Plunge congelamento: uno strumento per l'ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

Riepilogo

Questo manoscritto descrive un metodo facile da usare e cryofixation basso costo per la visualizzazione cellule in sospensione mediante microscopia elettronica a trasmissione.

Abstract

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è uno straordinario strumento per studiare ultrastruttura delle cellule, al fine di localizzare le proteine ​​e visualizzare complessi macromolecolari ad altissima risoluzione. Tuttavia, per ottenere il più vicino possibile allo stato nativo, è necessaria la conservazione del campione perfetto. Convenzionale microscopia elettronica (EM) fissazione con aldeidi, per esempio, non fornisce una buona conservazione ultrastrutturali. La lenta penetrazione di fissativi induce riorganizzazione cellulare e la perdita di vari componenti cellulari. Pertanto, convenzionale fissazione EM non consente una stabilizzazione istantanea e preservare le strutture e antigenicità. La scelta migliore per l'esame di eventi intracellulari è utilizzare cryofixation seguito dal metodo di fissaggio freeze-sostituzione che mantiene le cellule nel loro stato nativo. Alta pressione congelamento / freeze-sostituzione, che preserva l'integrità della ultrastruttura cellulare, è il metodo più comunemente utilizzato, ma richiede expensive attrezzature. Qui, un metodo facile da usare ed economici freeze fissazione seguita da congelamento-sostituzione per colture cellulari La sospensione viene presentato.

Introduzione

La preparazione del campione è fondamentale per il successo di qualsiasi studio di microscopia elettronica. Convenzionale fissazione EM era il metodo primario per fissare tessuti o cellule per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ^1. In primo luogo, aldeidi e osmio tetrossido sono utilizzati per fissare chimicamente il materiale a temperatura ambiente. Poi, il materiale viene disidratato con solventi organici, infiltrato, e incorporata in resina epossidica. Questo metodo dipende dal tasso di penetrazione del fissativi nella cellula. Di conseguenza, i manufatti ed estrazione dei contenuti cellulari sono generalmente osservati ^2.

Cryofixation è chiaramente un'alternativa migliore per la conservazione di strutture cellulari ^3, mantenendo intatte. La più alta qualità delle immagini TEM ⁴ in sezioni sottili di resina può essere ottenuta utilizzando il metodo di sostituzione cryofixation / congelamento. Lo scopo di questa tecnica è quello di ottenere bi vetrificatocampioni ological senza formazione di cristalli di ghiaccio o di cristalli di ghiaccio contenenti abbastanza piccolo da non danneggiare l'ultrastruttura delle cellule. Ad alta pressione di congelamento (HPF) e ultrarapido cryofixation, che è anche chiamato tuffo congelamento (PF), sono due metodi per cryofix campioni. HPF immobilizza molecole nella cellula istantaneamente ed evita danni causati dal convenzionale fissazione EM. Diversi tipi di macchine di congelamento e dispositivi automatici di sostituzione sono stati sviluppati ^5. Le macchine e di consumo di congelamento (azoto liquido, dei campioni vettori, ecc) sono costosi, ma consentono di produrre micrografie elettroniche di alta qualità ^{6, 7.} PF è una tecnica che è stata utilizzata nei primi anni 1950 ed è descritto in letteratura come semplice ed economico ⁸ .Durante la procedura PF, il campione preparato è congelato a un ritmo rapido per ottenere cristalli di ghiaccio dimensione inferiore 3 a 5 nm. A tal fine, il campione èImmerso in un criogenico liquido, come ad esempio etano, propano o una miscela di etano-propano. Fin dagli anni '50 sono stati apportati miglioramenti di PF per rendere disponibile questa tecnica ad un maggior numero di utenti. Il congelamento ad alta pressione è attualmente l'unico modo efficace per congelare una grande varietà di campioni di spessore superiore a 50 μm (fino a uno spessore di 200 μm per i campioni a forma di disco) ⁵ , mentre PF è ampiamente usato per rappresentare piccoli oggetti (<100 nm ), Come i complessi macromolecolari sospesi in un film sottile di ghiaccio amorfo ⁹ . Campioni più grandi, ad esempio le cellule eucariotiche, possono essere criosidite da PF, ma necessitano di detti campioni, come i tubi di rame capillari oi sistemi a sandwich ^{8 , 10 , 11} .

Qui viene presentata una tecnologia veloce, facile da usare e a basso costo di congelamento / congelamento a tuffo utilizzabile per diverse colture di cellule di sospensione.

Protocollo

1. Preparazione di Formvar griglia Film

NOTA: Eseguire manipolazione cloroformio sotto una cappa utilizzando dispositivi di protezione individuale (guanti, camice, occhiali). Utilizzare 400 mesh griglie di rame di microscopia elettronica. Con altri tipi di rete (in altre dimensioni delle maglie, oro e griglie di nichel), la qualità di congelamento è peggio.

1. Preparare una soluzione di 100 mL di 0,3% formvar in cloroformio. Permettono di sciogliere durante la notte senza agitazione.
2. Mettere 400 mesh (numero di fori per pollice quadrato) griglie microscopycopper elettroni (diametro 3,05 mm) in una fiala di vetro (altezza 3 cm e diametro di 2 cm) contenente acetone. Agitare la fiala con un movimento circolare della mano. Togliere l'acetone con una pipetta di trasferimento di plastica. Che il solvente evapori per 5 min. Trasferire le griglie da essi versando su una carta da filtro e lasciare asciugare per 5 min.
3. Lucidare un vetrino 76 x 26 mm ² strofinando con un panno privo di lanugine fino lucido / scivoloso.
4. Prendere un cristallizzatore (diametro 15 cm, altezza: 7 cm e capacità di 1200 mi) e riempire fino all'orlo con acqua distillata. Pulire la superficie dell'acqua passando una barra di vetro sulla superficie due volte per rimuovere la polvere.
5. Tenere il vetrino tra due dita ed immergerlo nella soluzione Formvar per alcuni secondi. Tenere in posizione verticale ad asciugare sotto un bicchiere capovolto per 5 min.
6. Quando il film è asciutto, segnare i bordi del vetrino con una lama di rasoio affilata per definire i limiti del film da sloggiati dalla diapositiva.
7. Prendere un respiro profondo ed espirare pesantemente sul vetrino per ottenere uno strato di vapore acqueo sopra e sotto la pellicola per rendere la pellicola leggermente opaca e migliorare la sua visibilità.
   1. galleggiare immediatamente la pellicola sulla superficie dell'acqua cristallizzatore toccando il fondo del vetrino con un angolo di circa 30 °. Lasciare il rilascio pellicola dal vetrino e sfilarlo verso la superficie dell'acqua cristallizzatore. tirare delicatamente la pellicola via con lapinzette, se necessario.
8. Delicatamente depongono le griglie a faccia in giù sul film galleggiante sulla superficie dell'acqua nelle regioni che sono di spessore adeguato (circa 10 nm) e senza grinze.
9. Raccogliere il film coprendo le griglie con carta Joseph come galleggiare sulla superficie dell'acqua cristallizzatore.
   1. Tenendo la carta Joseph con una mano, toccare una delle estremità della carta Joseph ad un'estremità del film. Attendere che la carta Giuseppe è completamente bagnato. Rimuovere la carta Giuseppe con le griglie bloccato su.
10. Posizionare le griglie per 24 ore in una capsula di Petri coperto per essiccamento finale e stoccaggio prima dell'uso a temperatura ambiente.

2. Preparazione di Freeze-sostituzione Piano

NOTA: tetrossido di osmio (OSO ₄₎ e acetato di uranile sono sostanze chimiche pericolose. gestirli nella cappa indossando un'idonea attrezzatura di protezione individuale (DPI) includente un camice e guanti. Follow le avvertenze di sicurezza per la gestione (OSO ₄₎ e acetato di uranile. Utilizzare cryovials O-ring per evitare la fuoriuscita di OsO _4.

1. studi ultrastrutturali
   1. Mettere in vetro OsO ₄ fiale in un pallone di vetro.
   2. Rompere la fiala agitando il pallone.
   3. Aggiungere un volume appropriato di acetone 100% per ottenere una concentrazione finale 4%.
   4. Mescolare e versare 1,5 aliquote mL in 1,8 cryovials mL.
2. proteine immunomarcatura
   1. Posizionare 0,05 g di acetato di uranile in un pallone di vetro.
   2. Aggiungere 50 ml di 100% acetone.
   3. Agitare la soluzione con un agitatore magnetico. Quando la soluzione diventa limpida, filtrata usando un filtro da 0,2 um.
   4. Dispensare 1,5 mL aliquote in 1,8 cryovials mL.
      NOTA: Preparare i cryovials contenenti un mezzo di gelo e di sostituzione prima del processo di congelamento grande passo e tenerli in -84 ° C freezer. Invertire il fiasco di vetro di buttare via laOsO ₄ ampolla nel rifiuti pericolosi.

3. Preparazione di cellule

NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il successo del metodo. Per tutti i tipi di cellule, crescere le cellule per ottenere il numero indicato di cellule. Centrifuga nel tubo indicato al momento e velocità specificata.

1. Per ottenere la consistenza adeguata dei pellet di diversi tipi di cellule, le cellule crescono come segue:
   1. Per Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, inoculare lievito in 5 mL di terreno liquido minima o completa. Incubare una notte a 28 ° C, rotante (180 rpm). Misurare la densità ottica a 600 nm (OD ₆₀₀₎ della coltura durante la notte. Diluire le cellule di lievito ad una OD ₆₀₀ di 0,2 in 50 ml di mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 28 ° C, rotante, per ottenere 1 x 10 ⁹ cellule di lievito ^7.
   2. Per Leishmania flagellum, inoparassiti culate in 5 ml di mezzo AM con 7,5% di FCS (siero fetale di vitello). Incubare una notte a 24 ° C, rotante (180 rpm). Misurare il diametro esterno ₆₀₀ della cultura durante la notte. Diluire le cellule parassita ad un OD ₆₀₀ di 0,2 in 50 ml di mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 24 ° C, rotante, per ottenere 5 x 10 ⁸ cellule parassita ^12.
   3. Per Trypanosoma brucei, inoculare parassiti in 5 mL di SDM-79 media con 10% FCS e 30 pg / mL igromicina. Incubare una notte a 27 ° C, rotante (180 rpm). Misurare il diametro esterno ₆₀₀ della cultura durante la notte. Diluire le cellule parassita ad un OD ₆₀₀ di 0,2 in 50 mL mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 27 ° C, rotante, per ottenere 5 x 10 ⁸ cellule parassita ^13.
   4. Per Escherichia coli, inoculare i batteri in 5 ml di terreno DYT con 100 ug / ml di ampicillina. Incubare per una notte a 37 ° C, rotante (180rpm). Misurare il diametro esterno ₆₀₀ della cultura durante la notte. Diluire le cellule dei batteri ad una OD ₆₀₀ di 0,2 in 50 ml di mezzo fresco selettivo. Continuare ad incubare le cellule a 37 ° C, rotante, per ottenere 5 x 10 ¹⁰ batteri cellule ^14.
      NOTA: Dopo una notte di incubazione, le cellule in coltura può essere sia in fase di crescita logaritmica o stazionaria. Molto lenta crescita ceppi cellulari possono richiedere tempi di incubazione più di una notte, o inoculazione di un maggior numero di cellule, come determinato empiricamente.
2. Per tutti i tipi di cellule, trasferire il mezzo di coltura contenente le cellule a 50 ml provetta di polipropilene e centrifugare per 3 minuti a 1500 x g.
3. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di tutti i tipi di cellule in 1 ml di mezzo di coltura cellulare pertinente.
4. Centrifugare tutti i tipi cellulari in una provetta per 1 min a 3900 x g. Completamente rimuovere il surnatante.
5. Mantenere le cellule in ghiaccio.

4. Liquefazione del propano

Nota: maneggiare azoto liquido con cura. Utilizzare dispositivi di protezione individuale compresi cryogloves e googles. Propano è potenzialmente esplosiva, in modo da eseguire la liquefazione in un ambiente ben ventilato o sotto una cappa aspirante. Non fiamme libere sono ammessi.

1. Mettere circa 150 mL di azoto liquido in un vassoio di polistirolo. Collocare una tazza di ottone (altezza 3,6 cm, diametro 2 cm e spessore 1,5 mm) in azoto liquido per congelare esso. Non lasciate che l'azoto liquido penetri nella tazza in ottone.
2. Attendere fino a quando le bolle scompaiono per essere sicuri che la coppa di ottone è congelato.
3. Mettere il tubo collegato alla bombola di propano in contatto con la parete coppa in ottone.
4. tenere aperta la valvola della bombola di propano.
   NOTA: A questo punto, il propano liquefa nella tazza di ottone.
5. Interrompere la liquefazione chiudendo la valvola della bombola di propano e rapida rimozione del tubo del gas.
6. Riempire la vaschetta in polistirolo con ni liquidoTrogen fino a 5 mm dalla parte superiore della coppa di ottone. Non lasciate che l'azoto liquido penetri nella tazza in ottone.

5. Plunge congelamento del campione

1. Mettere circa 200 mL di azoto liquido nel vassoio polistirolo. Congelare tazzine ottone (altezza 1,5 centimetri di diametro 2,5 cm e spessore di 1 mm) mettendoli in azoto liquido. Mettere una tazza per un campione di cellule in sospensione. Fare attenzione a non mescolare i campioni. A tal fine, mettere il campione 1 in tazza 1, campione 2 in tazza 2, ecc.
2. Congelare le pinzette immergendo la punta in azoto liquido.
3. Immergere un doppio ago bordo dissezione nel pellet ottenuto in 3.5.
4. Con una pinzetta, prendere 400 mesh griglia microscopia rame rivestito con formvar preparata nella sezione 1.
5. Utilizzando l'ago dissezione, una goccia del pellet ottenuto in 3.5 sulla griglia. Provare dimensioni diverse goccia (ad esempio 2, 5 e 10 mL).
6. Molto rapidamente immergere la griglia in possesso delle pinzette nel gene propano liquidovalutazione nella sezione 4 e mescolare la griglia con movimento circolare per alcuni secondi.
7. Rapidamente trasferire la griglia congelato con le pinzette alla tazzina piccolo ottone congelato nella sezione 5.1.
   NOTA: Per ogni campione, fare almeno 3 griglie. bloccare sempre le pinzette prima di prendere una griglia di rame.

6. Gelo-sostituzione

NOTA: tetrossido di osmio è potenzialmente volatile, in modo da utilizzare un respiratore purificazione dell'aria con filtri per vapori. Congelare il fissativo in azoto liquido prima immersione congelamento è anche una soluzione.

1. Per gli studi ultrastruttura, aprire 1,8 ml provette contenenti esageratamente medio freeze-sostituzione preparata nella sezione 2.1. Per gli studi di immunolocalizzazione, aprire 1,8 ml provette contenenti esageratamente medio freeze-sostituzione preparata nella sezione 2.2. Mettere il coperchio sulle cryovials.
2. Congelare le pinzette immergendo la punta in azoto liquido.
3. Rapidamente rimuovere il tappo e trasferire le griglie congelati inPer cryovials utilizzando le pinzette.
4. Mettere il tappo sul cryovials.
5. Ripetere l'operazione per ogni griglia di ciascun campione.
6. Chiudere tutti i tappi e mescolare i cryovials con un movimento circolare della mano per garantire i campioni sono nel mezzo freeze-sostituzione.
7. Posizionare i cryovials in una scatola a chiusura ermetica per 3 giorni in un congelatore C -84 ° durante il processo di congelamento-sostituzione.

Warming 7. Campione

1. studi Ultrastrutture
   1. Portare i cryovials in un vassoio di polistirolo (per evitare un improvviso aumento della temperatura) ad una C congelatore -30 °. Metterli in freezer a -30 ° C per 1 ora.
   2. Mettere le cryovials in un congelatore C -15 ° per 2 ore. Porre i campioni a 4 ° C per 2 ore e poi per 30 min a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il supporto di sostituzione di congelamento con una pipetta di trasferimento di plastica. Aggiungere circa 500 ml di 100% acetone.
   4. Mescolare il 1,8 ml esageratamentecon un movimento circolare della mano e rapidamente versare l'acetone (1,5 ml) contenente le griglie in un flacone di vetro (altezza 3 cm e diametro 2 cm).
   5. Risciacquare la stessa esageratamente con 1 mL di acetone al 100% per essere certi di aver trasferito tutte le griglie. Mescolare l'esageratamente con un movimento circolare della mano e versare il contenuto della esageratamente in una fiala di vetro.
   6. Lavare ogni fiala con 3 mL di 100% acetone 3 volte per 10 min.
   7. Seguire le procedure incorporamento e inclusione come descritto nel riferimento ^15. Impregnare il campione con concentrazioni crescenti di resina epossidica in acetone (25%, 50% e 75%) e incorporare il campione con 100% di resina epossidica in capsule di gelatina.
2. immunomarcatura studi
   1. Trasportare 1,8 mL cryovials in un vassoio di polistirolo (per evitare un improvviso aumento della temperatura) alla -30 ° C freezer.
   2. Posizionare i cryovials per 2 ore in un congelatore C -30 °.
   3. In -30 ° C congelatore, mescolare la esageratamente con un movimento circolare della mano e rapidamente versare il mezzo sostituzione congelamento in una fiala di polipropilene (altezza 5 cm e diametro 1,5 cm).
   4. Sostituire il mezzo di sostituzione congelamento con 2 ml di terreno freeze-sostituzione fresca.
   5. Posizionare il flacone in polipropilene per 2 ore in un congelatore C -30 °.
   6. Risciacquare il flacone polipropilene per 1 h con 2 mL di 100% acetone e tre volte per 1 h con 2 mL di etanolo al 100%.
   7. Seguire le procedure incorporamento e inclusione come descritto nel riferimento ^15. Impregnare il campione con concentrazioni crescenti di resina acrilica (25%, 50% e 75% in acetone) e incorporare il campione con resina acrilica 100% in capsule di gelatina.

8. Visualizzazione Campioni

1. Dopo l'incorporazione, fare 80 nm sezioni ultra-sottili dei campioni con un ultramicrotomo. Contrastare le sezioni con 2% citrato di piombo a temperatura ambiente per 1 minass = "xref"> 15.
2. Utilizzare un microscopio elettronico 80 kV o 120 kV ad osservare le sezioni ^15.

Risultati

In questo articolo, un metodo di congelamento facile da usare e tuffo basso costo per ultrastrutturali (figure 1 e Figura 2) e studi immunomarcatura (Figura 3) è presentato. Abbiamo dimostrato che non è necessario disporre di attrezzature speciali per la procedura di congelamento-sostituzione e che la procedura di riscaldamento richiede meno di 6 ore invece di 24 ore utilizzando un sistema dedicat...

Discussione

TEM è un metodo efficace per l'osservazione ultrastrutturale di organelli, cellule e tessuti. Cryofixation / freeze-sostituzione è attualmente il metodo migliore per la conservazione di entrambi ultrastruttura e proteine ​​antigenicità. Fissativi chimici penetrano e si comportano molto lentamente consentendo in tal modo riarrangiamenti strutturali prima della completa stabilizzazione della ultrastruttura ^2. Al contrario, cryofixation / freeze-sostituzione stabilizza immediatamente stru...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11