Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Summary

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

פגמי סחוס במפרק לא לרפא באופן טבעי. כתוצאה מכך, השתלת תא גזע הוצעה גישה מבטיחה לתיקון סחוס לקוי. עם זאת, שיטה זו דורשת היא רכישת מספר מספיק של תאי גזע ואת האינדוקציה של תאים אלה כדי לעבור התמיינות chondrogenic. מח עצם (בע"מ) כבר בשימוש נרחב כמקור לתאי גזע, אבל בידוד תא מ- BM יש שני חסרונות עיקריים: הפולשנות ואת התשואה מספיק. בגלל הקלות של רכישתה, רקמת שומן היא מקור עדיף של תאי גזע. מחקרים קודמים הדגימו את ההיתכנות של בידוד תאי גזע מרקמות שומן התרמת בידול chondrogenic בתאים אלה באמצעות ציטוקינים, כגון TGF-β1 ^{1, 2.} שיטות אלו יעילות אבל יקרות.

כחלופה עלות נמוכה יותר כדי ציטוקינים, לחץ מכני יכול לשמשלהשרות התמיינות chondrogenic. העמסה מכאנית משחקת תפקיד קריטי בשמירה על הבריאות של סחוס במפרק ^3, וזה יכול לגרום פנוטיפים chondrogenic בתאים שונים. לדוגמא, לחץ ההידרוסטטי גורם פנוטיפים chondrogenic ב ובתאים נגזרים synovium דרך מסלול קינאז / JNK MAP ^4, ודחיסה מכאנית גורם chondrogenesis בתאי גזע mesenchymal אדם (MSCs) על ידי upregulating גני chondrocytic ^5. בנוסף, מאמץ הגזירה תורם הביטוי של מטריקס הקשורות chondrogenesis (ECM) ב MSCs אדם ^6. הכביד צנטריפוגלי (CG), מתח מכאני שיושם לשלוט בקלות שנוצר על ידי צנטריפוגה, יכול לגרום ביטוי גני הפרש בתאי ^7. לדוגמה, בתאי קרצינומה אפיתל ריאות, הביטוי של אינטרלוקין (IL) -1b הוא upregulated ידי צנטריפוגה ^8. Therefore, כמו לחץ מכאני מושרה באופן ניסיוני, CG יכול לשמש כדי לגרום ביטוי גני chondrocytic בתאי גזע. עם זאת, עדיין לא ברור האם CG יכול לגרום בידול chondrogenic של תאי גזע.

במחקר זה, מצאנו כי CG המושרה הגברת הביטוי של SOX9, רגולטור אדון chondrogenesis, ב ASCs האדם, וכתוצאה מכך ביטוי יתר של גנים chondrocytic. בנוסף, השווינו את ההשפעות של CG על chondrogenesis לאלה של β1 TGF, גורם הגדילה הנפוץ ביותר כדי לגרום במבחנה chondrogenesis בתאי גזע.

Protocol

פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC16EAME0162) ובצע בהתאם להנחיות NIH. כל הרקמות התקבלו עם הסכמה מדעת בכתב.

1. טוען Gravity צנטריפוגלי ו גלולה תרבות

1. תרבות קציר ניידים
   1. ASCs תרבות (P2-P3; לראות רשימה של חומרים) ברמת הגלוקוז הבינוני-הנמוך של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM-LG) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO _2.
   2. כאשר התאים מגיעים 80 מפגש%, לבטל את בינוני לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט 1x (PBS).
   3. הוסף 1 מ"ל של המכיל 1 PBS mM EDTA דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO _2.
   4. הקש על צלחת תרבות בעדינות, להוסיף 4 מ"ל של מדיום חדש, ולהעביר את התאיםצינור חרוטי 15 מ"ל, ו צנטריפוגות התאים ב g 250 × 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
2. טעינה הכביד צנטריפוגלי
   1. לאחר צנטריפוגה (שלב 1.1.4), להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל של DMEM-LG עם 10% FBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
   2. לטעינת CG, להעביר 2.5 × 10 ⁵ תאים לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים חדשים g 2,400 × במשך 15 דקות.
3. תרבות הגלולה
   1. מיד לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול chondrogenic מוגדר (CDM, גבוהה גלוקוז DMEM בתוספת 1% FBS, 1% Premix + ITS, 100 dexamethasone ננומטר, 1x MEM שאינם חיוניים פתרון חומצה אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​L-פרולין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין). הוסף 50 מיקרוגרם / מיליליטר של פוספט 2 המוכן טרי L-החומצה אסקורבית בכל החלפה בינונית. כביקורת חיובית, לגרום differentiati chondrogenicעל בתאים uncentrifuged ידי הוספת CDM המכיל 10 ng / mL TGF-β1.
   2. מניח את צינורות כתרים רופפים המכילים את הכדורים בעמידה לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified המכילה 5% CO _2.
   3. שינוי המדיום פעם ביומיים למשך 3 שבועות.
4. תרבות Micromass
   1. מיד לאחר צנטריפוגה (שלב 1.2.2; 2,400 גרם × במשך 15 דקות), לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 μL של CDM.
   2. כדי ליצור micromass, למקם את התאים resuspended במרכז באר צלחת 24 באר.
   3. לאחר 2 שעות, בזהירות להוסיף 1 מ"ל של CDM אל הבאר, pipetting אל הקיר של הצלחת כדי למנוע שיבוש micromass. כביקורת חיובית, לבצע תרבות micromass עם תאים uncentrifuged ידי הוספת CDM המכיל 10 ng / mL TGF-β1.
   4. דגירה micromass על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל ₂ 5% CO.
   5. שנה את ev הבינוניery ימים למשך 3 שבועות.

2. תגובת שרשרת הפוך transcriptase-פולימראז (RT-PCR) כדי לאתר upregulation תעתיק של סמנים בידול Chondrogenic

1. ביום 14, השתמש פיפטה להעביר את כדורי אליפטית לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשטוף אותם 1x PBS.
2. חלץ את RNA הכולל את הכדורים בשיטת חילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium ^9.
3. לסנתז cDNA מ 2 מיקרוגרם של רנ"א סך באמצעות transcriptase הפוכה על פי הפרוטוקול של היצרן (לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן לנטרל את האנזים ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות).
4. בצע PCR עם פריימרים ספציפיים עבור סמני בידול chondrogenic ^10.

3. מכתים לזהות את התבטאות יתר של חלבונים מרקר בידול Chondrogenic

1. פרפין הטבעת כדורי תא
   1. ביום 21,להשתמש פיפטה לקצור את כדורי אליפטית ולשטוף אותם עם PBS 1x.
   2. תקן את כדורי אליפטית על ידי טבילה paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות.
      זהירות: Paraformaldehyde היא רעילה ביותר. יש להימנע ממגע עם עיניים, עור, או ריריות. מזעור החשיפה ולהימנע משאיפת במהלך ההכנה. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
   3. מחק את מקבע ולשטוף את כדורי תא עם מים ללא יונים (DW).
   4. מניח שכבה אחת של גזה על הקלטת ולהעביר את הכדורים הקבועים בעזרת פיפטה. מכסה את הכדור על ידי קיפול הגזה ולסגור את מכסת הקלטת.
   5. מייבש את הכדורים.
      1. לטבול את הכדורים ב 70% אתנול (EtOH) במשך 5 דקות ב RT.
      2. לטבול את הכדורים ב 80% EtOH במשך 5 דקות ב RT.
      3. לטבול את הכדורים ב 95% EtOH במשך 5 דקות ב RT.
      4. לטבול את הכדורים ב 100% EtOH במשך 5 דקות ב RT. חזור פעמיים.
      5. לטבול את כדורי קסילן 100% במשך 15 דקות ב RT. טווי חזורלִספִירַת הַנוֹצרִים.
   6. הטמע את כדורי תא הקבועים פרפין ב 56 מעלות צלזיוס בתוך תבנית; ניתן להטביע את הכדורים לתוך פרפין באמצעות מערכות עיבוד רקמות מיוחדות אוטומטיות.
   7. חותכים 5 חלקים מיקרומטר בעובי מן התא גלולה מוטבע פרפין באמצעות microtome סיבובית.
   8. Float את הסעיפים 50% EtOH ולאחר מכן להעביר אותם באמבט מים 50 ° C באמצעות שקופיות.
   9. מניחים את הסעיפים צף על גבי שקופיות.
2. Safranin O ו כתמים כחולים Alcian
   1. רעננותם חלקי פרפין.
      1. לטבול את השקופיות קסילן במשך 15 דקות. חזור פעמיים.
      2. לטבול את השקופיות EtOH 100% במשך 5 דקות. חזור פעמיים.
      3. לטבול את השקופיות 90% EtOH למשך 5 דקות.
      4. לטבול את השקופיות EtOH 80% במשך 5 דקות.
      5. לטבול את השקופיות EtOH 70% במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם 1x PBS.
   2. כתם בסעיפי rehydrated עם 1% Safranin O פתרון ו -3% הכחולים Alcian עבור30 דק.
   3. מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את החלקים עם DW.
   4. הכתם בסעיפים עם פתרון Hematoxylin / Eosin (counterstain) 1 דקות.
   5. מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את החלקים עם DW.
   6. מניחים ירידה של המדיום גובר על coverslip לאחר הסרת כל שאריות מים. בזהירות במקום להחליק (תא בצד למטה) על coverslip המכיל את המדיום גובר.
   7. אפשר השקופיות להתייבש במשך 2-3 שעות ב RT.
   8. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מיקרוסקופ זקוף אוטומטי, 50X ו 200X).
3. assay immunofluorescence
   1. רעננותם סעיפים כמפורט בסעיף 3.2.1.
   2. לטבול את שקופיות חיץ נתרן ציטרט (נתרן ציטרט 10 מ"מימ, 0.05% Tween 20, pH 6.0), ולאחר מכן לשמור אותם בטמפרטורה רותחת משנה עבור 10 דקות באמצעות מיקרוגל.
   3. מצננים את השקופיות עבור 20 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף אותם עם מי ברז.
   4. דגירת השקופיות ב 3%H ₂ O ₂ (ב 1x PBS) במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מי ברז במשך 15 דקות ^11.
   5. חסום את השקופיות עם חסימת חיץ (10% נסיוב עז נורמלי ב PBS) במשך שעה 1.
   6. לשאוב את הפתרון החוסם, ולאחר מכן להחיל נוגדן ראשוני מדולל 5% נסיוב עז נורמלי על השקופיות.
   7. דגירת שקופיות הלילה ב 4 ° C..
   8. שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   9. דגירה השקופיות ב נוגדנים משני מצומדות fluorochrome מדולל 5% נסיוב עז נורמלי במשך שעה 1 ב RT בחושך.
   10. שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בחושך.
   11. דגירה השקופיות עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים ב 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
   12. מניחים ירידה של המדיום גובר על coverslip לאחר הסרת כל שאריות מים. בזהירות במקום להחליק (תא בצד למטה) על הרכבה בינונית.
   13. אפשר השקופיות להתייבש במשך 2-3h בחושך ב RT.
   14. דמיינו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Rhod: 594 ננומטר, DAPI: 340 ננומטר; 60X והגדלה 200X) ^12.

תוצאות

הכביד צנטריפוגלי ומשרה את ביטוי היתר של סמני בידול chondrogenic בתאי גזע שמקורם שומן.

כדי לקבוע את מידת כוח הכבידה צנטריפוגלי שרלוונטי להשרות התמיינות chondrogenic, ASCs היו מגורה עם דרגות שונות של CG (0, 300, 600,...

Discussion

מדינת stemness של תאים חשובה מאוד עבור ביטוי יתר נגרמת CG של SOX9. במחקר שלנו, ביטוי SOX9 יכול להיגרם על ידי CG ב ASCs מוקדם-חלוף (2-3), אך לא ASCs-מעבר מאוחר יותר. זה כבר דווח כי, במהלך טיפוח, ASCs מכיל CD34 + תאים עד 3 קטעים ^16. ASCs נוטה לאבד את הביטוי של CD34 כמו התאים passaged, וכתוצאה מכ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells