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要約

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

要約

活性なタンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸複合体の精製は、酵素活性および新規サブユニットおよび翻訳後修飾の新規同定の特徴付けのために重要です。細菌系は、単一のポリペプチドおよびタンパク質複合体の広範囲の発現および精製を可能にします。しかし、このシステムは、翻訳後修飾を含有タンパク質サブユニット（ 例えば 、リン酸化およびアセチル化）の精製、および唯一の存在である新規な調節サブユニットの識別を可能に/真核生物系で表現されません。ここでは、真核細胞から一過性または安定的に発現エピトープタグ付きタンパク質とタンパク質複合体の精製を容易に小説、堅牢、かつSTREP-を使用して効率的なタンデムアフィニティー精製（TAP）法およびFLAGタグ融合タンパク質の詳細な説明を提供します。このプロトコルはPROTを特徴付けるために適用することができますEIN複雑な機能、複雑なサブユニット上の翻訳後修飾を発見する、および質量分析によって新たな規制の複雑なコンポーネントを識別するために。特に、このTAP法は、このように下流の実験機会の広い配列を得、真核生物または病原性（ウイルス性および細菌性）成分により形成されるタンパク質複合体を研究するために適用することができます。我々は、タンパク質複合体を扱う研究者は、多くの異なる方法で、この方法を利用することができることを提案します。

概要

タンパク質間相互作用（PPIの）生物学的プロセス1の正確な調節のために重要であり、これらのPPIに関するさらなる研究は、それらの機能2をお知らせすることができます。いくつかのアプローチがのPPIの研究と特徴付けのためだけでなく、新たな規制のタンパク質成分のデノボ識別のために考案されています。 1989年、スタンリーフィールズらは、酵母ツーハイブリッド（Y2H）アッセイ3を報告しました 。このアプローチは、 サッカロマイセス・セレビシエの関心の定義されたタンパク質（ベイト）のための相互作用（獲物）の公正かつ包括的な同定を可能にします。 PPIを発見するために著しい有用性に加えて、Y2Hアッセイは、酵母細胞におけるタンパク質の組を特徴付ける最小相互作用ドメインを定義し、そのような相互作用を廃止突然変異を同定するために使用することができます。 Y2Hアッセイを改変することによって、のPPIはまた、哺乳動物細胞において研究することができますクラス= "外部参照"> 4。 Y2Hアッセイ（ 例えば 、酵母スリーハイブリッドシステム）の変動は、細胞内タンパク質、RNAおよびタンパク質-小有機リガンド相互作用を研究するために適用することができます。

相同システムでのPPIを研究するための別の一般的に使用されるツールは、共免疫沈降（共-IP）アッセイ5です。関心対象のタンパク質を免疫沈降するために抗体を使用することにより、共IPアッセイは、研究者が様々な環境条件および実験の状況のた​​めに細胞中でのPPIを監視することを可能にします。親和性精製（AP）メソッド内のエピトープタグ付きタンパク質の使用（ 例えば 、FLAG、Mycを、STREP、およびとりわけHAは、）、銀染色をウェスタンブロットを含むいくつかの下流のアッセイのための複雑なタンパク質混合物からのタンパク質の単離を容易にしました、および酵素的分析。しかしながら、これらの従来のアプローチのいずれも、in vitroでの Aを含む、さらなる特徴付けのためのタンパク質複合体の大量の単離を可能にしませんssays、質量分析による調節サブユニットの発見、および翻訳後修飾の同定。 AP法の改良版は、2後続のAP 6、7を通して精製された2つのエピトープとの融合タンパク質を作成することでのPPIを研究するための精製技術であるタンデムAP（TAP）と呼ばれています。この記事では、二つのサブユニットは、異なるエピトープでタグ付けした後、2回の連続のAP（STREP AP FLAG IPが続く）を通して精製された精製タンパク質複合体のためのTAP方法のバリエーションを提示します。研究者が興味のあるタンパク質複合体に適用できるように、我々はまず、TAPのミニマル概要（ 図1）と、すべての実験工程（ 図2）の詳細な説明を提供します。

TAP法の適用性を実証するために、我々は、PTと呼ばれる（複雑なよく特徴付けサイクリンCDKを選ん調節サブユニット、サイクリンT1（CycT1）及びキナーゼ（CDK9）から構成され、RNAポリメラーゼII（Pol II）8、9、10による転写の調節に関与するEFBキナーゼ）。 P-TEFbはポルIIプロモーターで転写休止を軽減それに関連する負の伸長因子のC末端ドメインをリン酸化し、それによって転写伸長11、12、13を容易にします 。このことを念頭に置い既知の相互作用により、STREPタグ付きCycT1およびFLAGタグCDK9はHEK293T細胞で過剰発現しました。逆数TAP実験をさらにタンパク質相互作用を利用するエピトープとは無関係であることを検証するためにSTREPタグ付きCDK9およびFLAGタグCycT1を用いて行きました。細胞を48時間トランスフェクション後に回収し、溶解しました。可溶性溶解物をTAPにより精製した（STREP APは、FLAGが続きますIP）。入力および精製されたタンパク質は、ウェスタンブロットおよび銀染色（ 図3）によって分析しました。

プロトコル

1.めっきセル

  1. トランスフェクションの1日前に、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）および1％（v / v）のペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mLに3.5×10 6 HEK293T細胞をプレート100ミリメートル皿当たり（10,000 U / mlのストック）。十分なタンパク質回収を確実にするために、実験/条件当たり5 100mm皿 - プレート3。
    注意：プレートの数は、目的のタンパク質複合体の発現レベルおよび溶解度に依存するそれぞれの実験/条件に対して決定されなければなりません。より大規模な精製が必要な場合は別の方法として、細胞株は、スピナーフラスコ2に懸濁液中で増殖するように適合させることができますが、この方法は、一過性トランスフェクションのために動作しません。

2.細胞をトランスフェクトまたは安定な細胞株を誘導

  1. 翌日、細胞を顕微鏡下で確認してください。 proce前に、80％コンフルエント - 細胞は70でなければなりませんeding。
  2. プラスミドDNAの7μgの100 mmディッシュあたりのトランスフェクション試薬の21μlの総混合物で細胞をトランスフェクトします。トランスフェクション効率のコントロールとしてGFP（ 表1）を発現するベクターで細胞をトランスフェクトします。
    注：HEK293-T-REXまたはドキシサイクリン14,15に応答して二つ以上の複合体のサブユニットの発現を誘導する同様の安定した細胞株を使用する場合、誘導物質を細胞に添加し、48時間インキュベートされなければなりません。同様に、誘導物質の添加時にGFPの発現を誘導する安定な細胞株はまた、検証目的のために必要とされるであろう。 2.7に進みます。
  3. 100ミリメートル皿当たりトランスフェクション混合物を準備します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、（2以上のプラスミドに相当）総プラスミドDNAの7μgのと非補充DMEM500μlのを混ぜます。別々のマイクロ遠心チューブでは、未補充DMEMのwiの500μLを混ぜますトランスフェクション試薬の第21μlの。各トランスフェクション反応のために繰り返します。
  4. プラスミドDNA溶液へのトランスフェクション試薬溶液をピペットで（逆の順序でソリューションを混在させないでください）。少なくとも4回ピペッティングして混ぜます。
  5. もはや15分より15分、しかし - 10室温でこの混合物をインキュベートしていません。
  6. メディアリザーバーを作成して、慎重に細胞を乱すことなく、プレートの内側に滴下トランスフェクション混合物をピペットするためにプレートを傾けます。元の平らな位置に皿を返し、混合物を配布するために穏やかに旋回。
  7. （この条件は以下「組織培養インキュベーター」とも呼ばれる）、5％CO 2の加湿細胞培養インキュベーター中、37℃で細胞をインキュベートします。メディア5時間後、トランスフェクション（オプション）を交換してください。

3.確認トランスフェクションまたは誘導効率

  1. 24時間後、トランスフェクションでは、インフルエンザの下で細胞を可視化orescent顕微鏡は、トランスフェクション効率（またはGFPを発現制御HEK293T-REX安定な細胞株の誘導）をチェックします。さらに24時間インキュベートします。

4. STREPアフィニティー精製（STREP AP）

  1. 細胞を収集します
    1. 48時間トランスフェクション後に、培地を除去し、冷1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の8ミリリットルを追加します。プレートから細胞を剥離するために上下にピペット。
    2. 収集し、15 mLのチューブに細胞懸濁液を移し、4℃で4分間、800×gで細胞をスピンダウン。
    3. PBS上清を取り除きます。任意の残留PBSを除去するために（4℃で1分間、800×gで）スピンダウン繰り返します。将来の使用のために-80℃で細胞ペレットを保存したり、タンパク質精製を続行するには、以下の手順に従ってください。
  2. 細胞を溶解
    1. 受動溶解緩衝液の細胞ペレットの体積（プレート当たり〜250μl）を×5を使用して、細胞ペレットを再懸濁し（PLB：20mMトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaCl、1.5mMのMgCl 2を、1mMのDTT、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠、5％（v / v）のグリセロール、1.0％NP-40）及び細胞懸濁液を転送します1.5ミリリットルマイクロチューブ。
    2. 簡単に言うと4℃で30分間サスペンションとうなだれるをボルテックス。
    3. 4℃で10分間10,000×gで細胞懸濁液をスピンダウン。
    4. 新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに可溶性溶解物を移し、細胞ペレットを捨てます。可溶性溶解物の最終体積の10％を保存」STREP AP入力。」 4℃で保存。
  3. STREPビーズを平衡化
    注：最初のAPのステップの使用STREPビーズ！複合体はSTREPビーズでプルダウンFLAGビーズでプルダウンものよりも有意に多くのタンパク質を回収。
    1. アウトテイク（nは40μLを×）+ nは50％STREPビーズスラリーμlの（N =サンプル数）、4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。
      注：使用ワイドメートルピペットビーズにヒントをouthed。
    2. 上清を除去し、ビーズにPLBの500μlを添加します。 4℃で5分間ビーズ混合物を章動。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。
      1. 合計3回の洗浄のために繰り返します。 40μlの×n個の最終容量までPLB中のビーズを再懸濁します。
    3. 4℃で2時間、各細胞溶解物のサンプルとうなだれるに50％STREPビーズスラリー40μlのを追加します。
  4. STREP AP
    1. 4℃で2分間、1500×gでソリューションをスピンダウン。
    2. 4°Cで「STREP APフロースルー（FT）」と上清とストアを削除します。
    3. ビーズにSTREP AP洗浄緩衝液500μlのI（20mMのトリス塩酸pH7.5で、250mMのNaClを、1.5のMgCl 2、1mMのDTT、5％グリセロールおよび0.2％NP-40）を追加します。 5 4℃で分および4℃で2分間、1500×gで遠心分離するためのビーズ混合物を章動させます。上清を捨てます。
      1. 4回の洗浄の合計のために繰り返します。
        注：第洗浄する前に、タンパク質のバックグラウンドを低減するために、新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにビーズ液を移します。このステップは必須です。
    4. 500μlの洗浄緩衝液II（100 mMトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、および1mM EDTA）を加え、チューブを反転させてビーズを平衡化。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウンし、上清を捨てます。
    5. STREP溶出緩衝液（100mMのトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、および2.5 mMのデスチオビオチン）50μlの目的のタンパク質を溶出させます。 4℃で15分間、800rpmでボルテックス。
    6. 4℃で1分間、1500×gでビーズをスピンダウン。上清を収集します。この画分は、「STREP AP溶出」のサンプルに対応します。
    7. 最初の溶出で得られたタンパク質の量の半分までをもたらし得る2回目の溶出、4℃でビーズ画分を保存します。銀染色および/またはウェスタンブロッティングのためにSTREP AP溶出の一定分量10％16。
  5. FLAGビーズを平衡化
    1. （NX 16μl）を取り出し+ n個μlのFLAGビーズの溶液（n個のサンプルの=数）と4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。
      注：ピペットのビーズに広口のヒントを参考にしてください。
    2. 上清を除去し、FLAG洗浄緩衝液500μlを追加（100mMのトリス塩酸pH8.0の、150mMのNaCl、1mMのEDTA、および0.1％NP-40）ビーズへ。 4℃で2分間、1500×gでスピンダウン。合計3回の洗浄のために繰り返します。
    3. NX 16μlの最終体積にFLAG洗浄緩衝液でビーズを再懸濁します。
    4. 4℃で残りのSTREP AP溶出とうなだれる一晩にFLAGビーズスラリーの16μLを加えます。

5. FLAG IP

  1. 4℃で2分間、1500×gでFLAGビーズ懸濁液をスピンダウン。 4°Cで「FLAG IPフロースルー」（FT）として、上清とストアを保存します。
  2. 500を追加します。81;溶液へのFLAG洗浄緩衝液のリットル。 5 4℃で分および4℃で2分間、1500×gで遠心分離するための章動させます。 4回の洗浄の合計のために繰り返して、各洗浄後に上清を除去します。
    注：第洗浄する前に、バックグラウンドを低減するために、新しい1.5ミリリットルのマイクロチューブにタンパク質ビーズのソリューションを転送します。このステップは必須です。
  3. 最後のスピンから上清を除去し、ビーズにFLAGペプチドの200 ngの/μLを含むFLAG洗浄緩衝液の30μLを追加します。 4℃で2時間、800 rpmでボルテックス。
  4. 4℃で2分間、1500×gでサスペンションをスピンダウン。 4℃で上清とストアを収穫 "FLAG IP溶出。」
    注：溶出サンプルは、標準的なプロトコル16を使用して、銀染色および/またはウェスタンブロットによって確認し、さらにタンパク質アッセイのための準備ができていることができます。 （1）STREP AP入力、（2）STREP AP FT、（3）STREP AP Eluti：ウェスタンブロットを設定する場合は、以下のサンプルのすべてを実行します（4）FLAG IP FT、上、および（5）FLAG IP溶出。ロードされたボリュームは、各実験のために決定する必要があります。すべての収集されたサンプルとビーズは、短期記憶および長期保存のために-80℃で、4℃で保存することができます。 TAPサンプルは、その構成要素の身元を確認するための新規の翻訳後修飾（PTMを）を識別するために、および/または精製された複合体2、17を有する任意の新規なタンパク質相互作用を検出するために質量分析によって分析することができます。この目的のために、クマシーゲルまたは銀染色を実行した後、バンドはきれいなメスを用いてゲルから切り出すことができます。質量分析法を議論するいくつかの優れたレビューは、以前に18、19を発表しました。

結果

この記事では、我々は（また、P-TEFbキナーゼとして知られている）は、複雑なよく特徴付けCycT1-CDK9にTAP法の適用性を実証します。

CDK9-FLAG（CDK9：F）、またはCDK9-STREP（CDK9：S）およびサイクリンT1-FLAG（CycT1：F）：サイクリンT1-STREP（S CycT1）をコードするプラスミド（ 表1）は 、HEK293T細胞にトランスフェクトし...

ディスカッション

真核細胞からのタンパク質複合体の発現および単離のためにここに記載したプロトコルは、このような分子集合体の生化学的特徴付けに限定されるものではなく、それらの機能を調節することができ、新規な相互作用および翻訳後修飾の同定に利用することができます。親和性タグの使用は、このプロトコルに記載されているものに限定されるものではありません。しかし、我々の経験は、?...

開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D'Orso.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH3002.2FS
Fetal bovine serumGE Healthcare Life Sciences/HycloneSH30071
Penicillin/StreptomycinMP BiomedicalsMP091670049
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
Protease inhibitor cocktail Roche 11836153001
STREP-Tactin SuperflowIBA Lifesciences2-1208-010
STREP-tag elution bufferIBA Lifesciences2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichF2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeveCorning 430167
Protein Lo-Bind EppendorfEppendorf022431081
Digital Vortex MixerFisher Scientific 02-215-370
48 hole micro tube foam rackFisher Scientific02-215-386
Labquake shaker rotisserie Thermo 415110

参考文献

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