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摘要

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

摘要

活性的蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸复合物的纯化是用于酶活性和新颖性亚基和翻译后修饰的从头鉴定表征至关重要。细菌系统中允许的各种单个的多肽和蛋白复合物的表达和纯化。然而，该系统不使能包含翻译后修饰（ 例如 ，磷酸化和乙酰化）的蛋白质亚基的纯化，和新颖的调节亚基是只存在/在真核系统中表达的鉴定。在这里，我们提供一种新的，健壮的，并使用STREP-有效串联亲和纯化（TAP）方法和FLAG标签的蛋白质，有利于蛋白质复合物的纯化与来自真核细胞中瞬时或稳定表达表位标记的蛋白质的详细描述。此协议可应用到表征PROTEIN复杂的功能，以发现复杂亚基的翻译后修饰，并通过质谱分析法来识别新调节复杂的组件。值得注意的是，此TAP方法可用于研究真核或病原（病毒和细菌）组分形成蛋白复合物，从而产生一宽的下游实验机会阵列。我们建议，研究人员的蛋白质复合物的工作可以利用许多不同的方法这种方法。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（质子泵抑制剂）是用于生物过程1，并在这些质子泵抑制剂进一步研究的精确调节临界可以告知他们的功能2。几种方法已被设计用于质子泵抑制剂的研究和表征以及用于新的调控蛋白组分的从头鉴定。 1989年，斯坦利领域和同事报道酵母双杂交（Y2H）检测3。这种方法允许在酿酒酵母作用因子（猎物）的定义的兴趣（诱饵）蛋白的公正和全面的鉴定。除了其用于发现质子泵抑制剂显着的效用，在Y2H测定可用于在酵母细胞中表征蛋白质对，限定最小相互作用域，以及识别废除这种相互作用的突变。通过修改Y2H测定中，质子泵抑制剂，也可在哺乳动物细胞中研究了类="外部参照"> 4。在Y2H测定（ 如酵母三杂交系统）的变型也可以用于研究蛋白质的RNA，并在细胞中的蛋白质，小的有机配体的相互作用。

另一种常用的工具来研究质子泵抑制剂以同源系统是共免疫沉淀（共-IP）测定5。通过使用抗体免疫沉淀目的蛋白质，共同的IP测定使研究人员能够监测细胞对各种环境条件和实验条件质子泵抑制剂。使用表位标记的蛋白（ 例如 ，FLAG，Myc基因，STREP和HA，等等）在亲和纯化（AP）的方法，促进了从复合蛋白质混合物为几个下游测定法，包括免疫印迹蛋白质的分离，银染色的和酶分析。然而，这些以前的方法使能大量的蛋白质复合物的用于进一步表征，包括在体外在隔离ssays，通过质谱法，和翻译后修饰的识别调节亚基的发现。该AP方法的改进版本被称为串联的AP（TAP），这是通过创建与通过两个连续的AP 6,7纯化两个表位的融合蛋白研究质子泵抑制剂的纯化技术。在这篇文章中，我们提出了净化蛋白复合物，其中两个亚单位的标签与不同的表位，然后通过两个连续的AP（STREP AP随后FLAG IP）纯化TAP方法的变型。我们首先提供的TAP的一个简约概述（ 图1），然后所有的试验步骤的详细描述（ 图2），使得研究人员可以将它们应用到他们感兴趣的蛋白复合物。

为了证明在TAP方法的适用性，我们选择了一个良好表征细胞周期CDK络合物（简称PTEFB激酶），它是由所述调节亚基细胞周期蛋白T1（CycT1）和激酶（CDK9）的，并且是由RNA聚合酶II（RNA聚合酶II）8，9，10参与转录的调节。 P-TEFB磷酸聚合酶II和其相关联的消极延伸因子，这在启动子减轻转录暂停的C-末端结构域，并由此促进转录延伸11，12，13。考虑到这一众所周知的互动，STREP标记CycT1和FLAG标记CDK9均超过在HEK293T细胞中表达。互惠TAP实验与STREP标记CDK9和FLAG标记CycT1进行进一步验证该蛋白质相互作用是独立使用的表位。收集细胞并裂解48小时后转染。 （AP STREP之后FLAG的可溶性裂解液纯化TAPIP）。输入和纯化蛋白通过Western印迹和银染色（ 图3）分析。

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研究方案

1.电镀细胞

  1. 转染前一天，板3.5×10 6个 HEK293T细胞于10ml Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中的补充有10％（体积/体积）胎牛血清（FBS）和1％（体积/体积）青霉素/链霉素（10,000 U / ml的股票）每100毫米的菜。板3 - 5 100个实验/条件毫米的菜肴，以保证足够的蛋白质回收。
    注:板的数量为每个实验/条件，这将依赖于感兴趣的蛋白质复合物的表达水平和溶解性来确定。可替代地，如果需要更大规模的纯化，细胞系可以适于在悬浮于生长在旋转烧瓶2中 ，但这种方法不会对瞬时转染工作。

2.转染细胞或诱使稳定细胞系

  1. 第二天，检查在显微镜下细胞。细胞必须是70 - PROCE前80％汇合eding。
  2. 转染的细胞以每100mm培养皿转染试剂的质粒DNA的7微克和21微升总混合物。转染细胞的载体表达GFP（ 表1）作为转染效率的对照。
    注意:如果使用诱导响应于多西环素14，15的两个或更多个复杂亚基表达的HEK293-T-REX或类似的稳定细胞系，该诱导剂将必须加入到细胞中，并培养48小时。同样地，也将需要验证目的诱导的GFP在加入诱导剂的表达的稳定细胞系。继续执行步骤2.7。
  3. 准备每100mm培养皿转染混合物。在1.5ml微量离心管中，总质粒DNA（对应于两个或更多的质粒）的7微克混合500μl的未补充的DMEM。在一个单独的离心管中，混合500微升未补充的DMEM的Wi日21微升的转染试剂。重复每个转反应。
  4. 吸取转染试剂溶液到质粒DNA溶液（不混合以相反的顺序解）。吹打至少4次混合。
  5. 孵育该混合物在室温下进行10 - 15分钟，但超过15分钟不再。
  6. 倾斜板创建介质贮存器和小心逐滴吸取转染混合物到板的内部侧而不会干扰细胞。返回菜到原来的平面位置和漩涡轻轻分配混合物。
  7. 孵育在37℃下将细胞在5％的CO 2的潮湿的细胞培养箱中（该条件在下文中称为"组织培养孵化"）。更换介质5小时转染后（可选）。

3.检查转染或诱导效率

  1. 在24小时后转染，可视化流感下细胞orescent显微镜检查转染效率（或表达GFP控制HEK293T-REX稳定细胞系的诱导）。孵育另外24小时。

4. STREP亲和纯化（STREP AP）

  1. 收集的细胞
    1. 在48小时后转染，删除媒体并加入8毫升冷1X磷酸盐缓冲液（PBS）的。吸管上下从板脱落的细胞。
    2. 收集和细胞悬液转移到15毫升管中，在4℃旋转细胞向下以800 xg离心4分钟。
    3. 删除PBS上清。重复降速（800×g离心在4℃下1分钟），以消除任何残留的PBS中。保存细胞沉淀在-80℃以备将来使用或按照以下步骤继续蛋白纯化。
  2. 裂解细胞
    1. 悬浮用5×细胞沉淀体积被动裂解缓冲液的细胞沉淀（每个板250微升）（PLB:20mM的Tris-盐酸pH为7.5，150 mM氯化钠，1.5mM的MgCl 2的，1毫摩尔DTT，蛋白酶抑制剂混合物片剂，5％体积/体积的甘油，和1.0％的NP-40）和细胞悬浮液转移到一个1.5 ml离心管。
    2. 在4℃短暂涡旋悬挂和章动30分钟。
    3. 降速细胞悬浮液以10,000×g离心10分钟，在4℃下。
    4. 转移可溶性裂解物进入一个新的1.5 ml离心管并弃去细胞沉淀。可节省10％的可溶性裂解物作为最终体积的"STREP AP输入"。保存在4℃。
  3. 平衡的STREP珠
    注:使用STREP珠第一个AP一步！配合拉下来STREP珠复苏比那些FLAG珠拉下显著更多的蛋白质。
    1. 取出（正×40微升）+ n中的50％的STREP珠浆液微升（N =样品数量），并在4℃降速在1500 xg离心2分钟。
      注:使用广泛米outhed提示，吸管珠。
    2. 除去上清液，加入500μlPLB到珠。章动珠子混合物在4℃5分钟。降速在1500 XG为2分钟，4℃。
      1. 重复总共3次洗涤。重悬在PLB珠粒到n的终体积×40微升。
    3. 添加40微升50％的STREP珠浆液对每个细胞裂解物样品和章动2小时，在4℃。
  4. STREP AP
    1. 降速的解决方案在1500 XG为2分钟，在4℃。
    2. 在4℃去除上清，店作为"STREP AP流通型（FT）"。
    3. 加入500μlSTREP AP洗涤缓冲液I（20mM的Tris-盐酸pH值7.5，250mM的氯化钠，1.5mM的MgCl 2的，1毫摩尔DTT，5％甘油和0.2％的NP-40）的小珠的。章动珠子混合物在4℃，5分钟，离心以1500 xg离心在4℃下2分钟。弃去上清液。
      1. 重复，共4次洗涤。
        注:第四洗涤之前，将珠粒溶液转移至新的1.5 ml离心管，以减少蛋白质背景。这一步是必要的。
    4. 加入500μl洗涤缓冲液II（100mM的Tris-盐酸pH值8.0，150mM的NaCl和1mM EDTA）中并通过反相管平衡的珠子。降速在1500 xg离心2分钟，在4℃，弃上清。
    5. 洗脱目的蛋白质用50μlSTREP洗脱缓冲液（100毫摩尔Tris-盐酸pH为8.0，150 mM氯化钠，1mM EDTA中，和2.5mM脱硫生物素）的。涡流在800rpm，在4℃下15分钟。
    6. 降速珠粒在1500 xg离心1分钟，在4℃下。收集上清液。该级分对应于"STREP AP洗脱"样品。
    7. 保存在4℃的珠粒级分用于第二洗脱，这可能会产生高达与第一洗脱获得的蛋白质的量的一半。在STREP AP洗脱分装10％的银染色和/或免疫印迹16。
  5. 平衡的FLAG珠
    1. 取出（NX 16微升）+ N的FLAG珠溶液微升（N =样品数量），并在4℃降速在1500 xg离心2分钟。
      注:使用广口提示，吸管珠。
    2. 除去上清液，并添加FLAG洗涤缓冲液500微升（100毫摩尔Tris-盐酸pH为8.0，150 mM氯化钠，1mM的EDTA和0.1％NP-40）至珠。降速在1500 XG为2分钟，4℃。重复总共3次洗涤。
    3. 重悬在FLAG洗涤缓冲液珠粒于nx 16微升的最终体积。
    4. 在4℃加入16微升的FLAG珠浆剩余的STREP AP洗脱和章动过夜。

5. FLAG IP

  1. 降速FLAG珠悬浮在1500 XG为2分钟，4℃。在4℃下保存上清液和存储为"FLAG IP流过"式（FT）。
  2. 加50081; FLAG洗涤缓冲液将溶液的湖章动，在4℃下在4℃下5分钟，然后离心以1500 xg离心2分钟。重复，共4次洗涤和每次洗涤后除去上清液。
    注:第四洗涤之前，蛋白质 - 小珠溶液转移至新的1.5 ml离心管，以减少背景。这一步是必要的。
  3. 从最后的旋转除去上清液，并添加含FLAG肽的200毫微克/微升到珠粒FLAG洗涤缓冲液的30微升。涡流在800rpm，在4℃下2小时。
  4. 降速悬浮液在1500×g离心2分钟，在4℃。收获在4℃将上清液和存储为"FLAG IP洗脱"。
    注:洗脱样品可以通过银染色和/或免疫印迹使用标准协议16进行确认，并准备进一步蛋白分析。在建立免疫印迹，运行所有下面的示例:（1）STREP AP输入，（2）STREP AP FT，（3）STREP AP Eluti上，（4）FLAG IP FT，和（5）FLAG的IP洗脱。装卷将具有用于每个实验加以确定。所有收集的样品和珠子可以储存在4℃短期贮存，并在-80℃下长期贮存。 TAP样品可以通过质谱法进行分析，以核实它们的组件的身份，以确定新的翻译后后修饰，和/或到发现用纯化复杂2，17中的任何新的蛋白质相互作用。为了这个目的，在运行考马斯凝胶或银染色后，频带可使用干净的手术刀凝胶切。几个优秀条评论讨论质谱方法进行了先前公布的18，19。

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结果

在这篇文章中，我们展示了TAP方法充分表征CycT1-CDK9复合物（也被称为P-TEFB激酶）的适用性。

和CDK9-FLAG（CDK9:F），或CDK9-STREP（CDK9:S）和细胞周期蛋白T1-FLAG（CycT1:F）:编码细胞周期蛋白T1-STREP（S CycT1）质粒（ 表1），转染入HEK293T细胞。阴性对照包括用空载体和CDK9转染:F或CycT1:F质粒（ 图3A和B，

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讨论

此处所描述的表达和从真核细胞中的蛋白质复合物的分离的协议不限于这样的分子组件的生化特性，但也可用于新的交互件和翻译后修饰，可以调节它们的功能的识别。亲和标签的使用并不限于是什么在这个协议中提到;但我们的经验表明，使用STREP作为第一个AP步骤显著增强了最终蛋白质 - 蛋白质复合物的产率。都与其它表位标签（ 例如 ，FLAG）相比，距离STREP珠的结合和洗脱步骤是非常有...

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披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D'Orso.

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH3002.2FS
Fetal bovine serumGE Healthcare Life Sciences/HycloneSH30071
Penicillin/StreptomycinMP BiomedicalsMP091670049
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
Protease inhibitor cocktail Roche 11836153001
STREP-Tactin SuperflowIBA Lifesciences2-1208-010
STREP-tag elution bufferIBA Lifesciences2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichF2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeveCorning 430167
Protein Lo-Bind EppendorfEppendorf022431081
Digital Vortex MixerFisher Scientific 02-215-370
48 hole micro tube foam rackFisher Scientific02-215-386
Labquake shaker rotisserie Thermo 415110

参考文献

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