Chondrogène Différenciation Induction des cellules souches adipeuses par gravité centrifuge

Résumé

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Résumé

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

Des défauts dans le cartilage articulaire ne guérissent pas naturellement. Par conséquent, transplantation de cellules souches a été proposée comme une approche prometteuse pour la réparation d'altération du cartilage. Cependant, cette méthode nécessite à la fois l'acquisition d'un nombre suffisant de cellules souches et l'induction de ces cellules à subir une différenciation chondrogénique. La moelle osseuse (BM) a été largement utilisé en tant que source de cellules souches, mais l'isolement des cellules de BM présente deux inconvénients majeurs: le rendement de propagation et insuffisante. En raison de sa facilité d'acquisition, le tissu adipeux est une source de cellules souches préférables. Des études antérieures ont démontré la faisabilité d'isoler des cellules souches du tissu adipeux et d' induire la différenciation chondrocytaire dans ces cellules en utilisant des cytokines, telles que le TGF-β1 ^{1, 2.} Ces méthodes sont efficaces mais coûteux.

Comme une alternative moins coûteuse aux cytokines, une contrainte mécanique peut être utilisé pourinduire la différenciation chondrogénique. Chargement mécanique joue un rôle essentiel dans le maintien de la santé du cartilage articulaire ^3, et elle peut induire des phénotypes chondrogéniques dans différentes cellules. Par exemple, la pression hydrostatique induit des phénotypes chondrogéniques dans les cellules progénitrices dérivées de la synoviale par la voie de la MAP kinase / JNK ^4, et une compression mécanique induit une chondrogenèse dans des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSM) , par la régulation positive des gènes ⁵ chondrocytes. En outre, la contrainte de cisaillement contribue à l'expression liée chondrogenèse matrice extracellulaire (ECM) dans les cellules souches mésenchymateuses humaines ^6. Gravité centrifuge (CG), une contrainte mécanique facilement appliquée et contrôlée générée par centrifugation, peut induire l' expression différentielle des gènes dans les cellules ^7. Par exemple, dans des cellules de carcinome de l' épithélium du poumon, l'expression de l' interleukine (IL) -1 ter est régulée positivement par centrifugation ^8. Tinsi, en tant que contrainte mécanique expérimentalement inductible, CG peut être utilisé pour induire l'expression du gène chondrocytaire dans les cellules souches. Cependant, il reste difficile de savoir si CG peut induire la différenciation chondrogénique des cellules souches.

Dans cette étude, nous avons constaté que CG a induit la surexpression de SOX9, un régulateur de maître de chondrogenèse en ASCs humains, ce qui entraîne la surexpression des gènes chondrocytes. De plus, nous avons comparé les effets de la CG sur la chondrogenèse avec celles du TGF-β1, le facteur de croissance les plus couramment utilisés pour induire une chondrogenèse in vitro dans des cellules souches.

Protocole

Ce protocole d'étude a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC16EAME0162) et réalisée selon les directives du NIH. Tous les tissus ont été obtenus avec le consentement éclairé par écrit.

