A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כתב יד זה מתאר שיטה קלה לשימוש בעלות הנמוכה cryofixation המאפשרת הדמית תאי השעיה ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים.
הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופים (TEM) הוא כלי יוצא דופן לחקר ultrastructure תא, כדי למקם חלבונים ולדמיין מתחמי macromolecular ברזולוציה גבוהה מאוד. עם זאת, כדי להתקרב ככל האפשר אל למצב הטבעי, שימור מדגם מושלם נדרש. קיבוע במיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונאלי (EM) עם אלדהידים, למשל, אינו מספק שימור ultrastructural טוב. החדירה האיטית של fixatives גורמת ארגון מחדש תאים ואובדן מרכיבי תא שונים. לכן, קיבוע EM קונבנציונאלי אינו מאפשר התייצבות מיידית ושימור מבנים antigenicity. הבחירה הטובה ביותר לבחינת אירועים תאיים היא להשתמש cryofixation ואחריו שיטת קיבוע הקפאה-ההחלפה שמחזיקה תאים במצב הטבעי שלהם. בלחץ גבוה הקפאה / להקפיא-החלפה, השומרת על שלמות ultrastructure הסלולר, היא השיטה הנפוצה ביותר, אך דורשת expensive ציוד. הנה, שיטת קיבוע הקפאה קלה לשימוש וזול ואחריו-החלפת הקפאה עבור תרביות תאי השעיה מוצגת.
לדוגמא ההכנה היא קריטית להצלחה של כל מחקר במיקרוסקופ אלקטרונים. קיבוע קונבנציונלי EM היה השיטה העיקרית לתיקון רקמות או תאים במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) 1. ראשית, אלדהידים ו tetroxide אוסמיום משמשים כדי לתקן את חומר כימי בטמפרטורת החדר. ואז, החומר הוא מיובש עם ממיסים אורגניים, חדרו, ומוטבעים שרף אפוקסי. שיטה זו תלויה בשיעור החדירה של fixatives לתוך התא. כתוצאה מכך, הממצאים והפקת תכני הסלולר בדרך כלל הם נצפו 2.
Cryofixation הוא בבירור אלטרנטיבה טובה יותר לשימור מבנים הסלולר 3, להשאיר אותן ללא פגע. האיכות הגבוהה ביותר של תמונות TEM 4 בסעיפי שרף דקים ניתן להשיג באמצעות שיטת החלפת cryofixation / ההקפאה. מטרת טכניקה זו היא להשיג דו מזוגגתדגימות ological ללא היווצרות גבישי קרח או גבישי קרח המכילים קטנים מספיק כדי לא לפגוע ultrastructure של התאים. בלחץ גבוה הקפאה (HPF) ו cryofixation אולטרה-מהירה, אשר נקרא גם לצלול מקפיא (PF), הן שתי שיטות cryofix דגימות. HPF שמגביל מולקולות בתא מיידי ונמנע את הנזק שנגרם על ידי קיבוע EM קונבנציונאלי. ישנם מספר סוגים של מכונות הקפאה והתקני החלפה אוטומטיות פותחו 5. מכונות ההקפאה ומתכלה (החנקן נוזלי, דגימת ספקים, וכו ') הם יקרים, אבל הם מאפשרים הפקת micrographs אלקטרונים איכותי 6, 7. PF היא טכניקה ששימשה בשנת 1950 המוקדמות והוא מתואר בספרות פשוטה וזולה 8 .During ההליך PF, המדגם מוכן קפוא בקצב מהיר כדי להשיג גבישי קרח במידות פחות מ 3 עד 5 ננומטר. לשם כך, המדגם הואצלל לתוך קריוגן נוזלי, כגון אתאן, פרופאן, או תערובת אתנית- propane. מאז 1950, שיפורים של PF נעשו כדי להפוך את הטכניקה הזו זמינה למספר גדול יותר של משתמשים. הקפאה בלחץ גבוה היא כרגע הדרך קיימא רק להקפיא מגוון רחב של דגימות עבה יותר מ 50 מיקרומטר (עד עובי של 200 מיקרומטר עבור דגימות בצורת דיסק) 5 , ואילו PF נעשה שימוש נרחב על התמונה אובייקטים קטנים (<100 ננומטר ), כגון קומפלקסים macromolecular מושעה בסרט דק של קרח אמורפי 9 . דגימות גדולות יותר, למשל תאים אוקריוטים, יכולים להיות cryofixed על ידי PF, אבל דורש מחזיקי הדגימה, כגון צינורות נחושת נימי או מערכות כריך 8 , 10 , 11 .
הנה, מהיר לשימוש, קל לשימוש ו עלות נמוכה לצלול להקפיא / להקפיא, תחליף הטכנולוגיה שמיש עבור תרבויות תאים ההשעיה שונים מוצג.
1. הכנת Formvar Grid לקולנוע
הערה: בצע מניפולציה כלורופורם תחת במנדף שימוש בציוד מגן אישי (כפפות, חלוק מעבדה, משקפיים). השתמש 400 רשתות נחושת מיקרוסקופ אלקטרוני רשת. עם סוגי רשת אחרים (בגדלי רשת אחרים, זהב רשתות ניקל), איכות ההקפאה היא גרועה.
2. הכנת בינוני Freeze-החלפה
הערה: tetroxide אוסמיום (OSO 4) ו אצטט uranyl הם כימיקלים מסוכנים. טפל אותם במנדף תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כולל חלוק מעבדה וכפפות. fOLLאווה אזהרות הבטיחות לטיפול (OSO 4) ו יצטט uranyl. השתמשו cryovials O-Ring כדי למנוע דליפה של Oso 4.
3. הכנת תאים
הערה: שלב זה הוא קריטי להצלחת השיטה. עבור כל סוגי התאים, לגדל תאים כדי לקבל את המספר המצוין של תאים. צנטריפוגה בצינור המצוין בזמן ומהירות שצוין.
s = "jove_title"> 4. עיבוי של פרופאן
הערה: טפל חנקן נוזל בזהירות. יש להשתמש בציוד מגן אישי כולל cryogloves ו גוגל. פרופן הוא נפיץ, כך לבצע העיבוי בחדר מאוורר היטב או תחת במנדף. אין לפתוח באש מותרת.
מקפיא פלאנג 5. המדגם
6. החלפת Freeze
הערה: tetroxide אוסמיום הוא פוטנציאלי ידיף, כך להשתמש הנשמת טיהור אוויר עם מחסניות אדי. הקפאה מקבעת בחנקן נוזלי לפני הקפאת צעד היא גם פתרון.
7. התחממות לדוגמא
ויזואליזציה 8. דוגמאות
במאמר זה, שיטת הקפאה קלה לשימוש וזול צעד עבור ultrastructural (איורים 1 ו איור 2) ו immunolabeling (איור 3) מחקרים מוצגת. אנו מראים כי אין זה הכרחי כדי לקבל ציוד מיוחד עבור הליך הקפאה-ההחלפה וכי הליך ההתחממות לוקח פחות מ...
TEM היא שיטה רבת עוצמה עבור תצפית ultrastructural של אברונים, תאים, רקמות. Cryofixation / הקפאה-החלפה היא כיום השיטה הטובה ביותר לשימור הוא antigenicity ultrastructure והחלבון. Fixatives הכימי לחדור ולפעול ובכך לאפשר שחלופים מבניים מאוד לאט לפני ההתייצבות המלאה של ultrastructure 2. לעומת זאת, cryo...
החוקרים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים.
תודתנו ל M. Bouchecareilh, E. Tétaud, ס Duvezin-Caubet, וא דווין לעזרה והערות שלהם על כתב היד. אנו מודים קוטב ההדמיה האלקטרוני של מרכז דימות בורדו איפה התמונות צולמו. עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי de la משוכלל ונדיר Scientifique.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
Propane N35 | |||
Liquid nitrogen | |||
Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
Glass vial 8.5 mL | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
Acetone | Sigma | 32201 | |
Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
Tweezers | |||
Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
Saccharomyces cerevisiae | |||
Shizosacharomyces cerevisiae | |||
Trypanosoma brucei | |||
Leishmania amazonensis | |||
Escherichia coli | |||
Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved