In Vitro дифференциацию зрелых мышечных волокон для живых изображений

Резюме

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Аннотация

Скелетные мышцы состоят из мышечных волокон, самых больших клеток в организме млекопитающих и один из немногих синцитий. Как сложные и эволюционно консервативными структуры, составляющие его собираются остается под следствием. Их размер и физиологические особенности часто ограничивают манипуляции и визуализации приложений. Культура линии иммортализованных клеток широко используется, но она может реплицироваться только ранние этапы дифференцировки.

Здесь мы опишем протокол, который позволяет легко генетической манипуляции миофибрилл, происходящих из первичных миобластов мыши. После одной недели дифференцировки миофибриллы отображения сократимости, выровнены саркомеры и триады, а также периферийные ядра. Весь процесс дифференциации может сопровождаться живого изображения или иммунофлюоресценции. Эта система сочетает в себе преимущества существующих ех естественных условиях и в пробирке протоколов. Возможность легкого и эффективного трансфекцией, а такжелегкость доступа ко всем этапам дифференциации расширяет возможности применения. Миофибрилл впоследствии может быть использован не только для решения актуальных вопросов развития и клеточной биологии, но и воспроизвести фенотип мышечных заболеваний для клинического применения.

Введение

Скелетная мышца составляет до 40% от человеческого веса тела ^1. Мышечные-ассоциированные расстройства представляют собой огромное здоровье и экономическое бремя ^2. Как это очень сложная и организованная ткань формируется, поддерживается и регенерируют представляет собой обширную и устоявшуюся область исследований. В зависимости от конкретного научного интереса, наиболее подходящий подход может варьироваться от простых myotube культур до комплекса в естественных условиях модели ^{3 - 6.}

Цель этого протокола заключается в создании системы в пробирке , которая позволяет осуществлять мониторинг миогенеза через живого изображения и иммунофлюоресценции. По сравнению с традиционными подходами, эта система предлагает очень полное и динамическое представление о процессе миогенного мыши. Клетки можно проследить со стадии миобластов к зрелой, многоядерные мышечное волокно , где отображаются поперечные триад и периферийные ядра ^7. Этот уровень может Созреваниебыть достигнута с помощью обычных клеточных культур оборудования, без необходимости использования сложных стимулирующими или механических устройствах. Хотя некоторые успеха в системах пробирке было зарегистрировано ^8,9, насколько нам известно, это единственный протокол генерации зрелых мышечные волокна мышь с Т-трубочек трансверсально спаренных с саркоплазматического ретикулума (СР). Таким образом, эта система в пробирке могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов формирования триады, которые до сих пор плохо понимаемые ^10.

Еще одно преимущество использования этой системы является наличие апробированных мыши, ориентированных ресурсов, таких как антитела, лекарственные препараты и средства RNAi. Относительно простой протокол не требует трудоемких шагов, высококвалифицированной манипуляции или дорогой и специализированное оборудование. Зрелые миофибриллы начинают появляться после 5 дней культуры дифференциации ^7, показывая сократимость в сочетании с кальцием искр (неопубликованные данные). В течение одной недели, различные разработкиAl этапы одной из самых сложных клеток в организме млекопитающих , могут быть изучены в сочетании с различными анализов в лабораторных условиях .

протокол

Примечание: Один Урожайность мыши достаточно миобласты в течение приблизительно двух 35 мм чашки или два блюда живой визуализации, так что план циновки, рассечения и покрытия (шаг 2,6) соответственно. Так как миобластов изолированы посредством последовательных центрифугировани и перед металлизацией, протокол должен быть осуществлен в партиях от 5 - 10 животных.

Все процедуры, связанные с субъектов животных были одобрены Комитетом по этике животных по крайней Instituto де Medicina молекулярной и Университет Пьера и Марии Кюри

1. Вскрытие неонатальной Мыши Мышцы задних конечностей

1. Подготовьте все решения заранее (Материалы таблицы) и стерилизуют фильтрацией (фильтр 0,22 мкм). Убедитесь , что все средства массовой информации , при 37 ° C перед добавлением к клеткам, за исключением составов , содержащих мембранную матрицу основания (например, Matrigel).
2. Стерилизовать рассечение материал (по одному из: изогнутые ножницы, прямые ножницы, обычные щипцы,и тонкий кончик пинцетом) и верстак, протирая их 70% -ным этанолом.
3. Приготовьте 100 мм чашки Петри с помощью 5 мл Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS) для сбора мышц и держать его на льду до стадии мясорубки.
4. Обезглавьте P6 - P8 мышей с прямыми ножницами и стерилизовать кожу с 70% этанола.
5. Сделайте надрез в коже спины и осторожно потяните ее в сторону задних конечностей, пока она не будет удалена, полностью обнажая мускулатуру задних конечностей.
6. Используйте пинцет для удаления жировой ткани без повреждения мышц.
7. Для того, чтобы удалить спинные мышцы задних конечностей, держать конечность растянутую и согнуть лапу, чтобы выставить пятки сухожилия. Используйте изогнутые ножницы, чтобы отделить мышцу от кости, начиная от сухожилий, осторожно скольжения и резки вверх. Акцизный мышцы и поместить их в замороженными ДЗФР.
8. Изолировать четырехглавой мышцы, зажимая мышцы с тонкой кончик пинцетом и резка вокруг него без повреждения бедра или коленного сустава.
9. После рассечения всех животных, переходите к стерильным ламинарного потока капот культуре клеток, где должны быть выполнены все следующие шаги.

2. миобластов Изоляция

1. Удалите избыток ДЗФР. Фарш ткани стерильными ножницами изогнутыми, чтобы получить однородную массу.
2. Сбор измельченной ткани в центрифужную пробирку 50 мл коническую с использованием 5 мл сбраживания смеси и инкубировать ее при перемешивании при 37 ° С в течение 90 мин.
3. Остановить пищеварение путем добавления 6 мл рассечение среды и центрифуге суспензию в течение 5 мин при 75 мкг, чтобы осадить оставшиеся ткани.
4. Осторожно собрать надосадочную жидкость. Убедитесь в том , чтобы не собирать мусор ткани. Центрифуга его при 350 мкг в течение 5 мин; ресуспендируют его в 5 мл среды диссекции.
5. Суспензию фильтруют через клеточную ячейки фильтра 40 мкм. Добавить 25 мл среды диссекции и preplate его в 150 мм чашке в течение 4 ч в инкубаторе для клеточных культур (37 & deg ; С и 5% СО _{2 <}/ Суб>), чтобы позволить фибробласты придерживаться.
6. В то время как перед металлизацией, пальто блюда с 500 мкл матрицы базальной мембраны, разведенным 1: 100 в холодной IMDM в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают один раз ДЗФР и немедленно высевания клетки (шаг 2.8) или оставить со средой роста до посева.
7. После того, как перед металлизацией, собирают супернатант и центрифугируют его при 350 х г в течение 10 мин.
8. Ресуспендируют его в среде роста и подсчета клеток на гемоцитометра. Отрегулируйте громкость так, что между 150 000 и 250000 клетки высевают на базальной мембраны матрицы покрытием блюдо. Сохранить клетки в культуре клеток инкубаторе.

3. Дифференциация мышечное волокно

ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 дней, клетки должны начать взрывателем и формы мышечных трубочек на уровне около 70% сплошности (рис 1B).

1. В этот момент, трансфекции клеток, если это желательно, с миРНК или представляющую интерес ДНК. Если клетки не быть трансфицированы, Непосредственный переход к дифференциации средних и лыжир к шагу 3.4.
2. Трансфекцию с реагентами трансфекцию следующими инструкциями изготовителя. Инкубируйте клетки в течение 5 ч с миРНК-липидных комплексов (20 нМ + 1 мкл реагента) или ДНК-липидных комплексов (1 мкг + 1 мкл реагента). Оптимизация концентрации миРНК и ДНК, если это необходимо.
3. Вымойте их, как только с дифференциацией среды, а затем перейти к новой дифференциации среды.
4. На следующий день, разбавить мембранную матрицу базальную 1: 2 в ледяном дифференциации среды. Удалите существующую среду и добавьте 200 мкл охлажденного льдом матрицы в каждую чашку.
5. Инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе для клеточных культур.
6. Дополнение дифференцировку среды агрином (100 нг / мл) и осторожно добавляют 2 мл к клеткам.
7. Тщательно изменить половину среды каждые 2 D, всегда дополняя агрином до конечной концентрации 100 нг / мкл.
8. Монитор дифференцировки клеток и жизнеспособность. В зависимости от ряда факторов (таких как FBS и CHicken эмбриона экстракт происхождение), клетки может занять от 5 - 10 дифференцирование для достижения полного созревания (рисунок 2).

4. Иммунологическое в стеклянным дном блюда

1. Для иммунное окрашивание, в любой временной точке интереса, промыть клетки один раз с ДЗФР и зафиксировать их с 4% PFA при комнатной температуре в течение 10 мин.
2. Вымойте их дважды ДЗФР. В этот момент клетки можно хранить при температуре 4 ° С.
3. Проницаемыми их с 0,5% Triton X-100 в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Промыть их в два раза ПБС, а затем блокируют блокирующим раствором в течение 30 мин при комнатной температуре.
5. Выдержите их с первичным антителом, разведенным в блокирующем растворе O / N при температуре 4 ° С.
6. Промыть 3 раза с ДЗФР в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Выдержите их с вторичным антителом, и 0,2 мкг / мл DAPI в течение 1 ч при комнатной температуре.
8. Промыть 3 раза с ДЗФР в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Добавить 200 мкл монтажной среды и приступить к визуализации.

Результаты

Степень развития мышечное волокно в основном определяется чистотой и жизнеспособность изолированных миобластов. Адгезия, пролиферация и фьюжн емкость можно использовать для эмпирически получить доступ к этим параметрам (Рисунок 1 A, B). При пролиферации D2, миобласты должны соблюдаться и должны отображать типичную форму веретенообразной. Пролиферация , как ожидается, произойдет экстенсивно на этой стадии, что приводит к образованию спонтанного myotube на следующий день (Фигура 1В).

Cell конфлуэнтности может понадобиться небольшие корректировки. Она должна быть увеличена, если миобласты принять более 3 D разрастаться и предохранитель. Он должен быть уменьшен, если мышечные волокна не могут расти и удлиненное относительно прямой связи с их плотностью. Слитности как правило, уменьшается в направлении от центра к периферии тарелки, так что лучшие миофибриллы должны быть найдены в направлении внешних областей.

Мышечные трубки быстро удлиняются и дисплей с несколькими центрально выстроенными ядрами (рис 1C). По D5, некоторые клетки начинают приобретать страты и перемещение их ядра к периферии. Количество миофибрилл со зрелыми характеристиками будет возрастать со временем, а также с толщиной клеток (рис 1D).

Степень дифференциации может быть дополнительно наблюдали с помощью иммунофлуоресценции. Миофибрилл зафиксирована на дифференциацию D8 присутствуют поперечные триад. Это может быть подтверждено компонентами визуализации Т-трубочек (DPHR) и SR (triadin), которые , как ожидается, локализуются на триады (рисунок 2).

Функциональность миофибрилл может быть решена путем живого изображения. От дифференциации D3 и далее, клетки дисплей спонтанное подергивание. Трансфекцией датчик кальция (например ,., GCaMP6f ^11), можно заметить , что сокращения связаны с пиками кальция (рисунок 3).

Используя эту систему, мы смогли определить новый молекулярный путь , который разрушается в centronuclear миопатии и миотонических дистрофии, поэтому , который может быть мишенью новым для инновационных молекулярных методов лечения ^7. Мы также адаптировать этот метод для изучения развития нервно - мышечного соединения (НМС) ^12. Через сокультивирования с крысиным спинного мозга эксплантов, мы описали роль динеин в формировании NMJ ^13.