Chargement 1. centrifuge Gravité et Pellet Culture

1. La culture cellulaire et la récolte
   1. ASCs de culture (P2-P3; voir la liste des matériaux) dans Modifié Moyennement bas de glucose de Eagle Dulbecco (DMEM-LG) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
   2. Lorsque les cellules atteignent 80% de confluence, éliminer le milieu et laver les cellules avec 5 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   3. Ajouter 1 ml de PBS contenant de l' EDTA 1 mM et on incube pendant 2 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
   4. Appuyez sur la plaque de culture doucement, ajouter 4 ml de milieu frais, transférer les cellules àun tube conique de 15 ml et centrifuger les cellules à 250 xg pendant 2 minutes à la température ambiante (TA).
2. Centrifuge chargement gravitaire
   1. Après centrifugation (étape 1.1.4), retirer le surnageant sans perturber le culot et resuspendre le culot dans 10 ml de DMEM-LG avec 10% de FBS. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre.
   2. CG pour le chargement, transférer 2,5 x 10 ⁵ cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml et on centrifuge à 2400 x g pendant 15 min.
3. culture Pellet
   1. Immédiatement après la centrifugation, Aspirer le surnageant et ajouter 500 ul de milieu de différenciation chondrogénique définie (MDP-DMEM riche en glucose supplémenté avec 1% de FBS, 1% de ITS + Prémix, 100 nM de dexaméthasone, d'une solution d'acides aminés 1 x MEM non essentiels, 50 pg / ml de L-proline, et 1% de pénicilline / streptomycine). Ajouter 50 pg / ml fraîchement préparée de l'acide L-ascorbique 2-phosphate, à chaque changement de milieu. En tant que contrôle positif, induisent differentiati chondrogéniquesdans les cellules non centrifugé en ajoutant MCD contenant 10 ng / ml de TGF-β1.
   2. Placer les tubes coiffés de manière lâche contenant les pastilles dans une position debout et incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
   3. Changer le milieu tous les jours pendant 3 semaines.
4. culture Micromass
   1. Immédiatement après centrifugation (étape 1.2.2; 2400 × g pendant 15 min), aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 pi de MDP.
   2. Pour former un Micromass, placer les cellules remises en suspension au centre d'un puits d'une plaque à 24 puits.
   3. Après 2 h, ajouter avec précaution 1 ml de MDP au bien, pipetage contre le mur de la plaque pour éviter de perturber l'micromasse. En tant que contrôle positif, effectuer une culture de micromasse avec des cellules non centrifugés en ajoutant CDM contenant 10 ng / ml de TGF-β1.
   4. Incuber la micromasse à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
   5. Changez le ev moyenEry autre jour pendant 3 semaines.

2. transcriptase inverse-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) pour détecter transcriptionnelle de régulation positive Chondrogène Différenciation Marqueurs

1. Au jour 14, utiliser une pipette pour transférer les pastilles de sphéroïdes dans un nouveau tube de 1,5 ml et les laver dans PBS 1x.
2. Extraire l'ARN total à partir des pastilles en utilisant le thiocyanate-phénol-chloroforme méthode ⁹ d'extraction de guanidinium.
3. Synthétiser un ADNc à partir de 2 pg d'ARN total en utilisant une transcriptase inverse selon le protocole du fabricant (incuber à 42 ° C pendant 1 h et ensuite inactiver l'enzyme à 70 ° C pendant 5 min).
4. Effectuer une PCR avec des amorces spécifiques pour les marqueurs de ¹⁰ différenciation chondrocytaire.

3. Coloration pour détecter la surexpression de chondrogéniques Différenciation Marqueur Protéines

1. culots cellulaires Paraffin-enrobage
   1. Au jour 21,utiliser une pipette pour récolter les granulés sphéroïdes et les laver avec PBS 1x.
   2. Fixer les granules sphéroïdaux par immersion dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 h.
      Attention: paraformaldéhyde est hautement toxique. Éviter tout contact avec les yeux, la peau ou les muqueuses. Minimiser l'exposition et éviter l'inhalation lors de la préparation. Porter un équipement de protection individuelle approprié.
   3. Jeter le fixateur et rincer les pastilles de cellules avec de l'eau déminéralisée (DW).
   4. Placer une couche de gaze sur la cassette et transférer les pastilles fixes à l'aide d'une pipette. Couvrir le culot par pliage de la gaze et fermer le couvercle de la cassette.
   5. Déshydrater les pellets.
      1. Immerger les pastilles dans 70% d'éthanol (EtOH) pendant 5 min à température ambiante.
      2. Immerger les pastilles dans 80% de EtOH pendant 5 min à température ambiante.
      3. Immerger les pastilles dans EtOH à 95% pendant 5 min à température ambiante.
      4. Immerger les pastilles dans EtOH à 100% pendant 5 min à température ambiante. Répéter deux fois.
      5. Immerger les pastilles dans 100% de xylène pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez twice.
   6. Incorporer les culots de cellules fixes dans la paraffine à 56 ° C dans un moule; les pastilles peuvent être incorporées dans de la paraffine en utilisant des systèmes de traitement de tissu automatisé spécialisés.
   7. Couper les sections 5 um d'épaisseur à partir du culot cellulaire inclus dans la paraffine en utilisant un microtome rotatif.
   8. Float les sections dans 50% EtOH puis les transférer à un bain à 50 ° de l'eau en utilisant une diapositive.
   9. Placez les sections flottantes sur des lames.
2. Safranine O et coloration au bleu Alcian
   1. Réhydrater les sections de paraffine.
      1. Immerger les lames dans du xylène pendant 15 min. Répéter deux fois.
      2. Immerger les lames dans EtOH à 100% pendant 5 min. Répéter deux fois.
      3. Immerger les lames dans 90% de EtOH pendant 5 min.
      4. Immerger les lames dans 80% EtOH pendant 5 min.
      5. Immerger les lames dans 70% EtOH pendant 5 min, puis lavez-les dans PBS 1x.
   2. Colorer les sections réhydratés avec 1% solution safranine O et 3% de bleu Alcian pour30 minutes.
   3. Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW.
   4. Colorer les sections avec une solution hématoxyline / éosine (colorante de) pendant 1 min.
   5. Jeter la solution de coloration et rincer les sections avec DW.
   6. Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l'eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur la lamelle contenant le milieu de montage.
   7. Laisser les lames sécher pendant 2-3 h à température ambiante.
   8. Capture d'images en utilisant un microscope à champ lumineux (microscope droit automatisé, 50X et 200X).
3. immunofluorescence
   1. Réhydrater les sections comme décrit dans la section 3.2.1.
   2. Immerger les lames dans du tampon citrate de sodium (citrate de sodium 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0), puis de les maintenir à une température sub-bouillante pendant 10 minutes en utilisant un four micro-ondes.
   3. Refroidir les lames pendant 20 min à température ambiante, puis les laver avec de l'eau du robinet.
   4. Incuber les lames dans 3%H ₂ O ₂ (1x PBS) pendant 15 min, puis les laver avec de l' eau du robinet pendant 15 min ^11.
   5. Bloquer les lames avec un tampon de blocage (10% de sérum de chèvre normal dans du PBS) pendant 1 h.
   6. Aspirer la solution de blocage, et ensuite appliquer un anticorps primaire dilué avec 5% de sérum de chèvre normal sur les lames.
   7. Incuber les lames pendant une nuit à 4 ° C.
   8. Laver les lames trois fois en 1x PBS pendant 5 min chacun.
   9. Incuber les lames dans un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome dilué avec 5% de sérum de chèvre normal pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
   10. Laver les lames trois fois dans du 1 x PBS pendant 5 min à chaque fois dans l'obscurité.
   11. Incuber les lames avec DAPI (1 pg / ml) pendant 10 min, puis lavez-les deux fois en 1x PBS pendant 5 minutes chacun.
   12. Placer une goutte de milieu de montage sur une lamelle couvre-objet après avoir retiré l'eau résiduelle. Placez délicatement la lame (cellule vers le bas) sur le support de montage.
   13. Laisser les lames sécher pendant 2-3h dans l'obscurité à la température ambiante.
   14. Visualisez les diapositives en utilisant la microscopie à fluorescence (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X et 200X) ^12.

Résultats

gravité centrifuge induit une surexpression de marqueurs de différenciation chondrocytaire dans les cellules souches dérivées de tissu adipeux.

Pour déterminer le degré de la force de gravité centrifuge qui est apte à induire la différenciation chondrogénique, ASCs ont été stimulées avec divers degrés de CG (0, 300, 600, 1200 et 2400 x g) pendant 15 min. Après stimulation, les ASCs ont été re-ensemencées sur ...

Discussion

L'état des cellules de stemness est très important pour la surexpression CG-induite de SOX9. Dans notre étude, l'expression de SOX9 pourrait être induite par CG en ASCs début de passage (2-3), mais pas dans ASCs plus tard, passage. Il a été rapporté que, pendant la culture, ASCs contiennent des cellules CD34 + jusqu'à 3 passages ^16. ASCs ont tendance à perdre l'expression de CD34 que les cellules sont repiquées, ce qui entraîne une faible réponse au CG.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells