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요약

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

초록

활성 단백질 - 단백질, 단백질 - 핵산 복합체의 정제 효소 활성 및 신규 서브 유닛 및 번역 후 변형의 드 노보 식별의 특성에 매우 중요하다. 박테리아 시스템들은 단일 폴리펩티드 및 단백질 복합체의 다양한 발현 및 정제를 허용한다. 그러나,이 시스템은 번역 후 변형 (예를 들어, 아세틸 화 및 포스 포 릴화)을 포함 소단위 단백질의 정제 및 진핵 시스템에서의 발현 만 존재하는 신규 규제 소단위 /의 식별을 가능하게하지 않는다. 여기서 우리는 진핵 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 표현 에피토프 - 태그 단백질과 단백질 복합체의 정제를 용이하게하는 소설, 강력한, 그리고 STREP-를 사용하여 효율적인 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방식과 FLAG-태그 단백질에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 PROT의 특성을 적용 할 수있다EIN 복잡한 기능 복잡한 서브 유닛의 번역 후 변형을 발견, 및 질량 분광법에 의해 신규 규제 복잡한 구성 요소를 식별하기. 특히,이 방법은 TAP 따라서 하류 실험 기회 광범위한 항복 진핵 또는 병원성 (바이러스 성 및 세균성) 구성 요소에 의해 형성되는 단백질 복합체를 연구에 적용될 수있다. 우리는 단백질 복합체와 협력 연구자들이 다양한 방법으로이 방법을 활용할 수 있다고 제안한다.

서문

단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)는 그 기능이에 대해 알릴 수 생물학적 과정 (1),이 프로톤 펌프 억제제에 대한 추가 연구의 정확한 조절을 위해 중요하다. 몇몇 접근법은 프로톤 펌프 억제제의 연구 및 특성뿐만 아니라 신규 조절 단백질 성분의 드 노보 식별을 위해 고안되었다. 1989 년 스탠리 필드와 동료들은 효모 두 하이브리드 (Y2H) 분석 (3) 보도했다. 이 방법은 사카로 마이 세스 세레 비지에 인터랙 관심 (미끼)의 정의 단백질 (할까요)의 공평하고 포괄적 인 식별 할 수 있습니다. 프로톤 펌프 억제제를 발견하기위한 현저한 유틸리티 또한 Y2H 분석은, 효모 세포에서 단백질을 특성화 쌍 최소 상호 작용 도메인을 정의하고, 이러한 상호 작용을 폐지 변이를 식별하는데 사용될 수있다. Y2H 분석을 수정하여, 프로톤 펌프 억제제는 포유 동물 세포에서 공부하실 수 있습니다클래스 = "외부 참조"> 4. Y2H 분석 (예, 효모 세 하이브리드 시스템)의 변형, 단백질 및 RNA 세포 단백질 작은 유기 리간드 상호 작용을 연구에 적용 할 수있다.

상동 시스템에서 프로톤 펌프 억제제를 연구하는 또 다른 일반적으로 사용되는 도구는 공동 면역 (공동 IP) 분석 5입니다. 관심의 단백질을 면역 침전에 대한 항체를 사용하여, 공동 IP 분석 연구자들은 다양한 환경 조건 및 실험 상황에서 셀의 프로톤 펌프 억제제를 모니터링 할 수있다. 에피토프 - 태그 단백질 (예를 들면, FLAG는, Myc와, STREP 및 HA는, 다른 사람의 사이에서) 친 화성 정화 (AP) 방법이 서양 얼룩 등 여러 다운 스트림 분석 복잡한 단백질 혼합물에서 단백질의 분리를 촉진했다,은 얼룩의 사용 및 효소 분석. 그러나 이러한 이전 방법 중 어느 것도 체외을 포함하여 더 특성화 단백질 복합체의 대량의 분리를 사용하지ssays, 질량 분석 및 번역 후 변형의 식별에 의한 규제 서브 유닛의 발견. AP 통신 방식의 향상된 버전은 두 개의 연속적인 AP들 (6, 7)를 통해 정제하여 두 에피토프와 융합 단백질을 생성하여 프로톤 펌프 억제제의 연구를위한 정제 기술이다 텐덤 AP (TAP)를 호출한다. 이 문서에서 우리는 두 개의 서브 유닛이 다른 에피토프 태그 다음 두 순차 액세스 포인트 (AP STREP FLAG IP 다음)를 통해 정제하는 정제 단백질 복합체의 TAP 방법의 변화를 제시한다. 연구자들이 관심을 자신의 단백질 복합체에 적용 할 수 있도록 우리가 먼저, TAP의 최소한의 개요 (그림 1)과 모든 실험 단계에 대한 자세한 설명 (그림 2)을 제공한다.

탭 방식의 적용 성을 입증하기 위해, 우리는 (복소 잘 특징 사이클린 CDK는 PT라고 선택한규제 소단위 사이클린 T1 (CycT1) 및 키나제 (경우, Cdk9)로 구성되며, RNA 중합 효소 II (POL II) 8, 9, 10에 의해 전사 조절에 관여 EFB 키나아제). P-TEFb는 폴 II 상기 프로모터에서 전사를 일시 완화 연관된 부정적인 신장 요소의 C 말단 도메인을 인산화시켜 전사 신도 11, 12, 13을 용이하게한다. 이를 염두에 알려진 상호 작용, CycT1을 STREP - 태그 및 FLAG-태그 경우, Cdk9는 HEK293T 세포에서 발현 이상이었다. 상호 TAP 실험은 더 단백질 상호 작용이 사용 된 에피토프에 독립적 인 것을 확인하는 STREP-태그 경우, Cdk9과 FLAG-태그 CycT1로 하였다. 세포를 수거하고, 48 시간 후 형질 감염을 용해시켰다. 가용성 해물이 TAP 그래피 (STREP AP는 FLAG 다음IP). 입력 및 정제 된 단백질은 서양 얼룩과 실버 얼룩 (그림 3)에 의해 분석 하였다.

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프로토콜

1. 도금 세포

  1. 전날 형질에 10 % (v / v)의 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (v / v)의 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 10 mL에 3.5 × 106 HEK293T 세포 플레이트 100mm 접시 당 (10,000 U / ㎖의 주). 플레이트 (3) - 실험 / 상태 당 5 100mm 요리는 충분한 단백질 복구를 보장합니다.
    주 : 판의 개수는 관심있는 단백질 복합체의 발현 수준과 용해도에 의존하는 각 실험 / 조건에 대해 결정되어야한다. 대규모의 정제가 필요한 경우에는 세포주 스피너 플라스크이 현탁액에서 성장하도록 적응 될 수 있지만,이 방법은 일시적 형질 감염을 위해 작동하지 않을 것이다.

2. 안정 세포주를 세포 형질 감염 또는 유도

  1. 다음 날, 현미경으로 세포를 확인합니다. proce을하기 전에 80 % 합류 - 세포는 70해야합니다대한 수정 사항.
  2. 100mm의 접시 당 형질 감염 시약 7 플라스미드 DNA의 μg의 21 μl의 총 혼합물로 세포를 형질 감염. 형질 감염 효율에 대한 제어는 벡터 표현 GFP (표 1)과 함께 형질 감염 세포.
    주 : 독시사이클린 14, 15에 대응하여 두 개 이상의 복잡한 소단위의 발현을 유도 HEK293-T-REX 또는 유사한 안정한 세포주를 사용하는 경우, 유도제는 세포에 첨가하고 48 시간 동안 배양되어야 할 것이다. 마찬가지로, 유도제의 첨가에 따라 GFP의 발현을 유도하는 안정한 세포 라인은 또한 검증을 위해 요구된다. 2.7 단계로 진행합니다.
  3. 100mm 접시 당 형질 전환 혼합물을 준비합니다. 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (둘 이상의 플라스미드에 상당)의 총 플라스미드 DNA 7 μg의로 비추 DMEM 500 μL를 혼합한다. 별도의 microcentrifuge 관에서 비추 DMEM 위스콘신의 500 μl를 혼합트랜 시약의 제 21 μL. 각 형질 전환 반응에 대해 반복합니다.
  4. 플라스미드 DNA 용액으로 형질 감염 시약 용액을 피펫 (역순으로 용액을 혼합하지 않음). 적어도 4 회 피펫 팅하여 혼합한다.
  5. 10 시간 동안 실온에서 혼합물을 부화하지 - 15 분, 그러나 더 이상 15 분 이상.
  6. 미디어 저장소를 생성하고 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 판의 내부면에 드롭 현명 형질 전환 혼합물을 피펫 할 수있는 판을 기울입니다. 원래 평평한 위치에 접시를 반환하고, 혼합물을 배포하는 부드럽게 소용돌이 친다.
  7. (이 조건은 이하 "조직 배양 인큐베이터"라 함), 5 % CO 2 습윤 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션. 미디어 5 시간 후 형질 전환 (옵션) 장착합니다.

3. 검사의 형질 또는 유도 효율

  1. 24 시간 후 형질에서, 독감에서 세포를 시각화orescent 현미경은 형질 전환 효율 (또는 GFP를 발현 제어 HEK293T 렉스 안정적인 세포주의 유도)를 확인합니다. 또 다른 24 시간 동안 품어.

4. STREP 선호도 정화 (STREP AP)

  1. 세포를 수집
    1. 48 시간 포스트 형질에서 미디어를 제거하고 차가운 1X 인산 완충 식염수 (PBS)의 8 ml를 추가합니다. 접시에서 세포를 분리 아래로 피펫합니다.
    2. 수집하고, 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 4 ℃에서 4 분 동안 800 XG에서 세포를 스핀 다운.
    3. PBS를 상층 액을 제거합니다. 잔여 PBS를 제거하기 (4 ℃에서 1 분 동안 800 XG)를 스핀을 반복합니다. 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장 또는 단백질 정제를 계속하려면 다음 절차를 따르십시오.
  2. 세포를 용균
    1. 패시브 용해 완충액을 세포 펠렛 부피 × 5를 사용하여 세포 펠릿 (~ 플레이트 당 250 μL)에 재현 탁(PLB : 20 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 프로테아제 억제제 칵테일 정제, 5 % V / V 글리세롤, 1.0 % NP-40) 및에 세포 현탁액을 전송 1.5 ml의 microcentrifuge 관.
    2. 간단히 4 ° C에서 30 분 동안 정지 및 nutate을 소용돌이.
    3. 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 XG에서 세포 현탁액을 스핀.
    4. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 용해 용 해물을 전송하고 세포 펠렛을 폐기합니다. 같은 수용성 해물의 최종 부피의 10 % 할인 "연쇄상 구균 AP 입력." 4 ℃에서 보관하십시오.
  3. 연쇄상 구균 구슬을 평형화
    참고 : 첫 번째 AP 단계에 대한 사용 STREP 구슬! 연쇄상 구균 구슬 FLAG 구슬 아래로 끌어 것보다 훨씬 더 많은 단백질을 복구와 단지 아래로 당겼다.
    1. 꺼내 (n은 40 μl를 ×) + n은 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 μL (N = 샘플 수), 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
      참고 : 넓은 m를 사용하여피펫 구슬에 outhed 팁.
    2. 상층 액을 제거하고 구슬에 PLB의 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 구슬 혼합물을 Nutate. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
      1. 3 세척 총 반복합니다. 40 μL × N의 최종 부피로 PLB의 비드를 재현 탁.
    3. 4 ° C에서 2 시간 동안 각각의 세포 용 해물 샘플 및 nutate 50 % 연쇄상 구균 비드 슬러리의 40 μl를 추가합니다.
  4. STREP AP
    1. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 솔루션을 스핀 다운.
    2. 4 ° C에서 "STREP AP 플로우를 통해 (FT)"로 뜨는 및 저장소를 제거합니다.
    3. I (20 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 250 mM의 염화나트륨, 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 1 mM의 DTT, 5 % 글리세롤 및 0.2 % NP-40) STREP AP 세척 버퍼 구슬에 500 μl를 추가합니다. 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에서 5 4 ° C에서 분 원심 분리기의 구슬 혼합물을 Nutate. 상층 액을 버린다.
      1. 네 세척의 총 반복합니다.
        주 : 네번째 세척 전에 단백질 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다.
    4. 500 μL 세척 버퍼 II (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA)를 추가하고 튜브를 반전 구슬을 평형. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다.
    5. STREP 용출 버퍼 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 2.5 mM의 Desthiobiotin)의 50 μL과 관심의 단백질을 용출. 4 ℃에서 15 분 동안 800 rpm에서 소용돌이.
    6. 4 ° C에서 1 분 동안 1,500 XG에서 구슬을 스핀 다운. 상층 액을 수집합니다. 이 부분은 "STREP AP 용출"샘플에 해당합니다.
    7. 제 1 용출 얻어진 단백질의 양의 절반까지 얻을 수있는 초 용출, 4 ° C에서의 비드 부분을 저장한다. 실버 염색 및 / 또는 웨스턴 블로 팅에 대한 STREP AP 용출의 나누어지는 10 %16.
  5. 국기 구슬을 평형화
    1. (NX 16 μL) + n은 FLAG 비즈 솔루션의 μL (샘플 N = 번호)를 꺼내 4 ℃에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운.
      참고 : 피펫 구슬에 입이 큰 팁을 사용합니다.
    2. 상층 액을 제거하고 FLAG 세척 버퍼 500 μL를 추가 (100 mM 트리스 - 염산의 pH 8.0, 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.1 % NP-40) 구슬에. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 스핀 다운. 3 세척 총 반복합니다.
    3. NX 16 μL의 최종 부피 FLAG 세척 완충액으로 비드를 재현 탁.
    4. 4 ° C에서 나머지 STREP AP 용출 및 nutate 하룻밤에 FLAG 비드 슬러리의 16 μl를 추가합니다.

5. FLAG IP

  1. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 플래그 구슬 서스펜션을 스핀. 4 ° C에서 "FLAG IP 플로우를 통해"(FT)으로 뜨는 및 저장소를 저장합니다.
  2. 500 추가(81); 솔루션에 FLAG 세척 버퍼의 리터. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에 5 4 ° C에서 분 원심 분리기에 대한 Nutate. 네 세척의 총 반복하고 각 세척 한 후 상층 액을 제거합니다.
    주 : 네번째 세척 전에 배경을 감소시키는 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 단백질로 비드 용액 옮긴다. 이 단계는 필수적이다.
  3. 마지막 스핀에서 뜨는을 제거하고 구슬로 FLAG 펩타이드의 200 NG / μl를 포함 FLAG 세척 버퍼의 30 μL를 추가합니다. 4 ℃에서 2 시간 동안 800 rpm에서 소용돌이.
  4. 4 ° C에서 2 분 동안 1,500 XG에서 정지를 스핀 다운. 으로 4 ° C에서 뜨는 및 저장소를 수확 "FLAG IP 용출."
    참고 : 용출 샘플 표준 프로토콜 16을 사용하여 실버 얼룩 및 / 또는 웨스턴 블롯으로 확인하고, 또한 단백질 분석을위한 준비가 될 수있다. (1) STREP AP 입력, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Eluti : 웨스턴 블롯을 설정할 때, 다음의 모든 샘플을 실행(4) FLAG IP FT, (5) FLAG IP 용출에. 로드 볼륨은 각 실험에 대해 결정되어야 할 것이다. 수집 된 모든 샘플과 비드 단기 기억과 장기 보존 -80 ° C에서 39 ° C에서 저장 될 수있다. TAP 샘플들은, 그 구성 요소의 신원을 확인하는 신규 번역 후 변형 (PTMS)를 식별 및 / 또는 정제 착체 2 (17)와 임의의 신규 단백질 상호 작용을 발견 질량 분석법에 의해 분석 될 수있다. 이러한 목적하는 쿠마 겔 또는은 염색을 실행 한 후, 밴드 깨끗한 메스를 사용하여 겔로부터 절제 될 수있다. 질량 분석 방법을 논의 몇 가지 우수한 리뷰 이전에, 19 (18)을 발표했다.

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결과

이 글에서, 우리는 (또한 P-TEFb 키나제라고도 함) 복잡한 잘 특징 CycT1-경우, Cdk9에 TAP 방법의 적용 가능성을 보여줍니다.

그리고 경우, Cdk9-FLAG (경우, Cdk9 : F), 또는 경우, Cdk9-STREP (경우, Cdk9 : S) 및 시클 T1-FLAG (CycT1 : F) : 시클 T1-STREP (S CycT1) 인코딩하는 플라스미드 (표 1), HEK293T 세포로 형질 감염시켰다 . F 또는 CycT1 :

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토론

발현 및 진핵 세포에서 단백질 복합체의 분리를 위해 여기에 설명 된 프로토콜은 분자 어셈블리의 생화학 적 특성에 한정되지 않고, 그 기능을 조절할 수있는 신규 인터랙 번역 후 변형의 식별에 이용 될 수있다. 친 화성 태그의 활용은이 프로토콜에서 언급 한 내용에 제한되지 않는다; 그러나 우리의 경험은 제 AP 단계로 STREP을 사용하여 상당히 최종 단백질 - 단백질 복합체의 수율을 향상하는 것...

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

Research reported in this publication was supported by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the NIH under award number R01AI114362 and Welch Foundation grant I-1782 to Iván D'Orso.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GE Healthcare Life Sciences/HycloneSH3002.2FS
Fetal bovine serumGE Healthcare Life Sciences/HycloneSH30071
Penicillin/StreptomycinMP BiomedicalsMP091670049
PolyJetSignaGen LaboratoriesSL100688
Protease inhibitor cocktail Roche 11836153001
STREP-Tactin SuperflowIBA Lifesciences2-1208-010
STREP-tag elution bufferIBA Lifesciences2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichF2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeveCorning 430167
Protein Lo-Bind EppendorfEppendorf022431081
Digital Vortex MixerFisher Scientific 02-215-370
48 hole micro tube foam rackFisher Scientific02-215-386
Labquake shaker rotisserie Thermo 415110

참고문헌

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