脂肪干细胞的软骨细胞分化诱导离心重力

摘要

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

摘要

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

引言

在关节软骨缺损不自然愈合。因此，干细胞移植已被提出作为削弱的软骨的修复一个有前途的方法。然而，该方法需要有足够数量的干细胞的同时获取和这些细胞的诱导来进行软骨细胞分化。骨髓（BM）已被广泛使用作为干细胞的来源，但是从骨髓细胞分离有两个主要的缺点:侵袭和产量不足。因为它易于获得的，脂肪组织是干细胞的一个优选来源。以往的研究表明，从脂肪组织中分离干细胞和诱导用细胞因子，如^TGF-β11,2这些细胞软骨分化的可行性。这些方法是有效的，但价格昂贵。

作为一个成本较低的替代细胞因子，机械应力可以用来诱导软骨细胞分化。机械加载在维持关节软骨³的健康至关重要的作用，并且它可以诱导各种细胞软骨表型。例如，静水压经由MAP激酶/ JNK途径⁴诱导滑膜衍生的祖细胞的软骨形成的表型，和机械压缩通过上调软骨基因⁵诱导软骨在人类间质干细胞（MSCs）。此外，剪切应力有助于软骨相关的细胞外基质（ECM）的人MSC ⁶的表达。离心重力（CG），离心产生很容易地应用和控制的机械应力，可诱导细胞⁷差异表达基因。例如，在肺上皮癌细胞，白细胞介素（IL）-1b的表达通过离心⁸上调。 ŧherefore，作为实验诱导机械应力，CG可用于诱导干细胞软骨基因表达。然而，它的CG能否诱导干细胞的软骨细胞分化还不清楚。

在这项研究中，我们发现，CG诱导SOX9的上调，软骨的主要调控，在人类携带者，导致软骨细胞基因的过度表达。此外，我们比较的CG上与TGF-β1的软骨的影响，生长因子最常用于在体外诱导软骨中的干细胞。

研究方案

该研究方案是根据美国国立卫生研究院的指导方针批准由韩国天主教大学（KC16EAME0162）的机构审查委员会和执行。与书面知情同意书，得到的所有组织。

1.离心重力加载和颗粒文化

1. 细胞培养和收获
   1. 培养的ASC（P2-P3;见材料的列表）在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的Dulbecco改良的Eagle氏培养基，低葡萄糖（DMEM-LG）中于37℃下在含有5％CO ₂的加湿培养箱。
   2. 当细胞达到80％汇合时，丢弃培养基，用5ml 1×磷酸盐缓冲盐水的（PBS）洗涤细胞。
   3. 添加1毫升的PBS含1mM EDTA的的并在含有5％CO ₂的潮湿培养箱中于37℃孵育2分钟。
   4. 轻轻敲击培养板中，添加4毫升新鲜培养基中，将细胞转移到有15毫升锥形管，并离心将细胞在250×g下在室温（RT）下2分钟。
2. 离心重力加载
   1. 离心（步骤1.1.4）后，除去上清而不会干扰沉淀并用10％的FBS重悬在10mL的DMEM-LG的沉淀。算使用血球细胞。
   2. 对于CG装载，转移2.5×10 ^5个细胞到一个新的15毫升锥形管和离心机2400×g的15分钟。
3. 团培养
   1. 立即离心后，吸出上清液，并添加定义软骨分化培养基500μL的（CDM，高糖DMEM补充有1％FBS，1％ITS +预混料，100nM的地塞米松，1×MEM非必需氨基酸溶液，50微克/ mL的L-脯氨酸，和1％青霉素/链霉素）。在每次更换培养基添加新鲜制备的L-抗坏血酸-2-磷酸的50微克/毫升。作为阳性对照，诱导软骨differentiati在uncentrifuged细胞通过加入CDM含有10纳克/毫升TGF-β1。
   2. 放置装有粒料松散封管在站立位置并在含有5％CO ₂的潮湿培养箱中于37℃孵育。
   3. 改变介质隔日3周。
4. 微团培养
   1. 离心（步骤1.2.2; 2400×g的15分钟）后，立即吸出上清液和悬浮颗粒在CDM的10微升。
   2. 为了形成微团，将重悬的细胞在24孔板的孔的中心。
   3. 2小时后，小心地加入1毫升CDM向好，对板材的墙吸液，以免破坏微团。作为阳性对照，通过将含有10纳克/毫升TGF-β1的CDM执行与uncentrifuged细胞微团培养。
   4. 孵育在37℃的微团在含5％CO ₂的加湿培养箱。
   5. 改变介质EVERY一天3周。

2.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测软骨分化标志转录上调

1. 在第14天，用一个移液管，以1×PBS中的球体粒料转移到一个新的1.5毫升管中并把它们洗干净。
2. 提取使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法⁹颗粒中的总RNA。
3. 从根据制造商的方案使用逆转录酶的总RNA的2微克合成cDNA（孵育在42℃进行1小时，然后使酶失活，在70℃，5分钟）。
4. 用特异于软骨细胞分化标志物¹⁰的引物进行PCR。

3.染色检测软骨分化标志蛋白的表达

1. 石蜡包埋细胞团
   1. 在第21天，用吸管收获球体粒料和用1×PBS洗涤。
   2. 固定在4％低聚甲醛通过浸渍球体粒料24小时。
      注意:多聚甲醛是高毒。避免与眼睛，皮肤或粘膜接触。尽量减少暴露，并避免在制备过程中吸入。穿戴合适的个人防护装备。
   3. 丢弃固定液和冲洗用去离子水（DW）的细胞沉淀。
   4. 放置纱布一层到所述盒，并用移液管转移固定粒料。通过折叠的纱布覆盖颗粒并关闭盒盖。
   5. 脱水粒料。
      1. 沉浸在70％乙醇（EtOH中）的粒料在室温下5分钟。
      2. 沉浸在80％EtOH中的粒料在室温下5分钟。
      3. 沉浸在95％EtOH中的粒料在室温下5分钟。
      4. 浸泡在100％的乙醇的粒料在室温下5分钟。重复两次。
      5. 浸泡在100％二甲苯粒料在室温15分钟。重复TWICE。
   6. 嵌入在石蜡中固定细胞沉淀在56℃下在模具中;粒料可以使用专门的自动组织处理系统被嵌入到石蜡中。
   7. 从用旋转切片机的石蜡包埋细胞沉淀切成5微米厚的切片。
   8. 浮动部分在50％EtOH中，然后用幻灯片将它们转移到50℃的水浴中。
   9. 浮动部分放置到幻灯片。
2. 番红O和阿尔新蓝染色
   1. 再水合石蜡切片。
      1. 沉浸在二甲苯幻灯片15分钟。重复两次。
      2. 浸泡在100％EtOH中的幻灯片5分钟。重复两次。
      3. 沉浸在90％EtOH中的幻灯片5分钟。
      4. 沉浸在80％EtOH中的幻灯片5分钟。
      5. 浸入70％乙醇的幻灯片5分钟，然后把它们洗干净在1X PBS。
   2. 染色再水化切片用1％的番红O解决方案和3％阿尔新蓝为30分钟。
   3. 丢弃染色液并用DW冲洗部分。
   4. 染色用苏木精/曙红溶液（染液）中1分钟的部分。
   5. 丢弃染色液并用DW冲洗部分。
   6. 将安装介质上盖玻片下降消除任何残余的水后。小心地将含所述安装平台盖玻片滑动（细胞面朝下）。
   7. 允许载片干燥，在室温2-3小时。
   8. 使用明场显微镜（自动直立式显微镜，50倍和200倍）拍摄图像。
3. 免疫荧光法
   1. 补充水分的章节，如第3.2.1所述。
   2. 沉浸在柠檬酸钠缓冲液的幻灯片（10mM柠檬酸钠，0.05％吐温20，pH 6.0）中，然后用微波在子沸点温度保持他们10分钟。
   3. 酷幻灯片在室温下20分钟，然后用自来水清洗。
   4. 孵育载玻片在3％_的 H ₂ O _2（在1×PBS）中15分钟，然后把它们洗干净用自来水15分钟^11。
   5. 封锁1小时封闭缓冲液（在PBS中的10％正常山羊血清）的幻灯片。
   6. 吸出封闭溶液，然后应用，用5％正常山羊血清稀释到幻灯片的第一抗体。
   7. 过夜孵育载玻片于4℃。
   8. 洗玻片三次在1×PBS中，每次5分钟。
   9. 孵育在黑暗用5％正常山羊血清在RT稀释1小时荧光标记的第二抗体的幻灯片。
   10. 洗玻片三次在1×PBS中，在黑暗中，每次5分钟。
   11. 孵育载玻片用DAPI（1微克/毫升）10分钟，然后把它们洗干净两次在1×PBS中，每次5分钟。
   12. 将安装介质上盖玻片下降消除任何残余的水后。小心地将安装介质上的滑动（细胞面朝下）。
   13. 允许的幻灯片干燥2-3在RT的黑暗小时。
   14. 可视化使用荧光显微镜玻片（RHOD:594纳米，DAPI:340纳米; 60X和200倍^）12。

结果

离心重力诱导的脂肪来源的干细胞的软骨形成分化标记物的表达。

以确定的离心力重力是适于诱导软骨细胞分化的程度，携带者用15分钟不同程度的CG（0，300，600，1200，2400 XG）刺激。刺激之后，将携带者进行了重新接种到培养板和培养24小时。如在图1A中所示，SOX9 mRNA表达显著2400 xg离心增加;它是约2400 XG比（携带?...

讨论

细胞的干性状态为SOX9的CG诱导过表达非常重要的。在我们的研究中，SOX9的表达可以通过CG在早期传代的ASC（2-3）引起的，而不是在后面通道的ASC。已经报道的是，在培养过程中，携带者包含CD34 +细胞，直至3代^16。的ASCs往往失去的CD34的表达作为将细胞传代，从而产生至CG低响应。

离心重力，静水压力可以刺激CG过程中加载到细胞。因此，介质的体积可能是影?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells