Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Özet

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Özet

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Giriş

eklem kıkırdağında Kusur doğal iyileşmek yok. Sonuç olarak, hücre transplantasyonu bozulmuş kıkırdak tamiri için umut verici bir yaklaşım olarak önerilmiştir kaynaklanıyor. Bununla birlikte, bu yöntem, bir kök hücre, yeterli sayıda elde edilmesi ve kondrojenik farklılaşma geçmesi bu hücrelerin uyarılmasını gerektirir. Kemik iliği (BM), yaygın olarak, kök hücre kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak BM hücre izolasyonu, iki önemli dezavantajı vardır: invaziv ve yetersiz verim. Çünkü satın kolaylığı nedeniyle, yağ dokusu, kök hücrelerin tercih edilen kaynağıdır. Daha önceki çalışmalar, adipoz dokusundan kök hücrelerin izole edilmesi ve TGF-ß1 ^{1, 2} gibi sitokinler kullanılarak bu hücrelerde kondrojenik farklılaşmasını uyaran uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Bu yöntemler etkili ama pahalı.

sitokinler için daha düşük bir ekonomik alternatif olarak, mekanik strese kullanılabilirkondrojenik farklılaşmasını indükler. Mekanik yükleme eklem kıkırdağı ³ sağlığını korumada önemli bir rol oynar, ve çeşitli hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olabilir. Örneğin, hidrostatik basınç MAP kinaz / JNK yolunun ⁴ üzerinden sinovya kaynaklı progenitör hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olur ve mekanik sıkıştırma kondrositik genleri ⁵ regülasyonunda insan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) 'de kondrojenezi neden olur. Buna ek olarak, kayma gerilmesi insan MSC ⁶ kondrogenezis ilgili ekstrasellüler matriks (ECM) ifadesi katkıda bulunur. Santrifüj ağırlığı (CG), santrifüj ile üretilen bir kolaylıkla uygulanabilen ve kontrollü mekanik stres, hücre ⁷ farklı gen ifadesini endükleyebilen. Örneğin, akciğer epitelyal karsinom hücrelerinde, interlökin (IL) -1b sentezlenmesi santrifüj ⁸ ile üst-düzenlenmektedir. Therefore, deneysel olarak uyanlabilir mekanik stres, CG kök hücrelerdeki kondrositik, gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılabilir. Ancak, CG kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını teşvik edip belirsizliğini koruyor.

Bu çalışmada, CG kondrositik genlerin tanımlanması sonuçlanan insan TSK olarak, SOX9 uyarılması, kondrojenez bir ana regülatör neden olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, TGF-ß1 olanlar ile kondrojenez CG etkileri, büyüme faktörü en çok kök hücrelerin in vitro kondrojenezi indüklemek için kullanılan göre.

Protokol

Bu çalışma protokolü NIH kurallarına göre Kore Katolik Üniversitesi (KC16EAME0162) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Bütün dokular yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir.

