在成熟的肌纤维诱导分化实时成像

摘要

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

摘要

骨骼肌是由肌纤维，在哺乳动物体内最大的细胞和少数的合胞体中的一个。如何，组成它的复杂性和进化上保守的结构组装仍在调查之中。它们的大小和生理特征往往限制操纵和成像应用。永生化细胞系的培养被广泛使用，但它只能复制分化的早期步骤。

在这里，我们描述了一个协议，使从鼠标主成肌细胞起源的肌纤维容易遗传操作。分化的一周后，将肌纤维显示收缩性，对齐肌节和三单元组，以及外围核。整个分化过程可以跟随实时成像或免疫荧光。该系统结合了现有离体和体外协议的优点。容易和有效转染的可能性，以及四通八达的交通网络的所有分化阶段扩大了潜在的应用。肌纤维随后可不仅用来解决相关发育和细胞生物学的问题，但也再现肌肉疾病表型为临床应用。

引言

骨骼肌组成到体重¹的40％。肌肉相关疾病代表一个巨大的健康和经济负担^2。如何形成这种高度复杂的和有组织的组织，维持和再生的构成广泛和很好建立的研究领域。取决于具体的科学兴趣，最适合的方式的范围可以从简单的肌管培养物，以复杂的体内模型^{3 - 6。}

该协议的目的是提供一种体外系统，该系统允许通过实时成像和免疫监视肌形成的。与传统方法相比，该系统提供了一个非常完整的和动态的洞察鼠标生肌过程。细胞可以从成肌细胞阶段横向显示三合会及周边核⁷成熟，多核肌纤维被遵循。这个成熟水平可使用常规细胞培养设备来实现，而不需要复杂的刺激或机械装置。虽然在体外系统一些成功的报道^8,9，据我们所知，这是唯一的协议产生与T管与肌浆网（SR）横向配对鼠标成熟肌纤维。因此，该体外系统可以用来研究三元形成的分子机制，目前仍在知之甚少^10。

使用该系统的进一步的优点是有效的鼠标定位资源，诸如抗体，药物，和RNAi工具的可用性。相对简单的协议不需要费力的步骤，技术娴熟的操作，或昂贵的和专用设备。成熟肌纤维开始5天的文化差异⁷后出现的，显示收缩加之钙火花（未公布数据）。在一个星期内，在不同的发展在哺乳动物体中最复杂的细胞之一的人阶段可以结合研究与各种体外测定法。

研究方案

注意:一个鼠标的产量足够的成肌细胞大约两张35毫米的菜肴或两个活成像菜，所以计划mattings，夹层，和涂层（步骤2.6）相应。 10只动物 - 由于肌细胞是通过连续的离心和预镀隔离，协议应在5个批次进行。

所有涉及动物对象的程序是由动物伦理委员会研究所德MEDICINA分子与大学皮埃尔与玛丽·居里批准

1.新生小鼠后肢肌肉解剖

1. 提前（ 材料表 ）准备所有的解决方案，并通过过滤（0.22微米过滤器）消毒。确保所有媒体都在37℃下除细胞之前，除了含有基底膜基质（ 例如，基质胶）的制剂。
2. 消毒夹层材料（每个之一:剪子弯，直剪刀，镊子定期，和细尖镊子），并通过用70％乙醇擦拭的工作台上。
3. 制备100毫米培养皿用5ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）的肌肉收集和保持在冰上，直到切碎步骤。
4. 斩首P6 - P8小鼠直剪刀和消毒用70％乙醇的皮肤。
5. 使背部皮肤切口，然后轻轻向外拉出后肢，直到它被删除，完全暴露后肢肌肉组织。
6. 使用钳去除脂肪组织而不损伤肌肉。
7. 要卸下背后肢肌肉，保持伸展肢体和弯曲的爪子，露出脚后跟肌腱。骨用剪子弯分离肌肉，从肌腱出发，通过轻轻滑动和切割以上。切除的肌肉，并放置在冰DPBS。
8. 由俭用细尖镊子肌肉和周围切割而不会损坏或股骨的膝关节隔离股四头肌。
9. 解剖所有动物后，继续到无菌层流细胞培养罩，确定应执行以下所有步骤。

2，成肌细胞分离

1. 除去多余的DPBS的。讳言灭菌弯曲剪刀组织，以获得一个均匀的质量。
2. 收集在用5毫升消化混合物的50毫升锥形离心管中的组织糜和在37℃搅拌孵育它为90分钟。
3. 通过在75 XG加入6毫升夹层介质和离心5分钟的悬浮液，以沉淀剩余的组织停止消化。
4. 仔细收集上清。 确保不收集组织碎片 。在350×g离心5分钟离心它;它悬浮在5毫升夹层介质中。
5. 通过40微米的细胞滤网过滤细胞悬浮液。添加25夹层介质中的溶液，并preplate它在150毫米的菜用于在细胞培养孵育箱（4小时37℃，5％CO ₂的_</子>），以允许成纤维细胞附着。
6. 在冷的IMDM 100在RT 1小时:在预镀，外套菜肴基底膜基质的500微升稀释1。用DPBS洗一次，并立即板上的细胞（步骤2.8）或生长培养基，直到电镀离开。
7. 预镀后，收集上清液并在350 xg离心离心它为10分钟。
8. 重悬在它生长介质和细胞计数的血球。调节音量，使细胞150,000 250,000是每个基底膜基质涂，镀菜。保持所述细胞在细胞培养孵化器。

3.肌纤维分化

注:3天后，将细胞应在约70％汇合（ 图1B）开始保险丝和形式肌管。

1. 在这点上，转染的细胞，如果需要的话，用siRNA或感兴趣的DNA。如果细胞不被转染，直接切换到分化培养基和滑雪p依次3.4。
2. 用按照制造商的说明书转染试剂转染。孵育用siRNA脂质复合物5小时的细胞（为20nM + 1微升试剂）或DNA-脂质复合物（1微克试剂+1μL）。如有必要，优化siRNA和DNA的浓度。
3. 与分化培养基清洗过一次，然后切换到新的分化培养基。
4. 在冰冷的分化培养基2:第二天，稀释基底膜基质1。删除现有的媒体，并添加冰冷的基质200微升到每道菜。
5. 孵育在细胞培养孵化30分钟。
6. 补充与集聚蛋白的分化培养基（100毫微克/毫升），并小心加入2毫升到细胞中。
7. 仔细改一半培养基的每2天，总是与集聚蛋白补充至100毫微克/微升的最终浓度。
8. 监测细胞分化和生存力。取决于多种因素（如胎牛血清和chicken胚胎提取物的起源），细胞可能需要5之间- 10分化d可达到完全成熟（ 图2）。

4.免疫染色玻璃底菜

1. 对于免疫染色，在感兴趣的任何时间点，用DPBS洗涤细胞一次，并解决这些问题用4％PFA在RT 10分钟。
2. 用DPBS洗两次。在这一点上，可以将细胞储存于4℃。
3. 用0.5％的Triton X-100通透它们在RT 5分钟。
4. 用PBS洗两次，并用在室温阻断30分钟溶液阻塞。
5. 用在阻断溶液O / N在4℃下稀释的初级抗体孵育它们。
6. 洗3次用DPBS在RT 5分钟。
7. 与二级抗体和DAPI的0.2微克/毫升1小时在室温下孵育它们。
8. 洗3次用DPBS在RT 5分钟。
9. 添加安装介质的200μL并继续成像。

结果

肌纤维发育的程度主要由隔离成肌细胞的纯度和可行性决定。的粘附，增殖和融合的能力可以用来凭经验访问这些参数（ 图1的A，B）。在增殖D2，成肌细胞应该坚持并应该显示典型的梭形。增殖预计在此阶段广泛地发生，导致自发肌管形成翌日（ 图1B）。

细胞汇合可能需要稍作调整。如果成肌细胞需要超过3天的增殖和熔断器它应该增加。如果肌纤维不能生长和细长相对直由于它们的密度应当减少。汇合典型地从中心向盘的外周降低，所以最好肌纤维应朝向外区域被发现。

肌管将快速伸长和显示多个中心对准的细胞核（ 图1C）。由D5，部分细胞开始采集条纹和移动他们的原子核外围。成熟特征的肌纤维的数量将随时间以及与单元厚度（ 图1D）增加。

分化程度可通过免疫荧光来进一步观察。固定在分化D8目前横向黑社会肌纤维。这可以通过T管（DPHR）和SR（triadin），预计在三单元组（ 图2）到共定位的成像元件来确认。

肌纤维的功能性可以通过实时成像来解决。从分化D3起，单元格显示自发抽搐。通过转染钙传感器（ 如:，GCaMP6f ^11）中 ，有可能观察到收缩联接与钙的峰（ 图3）。

使用该系统，我们能够以确定在中央核肌病和肌强直性营养不良打乱一个新的分子途径，因此其可以是对创新分子疗法⁷的新靶点。我们也适于此方法研究了神经肌肉接头^（NMJ）12的开发。通过与大鼠脊髓外植体的共培养，我们已在NMJ形成¹³描述了用于动力蛋白的作用。

图 1: 成肌细胞文化发展阶段。 A）在扩散D2，成肌细胞一直坚守并开始激增。 B）在prolif关合作D3，60铺满 - 80％达到和成肌细胞开始自发地融合。 c）在分化D3，包含位于中央的细胞核肌管占主导地位。 D）从分化D5起（ 例如8天），肌纤维开始呈现出条纹和外设核并开始变厚。比例尺:50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:D8肌纤维免疫显的代表共焦成像。 A）免疫染色二氢吡啶受体（DHPR，上图）和triadin（TRDN，中间面板）。在DHPR，TRDN和DAPI通道的重叠图显示了黑社会组件共存。 B）在答Ç绘制的黄线）染色α辅肌动蛋白（绿色）和DAPI（蓝色）肌纤维的容积再现的三维图像的强度分布。比例尺和网格宽度:5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3: 自发性抽搐肌纤维钙水平的实时成像。在抽动肌纤维钙火花的 ）高速长延时（20ms的帧）显微镜。通过GCaMP6f的表达（Addgene质粒＃40755）中检测到的钙。 B）的荧光强度的定量随时间在面板A中的钙传感器_blank">请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

使用这种协议的主要成肌细胞的培养产生了一个特殊的利基，极大地培育肌纤维的发展。这部分是由于其也存在于非常小的数字的其它细胞类型。必须实现成肌细胞的浓度和纯度文化之间的平衡。一个良好的细胞培养物也取决于用于所述介质制剂中的产品的质量。动物来源的所有产品应彻底测试。在我们的经验中，消化条件下也应被监控。

像往常一样，小学文化，实验变异可能比孤立纤维或成肌细胞永生化的研究水平。这种变异可以通过介质和消化成分，小鼠的年龄和大小，以及用于培养操作和结果收集时间点的标准化减少。然而，在实时审议的错综复杂的机制的优点必要的肌纤维的发展大大超过了可变性的缺点。

这个协议赋予的体外方法的优点而不损害细胞的分化。肌纤维成熟直至形成打黑收缩偶联钙火花。这些功能性的输出可以在不同的实验条件下进行访问。此外，可存在到协议作出许多技术的变化。成肌细胞可以从与肌肉发育的兴趣突变新生小鼠收获。细胞可被裂解为在不同分化的时间点的生化分析。钙指标可以加到培养遵循其动态。光遗传学的结构可以用来执行一定的信号通路或诱导特异性当地反应。最后，肌纤维可以与其他细胞类型一起共培养，以研究它们的相互作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II	Gibco	17105041
Collagenase type V	Sigma-Aldrich-Aldrich	C9263
IMDM, Glutamax supplemented	Gibco	31980022
Matrigel Growth reduced factor	Corning	354230	protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5
Chicken Embryo Extract	MP biomedical	2850145	it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))
Recombinant rat agrin	R&D systems	550-AG-100
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Horse Serum	GE Healthcare	11581831
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150	used to transfect siRNA
Lipofectamine LTX	Invitrogen	15338-100	used to transfect DNA
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668030	used to transfect siRNA plus DNA
DPBS	Gibco	14190094
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF0001
Cell strainer	Corning	21008-949
Fluorodishes	World precision instruments	FD35-100	dishes used to cultivate cells for live imaging
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
16% PFA (Paraformaldehyde)	Science Services GmbH	E15710
Goat Serum	Sigma-Aldrich	G9023
BSA (Bovine Serum Albumine)	Sigma-Aldrich	A7906
Saponine	Sigma-Aldrich	47036
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	use at 200 ng/µL
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and Media
Digestion Mix			in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C
Dissection Medium			in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered
Growth Medium			in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Differentiation Medium			in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Blocking Solution			in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies