Freezing Plunge: Ein Werkzeug für den Elektronenmikroskopische und Immunolokalisation Studium der Suspensionszellen in Transmissions-Elektronen-Mikroskopie

Zusammenfassung

Diese Handschrift beschreibt eine einfach zu bedienende und kostengünstige Methode zum Kryofixation Suspensionszellen durch Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar zu machen.

Zusammenfassung

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein außergewöhnliches Werkzeug für die Ultrastruktur der Zelle zu studieren, um die Proteine ​​zu lokalisieren und makromolekularen Komplexe mit sehr hohen Auflösung sichtbar zu machen. Doch so nah wie möglich an den nativen Zustand, perfekte Probenkonservierung zu bekommen ist nicht erforderlich. Herkömmliche Elektronenmikroskopie (EM) Fixierung mit Aldehyden, zum Beispiel, bietet keine gute ultra Erhaltung. Die langsame Eindringen von Fixateure induziert Zell-Reorganisation und Verlust verschiedener Zellkomponenten. Daher tritt herkömmliche EM Fixierung nicht für eine sofortige Stabilisierung und Konservierung von Strukturen und Antigenität ermöglichen. Die beste Wahl intrazelluläre Ereignisse für die Prüfung ist Kryofixation durch das Verfahren gefrier Substitution Fixierung gefolgt zu verwenden, die Zellen in ihrem nativen Zustand hält. Hochdruck-Gefrier / Gefriersubstitution, die die Integrität der zellulären Ultrastruktur bewahrt, ist die am häufigsten verwendete Methode, erfordert aber expensive Ausrüstung. Hier eine einfach zu bedienende und kostengünstige Gefriertfixationsmethode gefolgt von Gefriersubstitution für Suspensionszellkulturen vorgestellt.

Einleitung

Die Probenvorbereitung ist für den Erfolg eines jeden Elektronenmikroskopie Studie kritisch. Herkömmliche EM Fixierung war die primäre Methode für Gewebe oder Zellen für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ¹ fixiert. Erstens, Aldehyde und Osmiumtetroxid verwendet werden, um chemisch das Material bei Raumtemperatur fest. Dann wird das Material mit organischen Lösemitteln dehydratisiert, infiltriert und in Epoxyharz eingebettet. Dieses Verfahren ist auf die Penetrationsrate von Fixierungsmittel in die Zelle abhängig. Folglich werden die Artefakte und Extraktion von Zellinhalt in der Regel ² beobachtet.

Kryofixation ist eindeutig eine bessere Alternative für die Erhaltung der Zellstrukturen ^3, sie intakt zu halten. Die höchste Qualität der TEM - Aufnahmen ⁴ in dünnen Harzabschnitte können mit Hilfe der Kryofixation / Gefriersubstitution Verfahren erhalten werden. Das Ziel dieser Technik ist verglast bi zu erhaltengischen Proben ohne Eiskristalle Bildung oder Eiskristalle enthalten klein genug, um nicht die Ultrastruktur der Zellen zu beschädigen. Hochdruck-Gefrieren (HPF) und ultra-schnelle Kryofixation, die auch plunge Gefrieren (PF) genannt wird, sind zwei Methoden Proben cryofix. HPF bewegungsunfähig Moleküle in der Zelle augenblicklich und vermeidet die durch herkömmliche EM Fixierung verursacht wird. Verschiedene Arten von Gefriermaschinen und automatische Substitution Geräte wurden ⁵ entwickelt. Die Gefriermaschinen und Verbrauchsmaterialien (flüssiger Stickstoff, Probenträger, etc.) sind teuer, aber sie ermöglichen die Herstellung qualitativ hochwertige elektronenmikroskopische Aufnahmen ^{6, 7.} PF ist eine Technik , die in den frühen 1950er Jahren verwendet wurde und wird in der Literatur als einfach und billig ⁸ .Während die PF Verfahren, die vorbereitete Probe mit einer schnellen Rate eingefroren wird beschrieben Eiskristalle Größe von weniger als 3 bis 5 nm zu erhalten. Zu diesem Zweck wird die ProbeIn ein flüssiges Kryogen, wie Ethan, Propan oder ein Ethan-Propan-Gemisch eingetaucht. Seit den 1950er Jahren wurden Verbesserungen von PF durchgeführt, um diese Technik einer größeren Anzahl von Benutzern zur Verfügung zu stellen. Hochdruckgefrieren ist derzeit der einzige lebensfähige Weg, um eine große Vielfalt von Proben dicker als 50 μm (bis zu einer Dicke von 200 μm für scheibenförmige Proben) ⁵ , während PF weit verbreitet ist, um kleine Objekte (<100 nm ), Wie makromolekulare Komplexe, die in einem dünnen Film aus amorphem Eis ⁹ suspendiert sind. Größere Proben, beispielsweise eukaryotische Zellen, können durch PF kryofixiert werden, benötigen aber Probenhalter, wie Kapillarkupferrohre oder Sandwich-Systeme ^{8 , 10 , 11} .

Hier wird eine schnelle, einfach zu bedienende und kostengünstige Einfrier- / Gefrier-Substitutionstechnologie vorgestellt, die für verschiedene Suspensionszellkulturen verwendbar ist.

Protokoll

1. Herstellung von Formvar Grid Film

HINWEIS: Führen Sie Chloroform Manipulation unter einer Abzugshaube persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Kittel, Brille). Verwenden Sie 400 mesh Elektronenmikroskopie Kupfergitter. Mit anderen Netztypen (andere Maschengrößen, Gold und Nickel Grids), ist die Qualität des Einfrierens schlechter.

1. Vorbereiten einer 100 ml-Lösung von 0,3% Formvar in Chloroform. Lassen Sie es über Nacht ohne Rühren auflösen.
2. Setzen 400 Mesh (Anzahl der Löcher pro Quadratzoll) Elektronen microscopycopper Gitter (Durchmesser 3,05 mm) in einem Glasfläschchen (Höhe und 3 cm Durchmesser 2 cm) mit Aceton. Rührt das Glasfläschchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand. Entfernen des Acetons mit einer Kunststoff-Transferpipette. Das Lösungsmittel für 5 min zu verdampfen. Übertragen, die Gitter, indem sie auf ein Filterpapier gegossen, und es ihnen ermöglichen, für 5 Minuten zu trocknen.
3. Polier ein 76 x 26 mm ² Glasträger indem sie mit einem fusselfreien Tuch , bis glänzend / rutschigem Abwischen.
4. Nimm einen Kristallisator (Durchmesser 15 cm, Höhe: 7 cm und Kapazität 1200 ml) und fülle mit destilliertem Wasser bis zum Rande. Reinigen der Wasseroberfläche durch einen Glasstab über die Oberfläche verläuft zweimal Staub zu entfernen.
5. Halten Sie die Glasobjektträger zwischen zwei Fingern und tauchen sie in die Formvar-Lösung für einige Sekunden. Halten Sie es aufrecht unter einem Upside-Down-Becher für 5 Minuten trocknen lassen.
6. Wenn der Film trocken ist, mit einer scharfen Rasierklinge, die Ränder der Glasträger punkten die Grenzen des Films zu definieren, von der Folie abgelöst werden.
7. Atmen Sie tief ein und ausatmen stark auf die Folie eine Schicht aus Wasserdampf erhalten auf und unter dem Film den Film leicht opak und verbessern die Sichtbarkeit zu machen.
   1. Unmittelbar schwebt die Folie auf die Kristallisator Wasseroberfläche durch den unteren Rand der Folie mit einem Winkel von etwa 30 ° zu berühren. Lassen Sie den Film Freigabe von der Rutsche und schälen sie auf den Kristallisator Wasseroberfläche ab. Ziehen Sie den Film mit der ausPinzette, falls erforderlich.
8. Sanft lag die Gitter auf dem Film in den Bereichen auf der Wasseroberfläche schwimmenden Seite nach unten, die von der richtigen Dicke (etwa 10 nm) und ohne Falten sind.
9. Nimm den Film durch Abdecken der Gitter mit Joseph Papier , wie sie auf der Kristallisator Wasseroberfläche schwimmen.
   1. das Joseph-Papier mit einer Hand zu halten, ist ein Ende des Joseph Papier zu einem Ende des Films berühren. Warten Sie, bis das Joseph Papier vollständig nass ist. Entfernen Sie die Joseph-Papier mit den Gittern aufgeklebt.
10. Platzieren Sie die Gitter für 24 h in einer bedeckten Petrischale für die endgültige Trocknung und Lagerung vor bei Raumtemperatur verwenden.

2. Herstellung von Gefriersubstitution Medium

HINWEIS: Osmiumtetroxid (OsO ₄₎ und Uranylacetat sind gefährliche Chemikalien. Behandeln Sie sie im Abzug, während geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen (PSA) mit einem Laborkittel und Handschuhe. Follow Sicherheitswarnungen für die Handhabung (OsO ₄₎ und Uranylacetat. Verwendung von O-Ring - Kryoröhrchen die Leckage von OsO ₄ zu vermeiden.

1. Elektronenmikroskopische Untersuchungen
   1. Setzen Glas OsO ₄ Ampulle in einem Glaskolben.
   2. Brechen Sie die Ampulle durch Schütteln des Kolbens.
   3. Hinzufügen einer geeigneten Volumen Aceton 100% 4% Endkonzentration zu erhalten.
   4. Umrühren und verteilen 1,5 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen.
2. Protein Immunmarkierung
   1. Platzieren 0,05 g Uranylacetat in einem Glaskolben.
   2. In 50 ml 100% Aceton.
   3. Man rührt die Lösung mit einem Magnetrührer gerührt. Wenn die Lösung klar wird, filtern sie einen 0,2 um-Filter.
   4. Dispense 1,5 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen.
      HINWEIS: Bereiten Sie die Kryoröhrchen Gefriersubstitution enthaltenden Medium vor dem Tauchgefrierverfahren und halten sie in -84 ° C Gefrierschrank. Kehren Sie die Glaskolben wegzuwerfen dieOsO ₄ Ampulle in den Sondermüll.

3. Herstellung von Zellen

HINWEIS: Dieser Schritt ist für den Erfolg des Verfahrens kritisch ist. Für alle Zelltypen, wachsen Zellen, die die angegebene Anzahl von Zellen zu erhalten. Zentrifuge in dem angegebenen Rohr zu der angegebenen Zeit und Geschwindigkeit.

1. Um die geeignete Konsistenz der Pellets aus verschiedenen Zelltypen zu erhalten, wachsen Zellen wie folgt:
   1. Für Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe, Beimpfung von Hefe in 5 ml Minimal oder vollständigen flüssigen Mediums. über Nacht bei 28 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD ₆₀₀₎ der Übernachtkultur. Verdünnte Hefezellen bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 28 ° C inkubieren, Drehen , um 1 x 10 ^{9 7} Hefezellen.
   2. Für Leishmania flagellum, inoculate Parasiten in 5 ml AM-Medium mit 7,5% FCS (fötales Kälberserum). über Nacht bei 24 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messen Sie die OD ₆₀₀ der Kultur über Nacht. Verdünnte Parasitenzellen bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 24 ° C inkubieren, Drehen , um 5 x 10 ⁸ Parasitenzellen ^12.
   3. Für Trypanosoma brucei, Beimpfung von Parasiten in 5 ml SDM-79 - Medium mit 10% FCS und 30 & mgr; g / ml Hygromycin. über Nacht bei 27 ° C inkubieren, Drehen (180 Upm). Messen Sie die OD ₆₀₀ der Kultur über Nacht. Verdünnte Parasitenzellen bis zu einer OD ₆₀₀ von 0,2 in 50 ml frischem Selektivmedium. Weiterhin Zellen bei 27 ° C inkubieren, Drehen , um 5 × 10 ⁸ Zellen ¹³ Parasiten.
   4. Für Escherichia coli, Beimpfung von Bakterien in 5 ml DYT - Medium mit 100 ug / ml Ampicillin enthält. über Nacht bei 37 ° C inkubieren, Drehen (180rpm). Messen Sie die OD ₆₀₀ der Kultur über Nacht. Verdünnte Bakterienzellen auf einen OD ₆₀₀ von 0,2 in 50 ml frischem selektivem Medium. Weiter zu Zellen bei 37 ° C inkubieren, Drehen , um 5 × 10 ¹⁰ Bakterienzellen ^14.
      HINWEIS: Nach Inkubation über Nacht wurden Zellen in Kultur können in entweder logarithmisch oder stationären Wachstumsphase sein. Sehr langsam wachsende Zellstämme können Inkubationszeiten länger als eine Nacht oder Impfung von einer größeren Anzahl von Zellen erfordern, wie empirisch ermittelt.
2. Für alle Zelltypen, übertragen das Kulturmedium, die Zellen zu 50 ml Polypropylen-Röhrchen und zentrifugiert für 3 min bei 1.500 x g enthält.
3. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet aller Zelltypen in 1 ml der jeweiligen Zellkulturmedium.
4. Zentrifuge alle Zelltypen in einem Mikrozentrifugenröhrchen für 1 min bei 3.900 x g. vollständig entfernen Sie den Überstand.
5. Halten Sie die Zellen auf Eis.

4. Verflüssigung von Propan

Hinweis: Die beim Umgang mit flüssigem Stickstoff mit Vorsicht. Persönliche Schutzausrüstung einschließlich cryogloves und Brillen. Propan ist potentiell explosiv, so führt die Verflüssigung in einem gut belüfteten Raum oder unter einer Abzugshaube. Kein offenes Feuer ist nicht erlaubt.

1. Setzen etwa 150 ml flüssiger Stickstoff in einer Polystyrolschale. Legen Sie eine Messingbecher (Höhe 3,6 cm, Durchmesser 2 cm und Dicke 1,5 mm) in flüssigem Stickstoff sie einzufrieren. Nicht der flüssige Stickstoff in die Messingbecher eindringen lassen.
2. Warten Sie, bis die Blasen sicher sein abklingen, dass die Messingbecher eingefroren.
3. Setzen Sie den Schlauch an die Propangasflasche in Kontakt mit der Messing Topfwandung verbunden.
4. öffnen sanft das Propan Flaschenventil.
   HINWEIS: Bei diesem Schritt verflüssigt das Propan in den Messingbecher.
5. Stoppen Sie die Verflüssigung des Propan Flaschenventil schließen und schnell den Gasschlauch zu entfernen.
6. Füllen Sie das Polystyrolschale mit flüssigem nitrogen bis zu 5 mm von der Oberseite der Messingbecher. Nicht der flüssige Stickstoff in Messingbecher eindringen lassen.

5. Plunge Einfrieren der Probe

1. Setzen etwa 200 ml flüssiger Stickstoff in Polystyrolschale. Gefriert kleine Messingbecher (Höhe 1,5 cm Durchmesser 2,5 cm und Dicke 1 mm), indem sie in flüssigem Stickstoff setzen. Legen Sie eine Tasse für eine Suspensionszellprobe. Achten Sie darauf, Proben zu mischen. Zu diesem Zweck setzte die Probe 1 in der Tasse 1, Probe 2 in Becher 2 usw.
2. Frieren der Pinzette durch ihre Spitze in flüssigem Stickstoff eintauchen.
3. Tauchen einer Doppelkante Präpariernadel im Pellet in 3,5 erhalten.
4. Mit einer Pinzette ergreifen ein 400 mesh Kupfergitter Mikroskopie mit Formvar in Abschnitt 1 hergestellt, beschichtet.
5. Unter Verwendung des Präpariernadel, einen Tropfen des Pellets in 3,5 auf dem Gitter erhalten wird. Probieren Sie verschiedene Tropfengrößen (zB 2, 5 und 10 & mgr; l).
6. Sehr schnell das Gitter durch die Pinzette in flüssiges Propan Gene gehalten stürzenin Abschnitt 4 und rühren das Gitter mit kreisförmiger Bewegung für einige Sekunden bewertet.
7. Schnell überträgt das gefrorene Gitter mit der Pinzette in die kleinen Messingbecher in Abschnitt 5.1 eingefroren.
   HINWEIS: Für jede Probe macht mindestens 3 Gitter. Immer die Pinzette einfrieren, bevor ein Kupfernetz nehmen.

6. Gefriersubstitution

HINWEIS: Osmiumtetroxid ist möglicherweise volatil, so mit Dampf Patronen ein Luftfiltergerät verwenden. das Fixiermittel in flüssigem Stickstoff vor dem Eintauchen Einfrieren Einfrieren ist ebenfalls eine Lösung.

1. Für Ultra Studien, öffnet die 1,8 ml Kryoröhrchen Röhren gefrierSubstitutionsMedium in Abschnitt 2.1 enthalten, hergestellt. Für Immunolokalisation Studien, öffnet die 1,8 ml Kryoröhrchen Röhren gefrierSubstitutionsMedium in Abschnitt 2.2 enthalten, hergestellt. Setzen Sie die Kappe auf dem Kryovials.
2. Frieren der Pinzette durch ihre Spitze in flüssigem Stickstoff eintauchen.
3. Schnell die Kappe entfernen und die gefrorenen Gitter i übertragennde Kryovials mit der Pinzette.
4. Setzen Sie die Kappe wieder auf dem Kryovials.
5. Wiederholen Sie die Operation für jedes Raster von jeder Probe.
6. Schließen Sie alle Kappen und rühren Sie die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand der Proben, um sicherzustellen, in dem Gefriertsubstitutionsmedium sind.
7. Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einem luftdichten Kasten 3 Tage lang in einem -84 ° C-Gefrierschrank während des Gefriertsubstitutionsprozesses.

7. Proben Warming

1. Ultra Studien
   1. Trägt die Kryoröhrchen in einer Polystyrol-Schale (ein plötzliches Ansteigen der Temperatur zu vermeiden) auf eine -30 ° C Gefrierschrank. Legen Sie sie in der -30 ° C Gefrierschrank für 1 h.
   2. Platzieren Sie die Kryoröhrchen in einen -15 ° C Gefrierschrank für 2 h. Platzieren Sie die Proben bei 4 ° C für 2 h und dann 30 min bei Raumtemperatur.
   3. Entfernen des Einfrierens Substitutionsmedium mit einer Kunststoff-Transferpipette. In etwa 500 & mgr; l 100% Aceton.
   4. Rühre das 1,8 ml Kryoröhrchenmit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und gießt das schnell Aceton (1,5 ml), die Gitter in einem Glasfläschchen (Höhe und 3 cm Durchmesser 2 cm) enthält.
   5. Spülen Sie die gleiche Cryovial mit 1 ml 100% Aceton sicher sein, alle Netze zu übertragen haben. Rühren Sie die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und schütten den Inhalt der Kryoröhrchen in einen Glaskolben.
   6. Spülen jedes Glasfläschchen mit 3 ml 100% igem Aceton 3 Mal für 10 min.
   7. Folgen der Einbettung und Inklusion Verfahren wie in Referenz ¹⁵ beschrieben. Imprägnieren, um die Probe mit Konzentrationen von Epoxidharz in Aceton (25%, 50% und 75%) und Einbetten die Probe mit 100% Epoxidharz in Gelatinekapseln zu erhöhen.
2. Immunmarkierung Studien
   1. Tragen die 1,8 ml Kryoröhrchen in einer Polystyrolschale mit dem -30 ° C Gefrierschrank (ein plötzliches Ansteigen der Temperatur zu vermeiden).
   2. Platzieren Sie die Kryoröhrchen für 2 h in einem -30 ° C-Gefrierschrank.
   3. In einem -30 ° C Gefrierschrank, rührt die Kryoröhrchen mit einer kreisförmigen Bewegung der Hand und schnell das Gefriertsubstitutionsmedium in einer Polypropylenampulle (Höhe 5 cm und Durchmesser 1,5 cm) gießen.
   4. Ersetzen des Einfrierens Substitutions Medium mit 2 ml frischem gefrierSubstitutionsMedium.
   5. Platzieren Sie die Polypropylenfläschchen für 2 h in einem -30 ° C-Gefrierschrank.
   6. Spülen Sie das Polypropylenfläschchen für 1 h mit 2 ml 100% igem Aceton und dreimal für 1 h mit 2 ml 100% igem Ethanol.
   7. Folgen der Einbettung und Inklusion Verfahren wie in Referenz ¹⁵ beschrieben. Imprägnieren, um die Probe mit steigenden Konzentrationen von Acrylharz (25%, 50% und 75% in Aceton) und Einbetten die Probe mit 100% Acrylharz in Gelatinekapseln.

8. Visualization of Samples

1. Nach dem Einbetten, stellt 80 nm ultra-dünne Schnitte der Proben mit einem Ultramikrotom. Kontrast, um die Abschnitte mit 2% Bleicitrat bei Raumtemperatur für 1 minass = "xref"> 15.
2. Verwenden , um ein 80 kV oder 120 kV Elektronenmikroskops die Abschnitte ¹⁵ zu beobachten.

Ergebnisse

In diesem Artikel wird eine einfach zu bedienende und kostengünstige Tauchgefrierverfahren für ultrastrukturelle (Abbildungen 1 und 2) und Immunmarkierung (Abbildung 3) Studien vorgestellt. Wir zeigen, dass es nicht notwendig ist, spezielle Ausrüstung für die Gefriert Auswechselbestimmungen zu haben und dass die Erwärmung Vorgang dauert weniger als 6 h statt der 24 h ein dediziertes System.

Diskussion

TEM ist eine leistungsfähige Methode für die ultrastrukturelle Beobachtung von Organellen, Zellen und Geweben. Kryofixierung / Gefrier-Substitution ist derzeit die beste Methode zur Erhaltung der Ultrastruktur- und Protein-Antigenität. Chemische Fixiermittel durchdringen und wirken sehr langsam, wodurch strukturelle Umlagerungen vor der vollständigen Stabilisierung der Ultrastruktur ^{2 möglich sind} . Umgekehrt stabilisiert die Kryofixierung / Gefrier-Substitution sofort die Zellstrukturen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11