1. Santrifüj Yerçekimi Yükleme ve Pelet Kültür

1. Hücre kültürü ve hasat
   1. Kültür TSK (P2-P3; Malzemelerin listesine bakınız), 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı düşük glikoz (DMEM-LG) 'de % 5 _CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde.
   2. Hücreler% 80 kaynaşmaya eriştikten sonra, orta atmak ve 1 x fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) hücreleri yıkamak.
   3. PBS içeren 1 mM EDTA 1 ml ilave edilir ve% 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin.
   4. hücreleri transferi, hafifçe kültürü plakası dokunun taze ortam 4 ml15 ml konik tüp, santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca (RT) 250 x g'de hücreleri.
2. Santrifüj yerçekimi yükleme
   1. Santrifüj (aşama 1.1.4) sonra pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve% 10 FBS bulunan DMEM-LG 10 mL pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
   2. CG yükleme için, 15 dakika için 2400 x g 'de, yeni bir 15 mL konik tüp ve santrifüj 2.5 x 10 ⁵ hücre transfer edin.
3. pelet kültürü
   1. Hemen Santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire ve belirlenen kondrojenik farklılaştırma ortamının 500 ul ekle (CDM, yüksek glukozlu DMEM,% 1 FBS,% 1 ITS + karışımlar, 100 nM deksametason, 1x MEM gerekli olmayan amino asit çözeltisi, 50 ug ile takviye / ml L-prolin, ve% 1 penisilin / streptomisin). Her bir değiştirilen ortam içinde taze hazırlanmış L-askorbik asit 2-fosfat 50 ug / ml. Bir pozitif kontrol olarak, kondrojenik differentiati sebepekleyerek santrifujlenmemiş hücrelerde ilgili CDM 10 ng / ml TGF-ß1 ihtiva etmektedir.
   2. Bir ayakta durma konumunda peletleri içeren gevşek kapatılmış tüp yerleştirilir ve% 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edin.
   3. 3 hafta boyunca her gün orta değiştirin.
4. Micromass kültürü
   1. Hemen santrifüj (aşama 1.2.2, 15 dakika boyunca 2400 x g) sonra, süpernatan aspire ve CDM 10 mcL pelletini.
   2. bir mikro oluşturmak üzere bir 24-çukurlu plaka iyi merkezinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin.
   3. 2 saat sonra, dikkatli bir şekilde mikrokütle bozmamak için plakanın duvara de, pipetleme CDM 1 ml. Bir pozitif kontrol olarak, 10 ng / ml TGF-ß1 ihtiva CDM eklenerek santrifujlenmemiş hücreleri ile bir Micromass kültürü yerine getirir.
   4. % 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C 'de mikrokütle inkübe edin.
   5. orta EV değiştirme3 hafta boyunca gün ery.

2. Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) kondrojenik Farklılaşma İşaretlerinin transkripsiyonel upregülasyonun Algılama için

1. 14. günde, 1 x PBS içinde bunları yeni bir 1.5 ml tüp küremsi pelet aktarmak ve yıkama için bir pipet kullanın.
2. Guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi ⁹ kullanarak pelet toplam RNA ekstrakte edin.
3. üreticinin protokolüne uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 2 ug cDNA sentez (1 saat boyunca 42 ° C'de inkübe ve daha sonra 5 dakika süreyle 70 ° C 'de enzimi inaktive).
4. Kondrojenik farklılaşma markörünü ¹⁰ için özel primerler ile PCR gerçekleştirin.

3. Boyama kondrojenik Farklılaşma Marker proteinlerin aşırı ekspresyonu Algılama için

1. Parafin gömme hücre topakları
   1. 21. günde,sfero pelet hasat ve 1x PBS ile onları yıkamak için bir pipet kullanın.
   2. 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde daldırma ile küremsi pelet sabitleyin.
      Dikkat: Paraformaldehyde son derece toksiktir. Gözlere, cilde veya mukoza ile temasından kaçının. maruziyeti en aza indirmek ve hazırlanması sırasında solunması. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
   3. fiksatif atın ve deiyonize su (DW) ile hücre pelletleri durulayın.
   4. kasete gazlı bir katmanı yerleştirin ve bir pipet kullanarak sabit pelet aktarın. gazlı katlanarak pelet Kapak ve kaset kapağını kapatın.
   5. pelet dehydrate.
      1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 70 etanol (EtOH) 'de pelet bırakın.
      2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 80 EtOH içinde peletler bırakın.
      3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 95 EtOH içinde peletler bırakın.
      4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 100 EtOH içinde peletler bırakın. İki kez tekrarlayın.
      5. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 100 ksilen pelet bırakın. Tekrarlama twice.
   6. bir kalıba 56 ° C'de parafin sabit hücre pelletleri yerleştirme; pelet uzmanlaşmış otomatik doku işleme sistemlerini kullanarak parafin içine gömülü olabilir.
   7. bir döner mikrotom kullanılarak parafine gömülü hücre topağından 5 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir.
   8. % 50 EtOH bölümleri yüzer ve sonra bir slayt kullanarak bir 50 ° C su banyosunda aktarabilirsiniz.
   9. Slaytlarınıza yüzen bölümleri yerleştirin.
2. Safranin O ve Alcian blue boyama
   1. Parafin bölümleri rehidrate.
      1. 15 dakika ksilen slaytlar daldırın. İki kez tekrarlayın.
      2. 5 dakika boyunca% 100 EtOH içinde slaytlar bırakın. İki kez tekrarlayın.
      3. 5 dakika boyunca% 90 EtOH slaytlar daldırın.
      4. 5 dakika boyunca% 80 EtOH slaytlar daldırın.
      5. 5 dakika boyunca% 70 EtOH slaytlar bırakın ve daha sonra 1 x PBS içinde yıkayın.
   2. % 1 Safranin O solüsyonu ve% 3 Alcian mavi için birlikte rehidrate bölümleri Leke30 dk.
   3. boyama çözüm atın ve DW ile bölümleri durulayın.
   4. 1 dakika boyunca Hematoksilen / Eosin çözeltisi (counterstain) ile bölümleri Leke.
   5. boyama çözüm atın ve DW ile bölümleri durulayın.
   6. herhangi bir artık suyun çıkarılmasından sonra bir lamel üzerine monte ortamının bir drop yerleştirin. Dikkatle montaj orta içeren lamel slayt (aşağı hücre tarafı) yerleştirin.
   7. slaytlar oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle kurumaya bırakın.
   8. Parlak alan mikroskobu (otomatik dik bir mikroskop, 50X ve 200X) kullanarak görüntüleri yakalayabilir.
3. immünofloresan tahlil
   1. Bölüm 3.2.1'de tarif edildiği gibi bölümleri rehidrate.
   2. sodyum sitrat tampon maddesi içinde slaytlar (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween 20, pH 6.0) daldırın ve bir mikrodalga kullanılarak 10 dakika için bir alt-kaynama sıcaklığında onları korumak.
   3. Oda sıcaklığında 20 dakika için slaytlar soğutun ve daha sonra, musluk suyu ile yıkanır.
   4. % 3 slaytlar inkübeH _2, daha sonra O 15 dakika boyunca (1 x PBS içinde) ₂ ve 15 dakika ¹¹ musluk suyu ile yıkayın.
   5. 1 saat boyunca tampon (PBS içinde% 10 normal keçi serumu) ile slaytlar bloke.
   6. engelleme çözeltisi aspire ve slaytlar üzerine% 5 normal keçi serumu ile seyreltilmiş birincil antikor uygulayın.
   7. 4 ° C'de bir gece slaytlar inkübe edin.
   8. 5 dakika her biri için 1x PBS slaytlar üç kez yıkayın.
   9. karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 normal keçi serumu ile seyreltildi florokrom-konjuge sekonder antikor slaytlar inkübe edin.
   10. karanlıkta 5 dakika her biri için 1x PBS slaytlar üç kez yıkayın.
   11. 10 dakika için DAPI (1 ug / mL) ile slaytlar inkübe, ve daha sonra 5 dakika her biri için 1 x PBS içinde onları iki kez yıkayın.
   12. herhangi bir artık suyun çıkarılmasından sonra bir lamel üzerine monte ortamının bir drop yerleştirin. Dikkatle montaj ortamda slayt (aşağı hücre tarafı) yerleştirin.
   13. slaytlar 2-3 kurumasını bekleyinOda sıcaklığında, karanlıkta, H.
   14. Floresan mikroskobu kullanarak slaytlar gözünüzde canlandırın (: 594 nm, DAPI: Rhod 340 nm; 60X ve 200X büyütme) ^12.

Sonuçlar

Santrifüj gravite adipoz elde edilen kök hücreleri kondrojenik farklılaşma markerlerinin aşırı ekspresyonunu indükler.

kondrojenik değişimi etkilemek için uygun olan, santrifüj yerçekimi kuvveti derecesini belirlemek için, TSK 15 dakika için farklı CG derece (0, 300, 600, 1200 ve 2400 x g) ile uyarıldı. stimülasyon sonrasında TSK kültür plakaları üzerine yeniden ekildi ve 24 saat süre ile kültüre ed...

Tartışmalar

hücrelerin stemness durumu SOX9 CG indüklenen aşırı ekspresyonu için çok önemlidir. Bizim çalışmamızda, SOX9 sentezleme ancak sonraki geçiti TSK, erken geçit TSK (2-3) 'de CG neden olabilir. Yetiştirilmesi sırasında, TSK 3 pasajlar ¹⁶ kadar, CD34 + hücreleri içermektedir, bildirilmiştir. TSK hücreleri CG düşük bir yanıt elde geçişli olarak CD34 ifadesini kaybetmek eğilimindedir.

merkezkaç yerçekimi kuvveti ile, hidrostatik basınç CG...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells