プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

要約

この原稿は、透過型電子顕微鏡により懸濁細胞を可視化するために使いやすく、低コストの低温固定の方法を記載しています。

要約

透過型電子顕微鏡（TEM）は、タンパク質を局在化し、非常に高い分解能で高分子複合体を可視化するために、細胞の超微細構造を研究するための特別なツールです。しかし、本来の状態にできるだけ近い取得するには、完璧なサンプル保存が必要です。従来の電子顕微鏡（EM）アルデヒド固定、例えば、良好な超微細構造保存を提供しません。固定剤の遅い浸透は、様々な細胞成分の細胞の再編成および損失を誘発します。したがって、従来のEM固定は、構造および抗原性の瞬間的安定化および保存を可能にしません。細胞内事象を調べるための最良の選択は、その天然の状態で細胞を維持し、凍結置換固定法に続いて低温固定を使用することです。高圧凍結細胞の超微細構造の整合性を維持する/凍結置換は、最も一般的に使用される方法ですが、expensiが必要です機器VEの。ここでは、懸濁細胞培養のための凍結置換に続いて、使いやすく、低コストの凍結固定方法が提示されます。

概要

サンプル調製は、電子顕微鏡検査の成功のために重要です。従来のEM固定は、透過型電子顕微鏡（TEM） ^1の組織または細胞を固定するための主要な方法であった¹ 。まず、アルデヒドと四酸化オスミウムを用いて室温で材料を化学的に固定する。次いで、材料を有機溶媒で脱水し、浸透させ、エポキシ樹脂に包埋する。この方法は、細胞への固定剤の浸透率に依存する。結果として、アーチファクトおよび細胞内容物の抽出が通常観察される² 。

凍結融解は、明らかに、細胞構造^3の保存のためのより良い選択肢であり、それらをそのまま維持する。薄い樹脂切片における最高品質のTEM画像⁴は、低温固定/凍結置換法を用いて得ることができる。この技術の目的は、ガラス化されたbiologicalサンプル氷晶形成せず、または細胞の超微細構造を損傷しない十分に小さな氷晶を含みます。 （HPF）を凍結高圧またプランジ凍結（PF）と呼ばれる超急速低温固定は、サンプルをcryofixするための2つの方法です。 HPFは瞬間セル内の分子を固定化し、従来のEM固定によって引き起こされる損傷を回避します。冷凍機や自動置換デバイスのいくつかのタイプが^5を開発されています。冷凍機や消耗品（液体窒素等のキャリアを試料）は高価であり、それらは、高品質の電子顕微鏡写真^6,7の製造を可能にします。 PFは、1950年代初期に使用された技術であり、PF手順を.During簡単で安価な⁸として文献に記載され、調製された試料は、氷の結晶が5nm未満3サイズ得るために急速に凍結されます。この目的を達成するために、サンプルがありますエタン、プロパン、エタンまたはプロパンの混合物として、液体寒剤に突入。 1950年代以来、PFの改善は、より多くのユーザーにこの技術を利用できるようにするために行われてきました。 PFは広く画像小さな物体（<100 nmのに使用されるのに対し、高圧凍結は、現在、50ミクロン（ディスク状サンプルについて200μmの厚さまで^）5よりも厚い試料の多種多様を凍結するための唯一の実行可能な方法であります）、アモルファス氷⁹の薄膜に懸濁高分子複合体など。より大きなサンプルは、例えば、真核細胞は、PFによってcryofixedすることができるが、そのようなキャピラリー銅管またはサンドイッチシステム^8、10、11のように、試料ホルダーを必要とします。

ここでは、迅速で簡単に使用し、様々な懸濁細胞培養のために使用可能な低コストのプランジ凍結/凍結置換技術が提示されます。

プロトコル

ホルムバールグリッドフィルムの調製

注：個人用保護具（手袋、白衣、メガネ）を使用して、ヒュームフードの下でクロロホルム操作を実行します。 400のメッシュの電子顕微鏡銅グリッドを使用してください。他のグリッドタイプ（他のメッシュサイズ、金とニッケルグリッド）で、凍結の品質が悪化しています。

1. クロロホルム中の0.3％ホルムバール100mLの溶液を調製します。それは、攪拌せずに一晩溶解させます。
2. アセトンを含有するガラスバイアル（高さ3センチメートル及び径2a CM）中で400メッシュ（平方インチ当たりの穴の数）電子microscopycopperグリッド（直径3.05ミリメートル）を置きます。手の円運動でガラスバイアルをかき混ぜます。プラスチック製のトランスファーピペットを用いてアセトンを除去します。溶剤を5分間蒸発させます。濾紙上にそれらを注ぐことによって、グリッドを転送し、それらを5分間乾燥させます。
3. 滑り/光沢まで、糸くずの出ない布で拭いて76×26 mm ²のスライドガラスを研磨します。
4. 晶析装置（直径15センチメートル、高さ：7 cmであり、容量1200 ml）に取り、蒸留水で縁にそれを埋めます。ほこりを取り除くために二回表面にガラス棒を渡して、水面を清掃してください。
5. 二本の指の間にガラススライドを持ち、数秒間ホルムバール溶液中に浸し。 5分間逆さまにビーカーの下で乾燥するために直立それを保持。
6. 膜が乾燥しているときに、スライドから除去されるフィルムの限界を定義するために鋭利なカミソリの刃を用いてガラススライドのエッジのスコア。
7. 深呼吸をして、わずかに不透明なフィルムをレンダリングし、その視認性を高めるために、フィルムの上や下に水蒸気の層を得るために、スライド上に大きく息を吐きます。
   1. 直ちに約30°の角度でスライドの底に触れることにより、晶析装置の水面上に膜をフロート。スライドからフィルム剥離をしようと晶析装置の水面上にそれをはがします。ゆっくりとフィルムをやってのけますピンセット、必要に応じて。
8. 穏やかグリッドは適切な厚さ（約10nm）および皺なしである領域に水面に浮かぶ膜上伏せ置きます。
9. 彼らは晶析装置の水面に浮くようジョセフ・ペーパーでグリッドを覆うことによりフィルムをピックアップ。
   1. 片手でジョセフ紙を持ち、フィルムの一端にジョセフ紙の一方の端をタッチします。ジョセフ紙が完全に湿潤するまでお待ちください。引っかかってグリッドとジョセフの用紙を取り除きます。
10. 室温で使用する前に最終的な乾燥および保管のために覆われたペトリ皿で24時間グリッドを置き。

凍結置換培地の調製

注：四酸化オスミウム（のOsO _4）および酢酸ウラニルは、有害化学物質です。白衣や手袋など、適切な個人用保護具（PPE）を着用したままヒュームフードでそれらを扱います。 Foll（のOsO _4）を取り扱うための安全警告および酢酸ウラニルOW。 OsO ₄の漏れを避けるために、Oリングの凍結バイアルを使用します。

1. 超微細構造の研究
   1. ガラスフラスコにガラスのOsO ₄アンプルを入れてください。
   2. フラスコを振ってアンプルを破ります。
   3. 4％の最終濃度を得るために、アセトン100％の適切なボリュームを追加します。
   4. 攪拌し、1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分配します。
2. タンパク質の免疫標識
   1. ガラスフラスコに酢酸ウラニルを0.05gを置き。
   2. 100％のアセトン50mlを加えます。
   3. マグネチックスターラーで溶液を攪拌します。溶液が透明になったとき、0.2μmのフィルターを使用してフィルタリングします。
   4. 1.8 mLのクリオバイアルに1.5 mLのアリコートを分注します。
      注：プランジ凍結プロセスの前に、凍結置換媒体を含むクライオバイアルを準備し、-84℃の冷凍庫に保管してください。捨ててガラスフラスコを反転有害廃棄物中のOsO ₄アンプル。

細胞の調製

注：このステップは、方法の成功のために重要です。全ての細胞型のために、細胞の指示された数を得るために、細胞を増殖させます。指定された時間および速度で示される管内の遠心分離機。

1. 次のように異なる細胞型からのペレットの適切な整合性を得るために、細胞を増殖させます。
   1. サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びシゾサッカロミセス・ポンベのために、最小または完全液体培地5mlに酵母を接種します。 28℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物の600nmで（OD _600）での光学密度を測定します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD ₆₀₀に酵母細胞を希釈します。 1×10 ⁹酵母細胞^7を得るために、回転し、28℃で細胞をインキュベートし続けます。
   2. リーシュマニア鞭毛のために、イノ7.5％FCS（ウシ胎児血清）とAM培地5mlでculate寄生虫。 24℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD _600を測定_します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD ₆₀₀に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 ⁸寄生虫セル^12を得るために、回転し、24℃で細胞をインキュベートし続けます。
   3. トリパノソーマのために、10％FCSおよび30μgの/ mLのハイグロマイシンを用いてSDM-79培地5mLに寄生虫を接種します。 27℃、回転（180 rpm）で一晩インキュベートします。一晩培養物のOD _600を測定_します。 50mLの新鮮な選択培地中で0.2のOD ₆₀₀に寄生虫細胞を希釈します。 5×10 ⁸寄生虫細胞^13を得るために、回転、27℃で細胞をインキュベートし続けます。
   4. 大腸菌のために、100μg/ mLのアンピシリンを有するDYT培地5ml中の細菌を接種します。 （180回転、37℃で一晩インキュベートしますRPM）。一晩培養物のOD _600を測定_します。 0.2ミリリットル50新鮮な選択培地のOD ₆₀₀に細菌細胞を希釈します。 5×10 ¹⁰細菌細胞^14を得るために、回転し、37℃で細胞をインキュベートし続けます。
      注：一晩のインキュベーション後、培養中の細胞は、いずれかの対数または定常増殖期にあってもよいです。経験的に決定されるように非常にゆっくりと成長している細胞株は、一晩、または細胞のより多くの接種より長いインキュベーション時間を必要とするかもしれません。
2. 全ての細胞タイプについて、1500×gで3分間、50 mlのポリプロピレン製チューブと遠心分離機に細胞を含む培地を移します。
3. 上清を除去し、関連する細胞培養培地1ml中の全ての細胞型のペレットを再懸濁します。
4. 遠心3,900×gで1分間マイクロ遠心チューブ内の全ての細胞型。完全に上清を除去します。
5. 氷の上で細胞を保管してください。

4。プロパンの液化

注意：注意して液体窒素を処理します。 cryoglovesやゴーグルなどの個人保護具を使用してください。プロパンは、潜在的に爆発性であるため、風通しのよい部屋またはヒュームフードの下で液化を行います。裸火禁止は許可されません。

1. ポリスチレントレイに液体窒素の約150ミリリットルを入れました。それを凍結し、液体窒素中で真鍮カップ（高さ3.6センチメートル、径2a cmであり、厚さ1.5ミリメートル）を置きます。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。
2. 気泡が真鍮のカップが凍結されていることを確認するために治まるまで待ちます。
3. 真鍮カップ壁に接触してプロパンボンベに接続されたホースを入れてください。
4. ゆっくりプロパンボンベのバルブを開きます。
   注：このステップで、プロパンは真鍮カップで液化します。
5. プロパンボンベのバルブを閉じて、急速にガスホースを除去することにより、液状化を停止します。
6. 液体NIポリスチレントレーを充填真鍮カップの上部から5mmまでトローゲン。液体窒素は、真鍮のカップの中に浸透させないでください。

サンプルの5プランジ凍結

1. ポリスチレントレイに液体窒素の約200ミリリットルを入れました。液体窒素でそれらを置くことによって少し真鍮カップ（高さ直径1.5cm 2.5センチメートルと厚さ1ミリメートル）を凍結。 1つの懸濁細胞のサンプルに対して一杯に入れました。サンプルを混在しないように注意してください。このため、 などカップ2、で、カップ1のサンプル2をサンプル1を置きます。
2. 液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。
3. 3.5で得られたペレット中の針を解剖ダブルエッジプランジ。
4. ピンセットを使用して、セクション1で調製したホルムバールでコーティングされた400メッシュ銅顕微鏡グリッドを取ります。
5. 解剖針を使用して、グリッド上3.5で得られたペレットのドロップを置きます。異なる液滴サイズ（ 例えば、2、5、10μL）を試してみてください。
6. 非常に急速に液体プロパン遺伝子の中にピンセットで開催されたグリッドを急落4章で評価し、数秒間円運動でグリッドをかき混ぜます。
7. 急速にセクション5.1で凍結した小さな真鍮カップにピンセットで凍結されたグリッドを転送します。
   注：各試料について、少なくとも3つのグリッドを作ります。必ず、銅グリッドを取る前にピンセットを凍結します。

6.凍結置換

注：四酸化オスミウムが潜在的に揮発性であるので、蒸気カートリッジと空気浄化呼吸器を使用します。プランジ凍結も解決される前に液体窒素中で固定液を凍結。

1. 超微細構造研究のために、セクション2.1で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。免疫局在研究のために、セクション2.2で調製した凍結置換培地を含有する1.8mLのクライオバイアル管を開きます。クライオバイアルのキャップを置きます。
2. 液体窒素中でその先端を沈めることにより、ピンセットをフリーズします。
3. 急速にキャップを外し、冷凍グリッドiを転送しますピンセットを使用してクリオバイアルNTO。
4. バッククライオバイアルのキャップを置きます。
5. 各サンプルの各グリッドのための操作を繰り返します。
6. すべてのキャップを閉め、サンプルを凍結置換培地中であることを保証するために手の円運動とクリオバイアルをかき混ぜます。
7. 凍結置換処理中に-84℃の冷凍庫に3日間気密ボックス内の凍結バイアルを置きます。

7.サンプル温暖化

1. 微細研究
   1. -30℃の冷凍庫に（急激な温度上昇を回避するため）、ポリスチレントレーで凍結バイアルを運びます。 1時間-30℃の冷凍庫でそれらを置きます。
   2. 2時間にわたって-15℃のフリーザーで凍結バイアルを置きます。 2時間4℃でサンプルを置き、次いで室温で30分間インキュベートしました。
   3. プラスチック製のトランスファーピペットで凍結置換媒体を取り外します。 100％アセトンの約500μLを追加します。
   4. クライオバイアル1.8ミリリットルをかき混ぜます急速に円形の手の動きとを有するガラスバイアルにグリッド（高さ3センチメートル及び直径2cmに）を含むアセトン（1.5ml）に注ぎます。
   5. すべてのグリッドを転送してください100％アセトン1mLで同じクライオバイアルをすすぎます。手の円運動とクライオバイアルを攪拌し、ガラスバイアル中にクリオバイアルの内容を注ぎます。
   6. 10分間、100％アセトン3mLの3回各ガラスバイアルをすすぎます。
   7. 参照¹⁵で説明したように埋め込み、封入手順に従います。 （25％、50％、および75％）アセトン中のエポキシ樹脂の濃度を増加させてサンプルを含浸し、ゼラチンカプセル中の100％のエポキシ樹脂と試料を埋め込みます。
2. 免疫標識の研究
   1. ポリスチレントレイに1.8 mLのクリオバイアルを運ぶ-30℃の冷凍庫に（急激な温度上昇を避けるため）。
   2. -30℃の冷凍庫に2時間クライオバイアルを置きます。
   3. -30°で Cフリーザーに入れ、手の円形の動きでクライオバイアルを攪拌し、ポリプロピレンバイアル（高さ5cmおよび直径1.5cm）に凍結置換媒体を急速に注ぐ。
   4. 凍結置換培地を2 mlの新しい凍結置換培地で置換する。
   5. ポリプロピレンバイアルを-30℃の冷凍庫に2時間入れます。
   6. ポリプロピレンバイアルを100mLの2mLのアセトンで1時間、100mLの2mLのエタノールで3時間3回洗浄します。
   7. 参考文献¹⁵に記載されているように、埋め込みおよび包含手順に従ってください。サンプルをアクリル樹脂（25％、50％、および75％アセトン）の濃度を増加させて含浸させ、サンプルを100％アクリル樹脂でゼラチンカプセルに包埋する。

8.サンプルの可視化

1. 埋め込み後、サンプルの80nm超薄切片をウルトラミクロトームで作製する。セクションを2％クエン酸鉛と室温で1分間対照するお尻= "外部参照"> 15。
2. 切片^15を観察するために80キロボルト又は120 kVの電子顕微鏡を使用します。

結果

この記事では、超微細構造（ 図1及び図2）及び免疫標識（ 図3）研究のために使いやすく、低コストのプランジ凍結方法が提供されます。私たちは、凍結置換法のためと温暖化手続きではなく、専用のシステムを使用して、24時間の6時間未満を取ることを特別な機器を用意する必要はありませんこと?...

ディスカッション

TEMは、細胞小器官、細胞、および組織の微細構造観察するための強力な方法です。低温固定/凍結置換は現在、超微細構造とタンパク質の抗原性の両方の保全のための最善の方法です。化学固定剤は、超微細²の完全な安定化の前に構造的再編成を許可することにより、非常にゆっくりと浸透し、行動します。逆に、低温固定/凍結置換は瞬時に細胞構造^4を?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11