Рисунок 1: Развивающие Этапы миобластов культуры. A) При пролиферации D2, миобласты привязали и начали пролиферирующих. Б) В ПролифD3 чество, A конфлуэнтности 60 - 80% достигается, и миобласты начинают сплавления спонтанно. C) при разграничении D3, содержащие мышечные трубки , расположенные в центре ядра преобладают. D) От дифференциации D5 и далее (например, 8 -й день), миофибриллы начинают экспонирование страты и периферийные ядра и начинают сгущаться. Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Представитель конфокальной Изображение D8 мышечное волокно Immunostain. А) иммуногистохимическое дигидропиридинового рецептора (DHPR, верхняя панель) и triadin (ТРДН, средняя панель). Наложение каналов DHPR, ТРДН и DAPI показывает колокализацию триады компонентов. Б) Профиль интенсивности желтой линии , проведенной в А. С) 3D - изображение объемного рендеринга миофибрилл окрашивали для альфа-актинин (зеленый) и DAPI (синий). Шкала бар и сетки ширина: 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Живая съемка уровня кальция в миофибриллы с самопроизвольным подергивания. A) Высокоскоростной заданный промежуток времени (20 мс кадров) микроскопия искры кальция в подергивания мышечное волокно. Кальций был обнаружен посредством экспрессии GCaMP6f (Addgene плазмида # 40755). Б) Количественная интенсивности флуоресценции с течением времени для датчика кальция в панели A._blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Использование этого протокола для выращивания первичных миобластов приводит к специальной нише, что в значительной степени подпитывает развитие миофибрилл. Это частично из-за других типов клеток, которые также присутствуют в очень небольшом количестве. Баланс между концентрацией миобластов и чистоту культуры должна быть достигнута. Хорошая культура клеток также зависит от качества продуктов, используемых для среднего состава. Все продукты, полученные из животных источников должны быть тщательно проверены. По нашему опыту, следует также контролировать условия пищеварения.

Как обычно для первичных культур, экспериментальная изменчивость может быть выше, чем в исследованиях с изолированными волокнами или бессмертных миобластов. Эта изменчивость может быть уменьшена путем стандартизации средних и переваривания компонентов, мышей возраста и размера, а также моменты времени для манипулирования культуры и сбора результатов. Тем не менее, преимущество тщательного в реальном масштабе времени замысловатые механизмынеобходимых для развития мышечное волокно значительно превосходит изменчивость недостаток.

Этот протокол дает преимущества подходов в пробирке без ущерба для дифференцировки клеток. Миофибрилл созревают до образования триады и сокращения связаны с искрами кальция. Эти функциональные выходы могут быть доступны в различных экспериментальных условиях. Кроме того, может быть много технических вариаций, внесенных в протокол. Миобластов могут быть собраны из новорожденных мышей с мутациями, представляющие интерес, связанных с развитием мышц. Клетки можно лизировать для биохимического анализа в различные моменты времени дифференцировки. Индикаторы кальция могут быть добавлены к культуре, чтобы следовать за ее динамикой. Оптогенетика конструкции могут быть использованы для обеспечения определенных сигнальных путей, или для индукции специфических локальных ответов. И, наконец, миофибриллы могут быть культивируют совместно с типами других клеток для изучения их взаимодействия.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II	Gibco	17105041
Collagenase type V	Sigma-Aldrich-Aldrich	C9263
IMDM, Glutamax supplemented	Gibco	31980022
Matrigel Growth reduced factor	Corning	354230	protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5
Chicken Embryo Extract	MP biomedical	2850145	it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012))
Recombinant rat agrin	R&D systems	550-AG-100
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Horse Serum	GE Healthcare	11581831
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150	used to transfect siRNA
Lipofectamine LTX	Invitrogen	15338-100	used to transfect DNA
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668030	used to transfect siRNA plus DNA
DPBS	Gibco	14190094
Fetal Bovine Serum (FBS)	Eurobio	CVFSVF0001
Cell strainer	Corning	21008-949
Fluorodishes	World precision instruments	FD35-100	dishes used to cultivate cells for live imaging
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
16% PFA (Paraformaldehyde)	Science Services GmbH	E15710
Goat Serum	Sigma-Aldrich	G9023
BSA (Bovine Serum Albumine)	Sigma-Aldrich	A7906
Saponine	Sigma-Aldrich	47036
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	use at 200 ng/µL
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and Media
Digestion Mix			in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C
Dissection Medium			in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered
Growth Medium			in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Differentiation Medium			in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered
Blocking Solution			in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies