원심 중력에 의해 지방이 유래 줄기 세포의 연골 분화 유도

요약

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

초록

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

서문

관절 연골의 결함은 자연적으로 치유되지 않습니다. 따라서, 세포 이식이 손상 연골의 수리를 위해 유망한 방법으로 제안 된 줄기. 그러나,이 방법은 줄기 세포의 충분한 수의 취득 및 연골 분화를 받아야하는 이러한 세포의 유도를 모두 요구한다. 골수 (BM)은 널리 줄기 세포의 공급원으로서 사용되었지만, BM 세포의 분리는 두 가지 단점이있다 : 침입 불충분 수율. 때문에 취득 용이성, 지방 조직에서 줄기 세포의 바람직한 소스이다. 이전의 연구는 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리 및 TGF-β1 ^{(1, 2)과} 같은 사이토 카인을 사용하여 이들 세포의 연골 분화를 유도하는 가능성을 입증 하였다. 이러한 방법은 효과가 있지만 비싸다.

사이토킨에 대한 저비용 대안으로서, 기계적 응력에 사용될 수있다연골 분화를 유도한다. 기계적 부하는 관절 연골 ^(3)의 상태를 유지하는데 중요한 역할을하고, 여러 가지 세포의 연골 세포 표현형을 유도 할 수있다. 예를 들어, 수압은 MAP 키나아제 / JNK 경로 ^4를 통해 활막 유래 전구 세포의 연골 세포 표현형을 유도하고, 기계 압축비는 연골 세포의 유전자 ⁵ 상승 조절하여 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)에서 연골을 유도한다. 또한, 전단 응력은 인간 중간 엽 줄기 세포의 연골 ⁶ 관련된 세포 외 기질 (ECM)의 발현에 기여한다. 원심 중력 (CG)를 원심 분리에 의해 용이하게 생성 된인가 제어 기계적 응력은 셀 ^7에서 차등 유전자 발현을 유도 할 수있다. 예를 들어, 폐 상피 암종 세포에서 인터루킨 (IL) -1b의 발현을 원심 분리 ^(8)에 의해 상향 조절된다. 티herefore, 실험적으로 유도 기계적 응력으로서, CG는 줄기 세포의 연골 세포에서 유전자 발현을 유도 할 수있다. 그러나, CG는 줄기 세포의 연골 분화를 유도 할 수 있는지 불분명.

본 연구에서는 CG가 연골 세포 유전자의 과발현의 결과로, 인간의 ASC에서, SOX9의 상향 조절, 연골의 마스터 레귤레이터를 유도 한 것으로 나타났습니다. 또, TGF-β1의 것과 연골에 CG의 효과, 성장 인자는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 시험 관내 연골을 유도하는 데 비해.

프로토콜

이 연구 프로토콜은 NIH 지침에 따라 가톨릭 대학교 (KC16EAME0162)의 기관 검토위원회의 승인을 수행 하였다. 모든 조직은 서면 통보 동의를 얻었다.

1. 원심 중력로드 및 펠렛 문화

1. 세포 배양 및 수확
   1. 배양의 ASC (P2-P3, 자재 목록 참조), 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 낮은 글루코즈 (DMEM-LG)에서 5 % CO _2를 포함하는 가습 인큐베이터있다.
   2. 세포가 80 % 합류에 도달했을 때, 배지를 버리고 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다.
   3. PBS 함유 1mM의 EDTA 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO _2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 분간 배양한다.
   4. 에 세포를 전송, 부드럽게 문화 판을 눌러 새로운 배지 4 mL를 넣고15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 실온에서 2 분 (RT) 250 × g에서 세포.
2. 원심 중력 하중
   1. 원심 분리 (단계 1.1.4) 후, 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거하고, 10 % FBS와 DMEM-LG 10ml에 펠렛을 재현 탁. 혈구 세포를 사용하여 계산.
   2. CG로드를 들어, 15 분 동안 2,400 × g에서 새로운 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 2.5 × 10 ⁵ 세포를 전송합니다.
3. 펠렛의 문화
   1. 즉시 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 정의 연골 분화 배지 500 μL를 추가 (CDM은 고 글루코스 DMEM는 1 % FBS, 1 % ITS + 프리믹스, 100 나노 덱사메타손, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액, 50 μg의 보충 / ㎖ L - 프롤린, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 모든 매체 변화에 새로 제조 된 L- 아스 코르 빈산 2- 인산의 50 μg의 / ML을 추가합니다. 양성 대조군으로, 연골 유도 differentiati추가하여 원심 분리하지 않은 세포에 CDM은 10 NG / mL의 TGF-β1을 포함.
   2. 서 위치 펠렛을 함유하는 튜브를 캡핑 느슨하게 삽입하고, 5 % CO _2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
   3. 삼주 위해 매일 매체를 변경합니다.
4. Micromass 문화
   1. 즉시 원심 분리 (단계 1.2.2 15 분 동안 2,400 ×의 g) 후, 뜨는을 대기음 및 CDM의 10 μL에 펠렛을 재현 탁.
   2. micromass을 형성하기 위해, 24- 웰 플레이트의 웰의 중앙에 재현 탁하고 세포를 배치했다.
   3. 2 시간 후, 조심스럽게 micromass을 방해하지 않도록 접시의 벽에 잘 피펫에 CDM 1 mL를 넣어. 양성 대조군으로, 10 NG / ㎖ TGF-β1을 포함하는 CDM을 첨가하여 원심 분리하지 않은 세포와 micromass 배양을 수행한다.
   4. 5 % CO _2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양 한 micromass.
   5. 매체 EV 변경삼주에 대한 다른 일 ERY.

2. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 연골 세포 분화 마커 전사 상향 조절을 검출하도록

1. 14 일에, 1X PBS에서 그들을 새로운 1.5 ML의 튜브에 회전 타원체 펠렛을 전송하고 씻어 피펫을 사용합니다.
2. 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 페놀 - 클로로포름 추출 방법 ^(9)를 사용하여 펠렛에서 총 RNA를 추출합니다.
3. 제조사의 프로토콜에 따라 역전사 효소를 이용하여 총 RNA로부터 2 μg의 cDNA의 합성 (1 시간 동안 42 ° C에서 부화 한 다음 5 분 동안 70 ℃에서 효소를 실활).
4. 연골 분화 마커 ^(10)에 대한 특정 프라이머로 PCR을 수행합니다.

3. 염색은 연골 분화 마커 단백질의 과발현을 감지하는

1. 파라핀 포함 세포 펠렛
   1. 21 일에,회전 타원체 펠렛을 수확하고 1X PBS로 씻어 피펫을 사용합니다.
   2. 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 침수에 의한 회전 타원체의 알약을 수정합니다.
      주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이다. 눈, 피부 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 노출을 최소화하고 준비하는 동안 흡입을 피하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   3. 정착액을 취소하고 탈 이온수 (DW)와 세포 펠렛을 씻어.
   4. 카세트에 거즈의 한 층을 삽입하고 피펫을 사용하여 고정 된 펠렛을 전송합니다. 거즈를 접어 펠렛을 덮고 카세트 뚜껑을 닫습니다.
   5. 펠렛을 탈수.
      1. RT에서 5 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)의 펠릿을 담근다.
      2. RT에서 5 분 동안 80 % EtOH로의 알약을 담가.
      3. RT에서 5 분 동안 95 % EtOH로의 알약을 담가.
      4. RT에서 5 분 동안 100 %의 EtOH의 알약을 담가. 두 번 반복합니다.
      5. 실온에서 15 분 동안 100 % 크실렌의 알약을 담가. 반복 트위어가전.
   6. 금형에 56 ° C에서 파라핀에 고정 된 세포 펠렛을 포함; 펠릿 전문 자동화 조직 처리 시스템을 사용하여 파라핀에 매립 될 수있다.
   7. 회전 마이크로톰을 이용하여 파라핀 세포 펠릿으로부터 두께 5㎛의 부분을 잘라.
   8. 50 %의 EtOH의 섹션 플로트 다음 슬라이드를 사용하여 50 ℃의 수조로 옮긴다.
   9. 슬라이드에 떠있는 섹션을 배치합니다.
2. Safranin O 및 알 시안 블루 염색
   1. 파라핀 섹션 재수.
      1. 15 분 동안 크실렌의 슬라이드를 담가. 두 번 반복합니다.
      2. 5 분 동안 100 % EtOH 중 슬라이드를 담근다. 두 번 반복합니다.
      3. 5 분 동안 90 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다.
      4. 5 분 동안 80 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다.
      5. 5 분 동안 70 % EtOH로의 슬라이드를 담가하고 1X PBS에서 그들을 씻는다.
   2. 1 % Safranin O 솔루션 3 % 알 시안 블루 용으로 재수 섹션을 얼룩30 분.
   3. 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어.
   4. 1 분 동안 헤 마톡 실린 / 에오신 용액 (Counterstain과)와 섹션을 얼룩.
   5. 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어.
   6. 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 장착 매체를 포함하는 커버 슬립에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다.
   7. 슬라이드는 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
   8. 밝은 필드 현미경 (자동화 직립 현미경, 50X 및 200X)를 사용하여 이미지를 캡쳐.
3. 면역 형광 분석
   1. 섹션 3.2.1에 설명 된대로 섹션을 재수.
   2. 시트르산 나트륨 완충액에서 슬라이드 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)에 담가하고, 마이크로파를 이용하여 10 분 동안 서브 끓는 온도들을 유지한다.
   3. 실온에서 20 분 동안 슬라이드를 냉각 한 후 수돗물로 씻어.
   4. 3 %에서 슬라이드를 부화H ₂ O 다음 15 분 동안 (1X PBS)에 _2, 15 분 ¹¹ 수돗물로 씻는다.
   5. 1 시간 동안 완충액 (PBS 중 10 % 정상 염소 혈청)을 차단와 슬라이드 블록.
   6. 블로킹 용액을 흡인하고 슬라이드 상 5 % 정상 염소 혈청으로 희석 차 항체를 적용한다.
   7. 4 ℃에서 밤새 슬라이드를 품어.
   8. 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
   9. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 5 % 정상 염소 혈청으로 희석하고, 형광 접합 된 이차 항체의 슬라이드를 부화.
   10. 어둠 속에서 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
   11. 10 분 동안 DAPI (1 μg의 / mL)으로 슬라이드를 품어하고 5 분마다 1X PBS에서 그들에게 두 번 씻는다.
   12. 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 설치 매체에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다.
   13. 슬라이드 2-3에 대한 건조하도록 허용실온에서 어둠 속에서 시간.
   14. 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 시각화 (594 nm의 DAPI : 루비로드 340 nm의, 60X 및 200X 배율) ^12.

결과

원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 연골 세포 분화 마커의 과다 발현을 유도한다.

연골 분화를 유도하기에 적합한 원심 중력의 정도를 결정하기 위해,의 ASC는 15 분 동안 다른 CG의도 (0, 300, 600, 1,200, 2,400 XG)로 자극 하였다. 자극 후, ASC를 배양 플레이트에 다시 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바?...

토론

세포의 stemness 상태는 SOX9의 CG에 의한 과잉 발현에 매우 중요합니다. 우리의 연구에서, SOX9 표현은 아니지만 나중에-통로의 ASC에서, 초기 통로의 ASC (2-3)에서 CG에 의해 유도 될 수있다. 배양 동안의 ASC 3 통로 ^(16)까지 CD34 + 세포를 포함하는 것으로보고되었다. 의 ASC는 세포가 CG로 낮은 반응의 결과로 계대 CD34의 발현을 상실하는 경향이있다.

원심 중력으로, 수...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells