולהטביע המדגם עם שרף אפוקסי 100% בכמוסות ג'לטין.
  2. immunolabeling מחקרים
    1. קח את 1.8 מ"ל cryovials ב מגש קלקר (כדי למנוע עלייה פתאומית בטמפרטורה) למקפיא -30 מעלות צלזיוס.
    2. מניחים את cryovials עבור 2 h במקפיא C -30 °.
    3. In a -30 ° C במקפיא, לבחוש cryovial עם התנועה המעגלית של היד במהירות לשפוך את המדיום החלפה הקפאת בבקבוקון פוליפרופילן (גובה 5 ס"מ קוטר 1.5 ס"מ).
    4. החלף את מדיום החלפת הקפאה עם 2 מיליליטר של מדיום הקפאה-החלפה טריה.
    5. מניחים את הצנצנת פוליפרופילן למוצרי 2 h במקפיא C -30 °.
    6. יש לשטוף את הבקבוקון פוליפרופילן למוצרי 1 h עם 2 מ"ל של אצטון 100% ושלוש פעמים עבור 1 h עם 2 מ"ל של אתנול 100%.
    7. פעל על פי ההליכים הטבעה והכלה כמתואר התייחסות 15. להספיג את הדגימה עם ריכוזים גוברים של שרף אקרילי (25%, 50%, ו 75% ב אצטון) ולהטביע מדגם עם שרף אקרילי 100% בכמוסות ג'לטין.

ויזואליזציה 8. דוגמאות

  1. לאחר הטבעה, לעשות 80 חלקים דקים ננומטר של דגימות עם ultramicrotome. השוו את החלקים עם ציטרט להוביל 2% בטמפרטורת החדר למשך 1 דקההתחת = "Xref"> 15.
  2. שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים 80 קילו או 120 קילו להתבונן בסעיפים 15.

תוצאות

במאמר זה, שיטת הקפאה קלה לשימוש וזול צעד עבור ultrastructural (איורים 1 ו איור 2) ו immunolabeling (איור 3) מחקרים מוצגת. אנו מראים כי אין זה הכרחי כדי לקבל ציוד מיוחד עבור הליך הקפאה-ההחלפה וכי הליך ההתחממות לוקח פחות מ...

Discussion

TEM היא שיטה רבת עוצמה עבור תצפית ultrastructural של אברונים, תאים, רקמות. Cryofixation / הקפאה-החלפה היא כיום השיטה הטובה ביותר לשימור הוא antigenicity ultrastructure והחלבון. Fixatives הכימי לחדור ולפעול ובכך לאפשר שחלופים מבניים מאוד לאט לפני ההתייצבות המלאה של ultrastructure 2. לעומת זאת, cryo...

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

תודתנו ל M. Bouchecareilh, E. Tétaud, ס Duvezin-Caubet, וא דווין לעזרה והערות שלהם על כתב היד. אנו מודים קוטב ההדמיה האלקטרוני של מרכז דימות בורדו איפה התמונות צולמו. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GridsElectron Microscopy SciencesT400-Cu
FormvarElectron Microscopy Sciences15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needleElectron Microscopy Sciences72947
CryovialsElectron Microscopy Sciences61802-02
Osmium tetroxideElectron Microscopy Sciences19130
Glass vial 8.5 mLElectron Microscopy Sciences64252
Uranyl acetateElectron Microscopy Sciences48851
AcetoneSigma32201
Ethanol 100%Sigma32221
Glass slidesVWR international631-9439
Tweezers
Acrylic resinElectron Microscopy Sciences104371
Epoxy resin MSigma10951
Epoxy resin M hardenerSigma10953
Dibutyl phtalate Sigma80102
Epoxy resin M accelerateurSigma10952
CrystallizerFischer scientific08-762-9
Joseph paperVWR international111-5009
Brass cupsdo it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli 
Airtight boxFischer scientific7135-0001 
Air purifying respiratorFischer scientific3M 7502 
Cartridge for respiratorFischer scientific3M 6001
Particulate filterFischer scientific3M 5N11 

References

  1. Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
  2. Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
  3. Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
  4. McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
  5. Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
  6. Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
  7. Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
  8. Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
  9. Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
  10. Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
  11. Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
  12. Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
  13. Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
  14. Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
  15. Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
  16. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
  17. Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
  18. Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
  19. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  20. Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
  21. Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
  22. Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
  23. Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
  24. Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123ultrastructureimmunolabeling

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved