טיהור טנדם זיקה של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים

Summary

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Abstract

טיהור חלבונים פעילים ומכלולים חומצות גרעין חלבון חיוני לאפיון של פעילות אנזימטית ו דה נובו זיהוי של יחידות משנה רומן שלאחר translational שינויים. מערכות בקטריאלי לאפשר ביטוי וטיהור של מגוון רחב של פוליפפטידים יחיד קומפלקסי חלבונים. עם זאת, מערכת זו אינה מאפשרת טיהור של יחידות משנה חלבון המכילים שלאחר translational שינויים (למשל, זירחון acetylation), ואת ההזדהות של יחידות משנה הרגולציה רומן כי הם רק בהווה / הביעו במערכת איקריוטיים. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של רומן, חזק, וטיהור זיקת טנדם יעילה (TAP) שיטה באמצעות STREP- וחלבונים מתויג FLAG המאפשר הטיהור של קומפלקסי חלבונים עם זמני או ביציבות הביע-tagged חלבוני epitope מתאי איקריוטיים. ניתן ליישם פרוטוקול זה לאפיין protein פונקציונליות מורכבות, לגלות שלאחר translational שינויים על יחידות משנה מורכבות, ולזהות רכיבים מורכבים רגולטוריות רומן על ידי ספקטרומטריית מסה. יש לציין, שיטת TAP זה ניתן להחיל ללמוד קומפלקסי חלבונים שהוקמו על ידי איקריוטיים או פתוגניים (נגיפיים וחיידקיים) רכיבים, ובכך מניב מגוון רחב של הזדמנויות ניסיון במורד זרם. אנו מציעים כי חוקרי עובדים עם קומפלקסי חלבונים יכולים לנצל גישה זו בדרכים רבות ושונות.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs) הן קריטיות להסדרה המדויקת של תהליכים ביולוגיים ^1, ומחקרים נוספים על PPIs אלה יכולים להודיע על תפקידם ^2. גישות כמה כבר המציאו לחקר ואפיון של PPI כמו גם לזיהוי דה נובו של רכיבי חלבון הרגולציה הרומן. בשנת 1989, סטנלי פילדס ועמיתיו דיווחו על השנייה היברידי השמרים (Y2H) assay ^3. גישה זו מאפשרת זיהוי המשוחדת ומקיפה של interactors (פושט) עבור חלבון מוגדר של עניין (פיתיון) ב שמר אפייה. בנוסף השירות המדהים שלה לגילוי PPIs, assay Y2H יכול לשמש לאפיון זוגות חלבון בתאי שמרים, הגדרה מינימאלי תחומי אינטראקציה, וזיהוי מוטציות לבטל אינטראקציות כאלה. על ידי שינוי assay Y2H, PPIs יכול להיות גם למד בתאי יונקיםclass = "Xref"> 4. וריאציות של assay Y2H (למשל, מערכת תלת-היברידית שמרים) יכול להיות מיושם גם ללמוד חלבון-רנ"א אינטראקציות ליגנד אורגני-קטן חלבונים בתאים.

כלי נוסף נפוץ ללמוד PPIs במערכת הומולוגית הוא immunoprecipitation שיתוף (שיתוף IP) assay ^5. באמצעות נוגדן כדי immunoprecipitate חלבון של עניין, assay שיתוף IP מאפשר לחוקרים לעקוב אחר PPIs בתאים עבור תנאים סביבתיים שונים ומצבים ניסיוניים. השימוש-tagged חלבונים epitope (למשל, דגל, Myc, סטרפטוקוקוס, ו HA, בין היתר) טיהור זיקה (AP) שיטות יש להקל את הבידוד של חלבונים מתערובות חלבון מורכב במשך כמה מבחני במורד הזרם, כולל כתם המערבי, כתם כסף , וניתוח האנזימטית. עם זאת, אף אחד הגישות הקודמות אלה מאפשרים הבידוד של כמויות גדולות של קומפלקסי חלבונים עבור אפיון נוסף כולל במבחנהssays, גילוי יחידות משנת רגולציה על ידי ספקטרומטריית מסה, וזיהוי שלאחר translational שינויים. גרסה משופרת של שיטת AP נקראת טנדם AP (TAP), שהיא טכניקת טיהור ללימוד PPIs על ידי יצירת חלבון היתוך עם שני אפיטופים כי הוא מטוהר באמצעות שתי נקודות גישה עוקבות ^{6, 7.} במאמר זה, אנו מציגים וריאציה של שיטת TAP עבור קומפלקסי חלבוני טיהור שבו שתי תת יחידות מתויגות עם אפיטופים שונים וטהרו מכן דרך שתי נקודות גישה סדרתית (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAG IP). אנחנו ראשונים לספק סקירה מינימליסטי של TAP (איור 1) ולאחר מכן תיאור מפורט של כל שלבי הניסוי (איור 2), כך חוקרים יכולים ליישם אותם על מורכבות עניין החלבון שלהם.

כדי להדגים את תחולתה של שיטת TAP, בחרנו היטב מאופיין cyclin-CDK מורכב (המכונה PTEFB קינאז), אשר מורכב של T1 cyclin למקטע רגולטוריות (CycT1) ו קינאז (CDK9), והוא מעורב בוויסות שעתוק על ידי RNA פולימראז II (Pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb phosphorylates תחום מסוף-C של Pol II וגורם ההתארכות השלילית הקשורות אליו, ובכך יקל שהשהיה תעתיק בבית האמרגן ובכך מקלת התארכות שעתוק ^{11, 12, 13.} עם אינטראקציה ידועה זה בחשבון, סטרפטוקוקוס-מתויג CycT1 ו CDK9 מתויג FLAG היה מעל לידי ביטוי בתאי HEK293T. ניסוי TAP גומלין בוצע עם FLAG-מתויג CDK9 ו מתויג סטרפטוקוקוס CycT1 לאמת נוסף שאינטראקצית החלבון היא עצמאית של אפיטופים מנוצלים. תאים נאספו lysed 48 transfection שעות שלאחר. את lysate המסיס היה מטוהר על ידי TAP (סטרפטוקוקוס AP ואחריו FLAGIP). קלט חלבונים מטוהרים נותחו על ידי כתם המערבי כתם כסף (איור 3).

Protocol

1. תאי ציפוי

1. יום אחד לפני transfection, צלחת 3.5 x 10 ⁶ תאים HEK293T ב 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% (v / v) בסרום שור עוברית (FBS) ו -1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יח '/ מ"ל ​​המניות) לכל צלחת 100 מ"מ. פלייט 3 - 5 100 מנות מ"מ לכל ניסוי / מצב כדי להבטיח התאוששות מספיק חלבון.
   הערה: מספר הצלחות יש לקבוע עבור כל ניסוי / מצב, אשר יסתמך על רמות הביטוי המסיס של מתחם החלבון של עניין. לחלופין, אם טיהור בקנה מידה גדול יותר יש צורך, שורות תאים ניתן להתאים לגדול השעיות צלוחיות טווה ^2, אך שיטה זו לא תעבוד עבור transfections חולף.

2. Transfecting תאים או גרימת שורות תאים יציבות

1. למחרת, לבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ. התאים חייבים להיות 70 - 80% ומחוברות לפני proceeding.
2. Transfect התאים עם תערובת הכוללת 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד ו -21 μl של מגיב transfection לכל צלחת 100 מ"מ. תאים Transfect עם GFP להביע וקטור (טבלה 1) כביקורת על יעילות transfection.
   הערה: אם אתה משתמש HEK293-T-Rex או שורת תאים יציבה דומה התופעה אשר עלול לגרום הביטוי של שתיים או יותר מורכבי יחידות משנה בתגובת דוקסיציקלין ^{14, 15,} inducer יצטרך להתווסף התאים וטופח במשך 48 שעות. בדומה לכך, שורת תאים יציבה תופעה אשר עלולה לגרום ביטוי GFP על תוספת של inducer יהיה דרוש גם ולאמת אותם. עבור לשלב 2.7.
3. מכינים את תערובת transfection לכל צלחת 100 מ"מ. בתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge, לערבב 500 μl של DMEM unsupplemented עם 7 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד הכולל (המקביל ל שניים או יותר פלסמידים). בתוך צינור microcentrifuge נפרד, לערבב 500 μl של wi unsupplemented DMEM21 μl ה של מגיב transfection. חזור על הפעולה עבור כל תגובה transfection.
4. פיפטה הפתרון מגיב transfection לתוך פתרון ה- DNA פלסמיד (לא לערבב פתרונות בסדר הפוך). מערבבים על ידי pipetting לפחות 4 פעמים.
5. דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 - 15 דקות, אך לא יותר מ 15 דקות.
6. הטה את הצלחת ליצור מאגר תקשורת ובזהירות פיפטה תערובת transfection ירידה מבחינת על הצד הפנימי של הצלחת מבלי להפריע את התאים. מחזירים את המנה למצב שטוח המקורי ו מערבולת בעדינות כדי לפזר את התערובת.
7. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאי humidified עם ₂ 5% CO (תנאי זה להלן המכונה "חממה בתרבית רקמה"). החזר את שלאחר transfection hr תקשורת 5 (אופציונאלי).

3. Transfection סימון או יעילות אינדוקציה

1. בגיל 24 שעות שלאחר transfection, לדמיין את התאים תחת שפעתמיקרוסקופ orescent כדי לבדוק יעילות transfection (או אינדוקציה של שורת תאים יציבים השליטה HEK293T-REX להביע GFP). דגירה של 24 שעות אחרות.

4. סטרפטוקוקוס טיהור זיקה (סטרפטוקוקוס AP)

1. איסוף התאים
   1. בשעה 48 שעות שלאחר transfection, להסיר את המדיה ולהוסיף 8 מ"ל של 1x קר פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). פיפטה מעלה ומטה כדי לנתק תאים מהצלחת.
   2. אסוף ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 15 מ"ל ומסובב את התאים למטה ב 800 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C.
   3. הסר את supernatant PBS. חזור על ספין למטה (800 XG דקות 1 ב 4 ° C) כדי לחסל כל PBS שיורית. אחסן את התא גלולה ב -80 ° C לשימוש עתידי או פעל לפי הנוהל שלהלן כדי להמשיך טיהור חלבונים.
2. Lysing התאים
   1. Resuspend את כדורי התא באמצעות 5 × נפח תא גלולה (~ 250 μl לכל צלחת) של הצפת תמוגה פסיבי(PLB: 20 mM Tris-HCl 7.5 pH, 150 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ ₂ MgCl, 1 מ"מ DTT, לוח קוקטייל מעכב פרוטאז, 5% v / גליצרול נ, ו -1.0% NP-40) ולהעביר את ההשעיה התא 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge.
   2. בקצרה מערבולת ההשעיה nutate למשך 30 דקות ב 4 ° C.
   3. ספין למטה השעית תא XG 10,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   4. מעביר את lysates המסיס לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש וזורק כדורי התא. חסוך 10% של הנפח הסופי של lysate המסיס כמו "קלט AP סטרפטוקוקוס." חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. Equilibrating חרוזי סטרפטוקוקוס
   הערה: השתמש סטרפטוקוקוס חרוזים עבור שלב AP הראשון! המכלולים הורידו עם חרוזי סטרפטוקוקוס לשחזר חלבון גבוה יותר מאשר אלו משכו מטה עם חרוזי FLAG.
   1. להוציא (n × 40 μl) + n μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
      הערה: השתמש רחב-מ 'טיפים outhed חרוזים פיפטה.
   2. הסר את supernatant ולהוסיף 500 μl של PLB על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C.
      1. חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף. Resuspend את החרוזים PLB לנפח סופי של n × 40 μl.
   3. הוסף 40 μl של slurry חרוז 50% סטרפטוקוקוס לטעום כל lysate התא nutate עבור שעה 2 ב 4 ° C.
4. סטרפטוקוקוס AP
   1. ספין למטה פתרון ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ג.
   2. הסר את supernatant וחנות בשם "סטרפטוקוקוס AP זרימת הדרך (FT)" על 4 מעלות צלזיוס.
   3. הוסף 500 μl של סטרפטוקוקוס AP הצפת לשטוף לי (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 מ"מ NaCl, 1.5 מ"מ ₂ MgCl, 1 מ"מ DTT, גליצרול 5% ו -0.2% NP-40) על חרוזים. Nutate התערובת חרוזים במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °. בטל supernatant.
      1. חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף.
         הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את הפתרון החרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את רקע החלבון. צעד זה חיוני.
   4. הוסף 500 μl לשטוף הצפת השנייה (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, ו 1 mM EDTA) לאזן את החרוזים על ידי היפוך הצינורות. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
   5. Elute החלבון של עניין עם 50 μl של סטרפטוקוקוס הצפת elution (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -2.5 מ"מ Desthiobiotin). וורטקס ב 800 סל"ד במשך 15 דקות ב 4 °.
   6. ספין למטה חרוזים ב 1500 XG במשך 1 דקות ב 4 ° C. איסוף supernatant. חלק זה תואם המדגם "סטרפטוקוקוס AP Elution".
   7. שמור את החלק יחסי חרוז על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופת elution שני, אשר יכול להניב עד מחצית כמות החלבון שהושגה עם elution הראשון. Aliquot 10% של סטרפטוקוקוס AP Elution עבור צביעת כסף ו / או המערבי סופג^16.
5. Equilibrating חרוזי FLAG
   1. להוציא (NX 16 μl) + n μl של פתרון חרוזים FLAG (n = מספר דגימות) ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 °.
      הערה: השתמש בעצות פעורות פה חרוז פיפטה.
   2. הסר את supernatant ולהוסיף 500 μL של חיץ לשטוף FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.1% NP-40) על חרוזים. ספין למטה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 3 שוטף.
   3. Resuspend את החרוזים חיץ לשטוף FLAG לנפח סופי של μl 16 NX.
   4. להוסיף 16 μl של slurry חרוז הדגל elution סטרפטוקוקוס AP הנותרים ולינה nutate על 4 מעלות צלזיוס.

5. FLAG IP

1. ספין למטה השעית חרוזי FLAG ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant וחנות בשם "הדגל IP הזרימה דרך" (FT) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
2. הוספת 50081; l של חיץ FLAG לשטוף לפתרון. Nutate במשך 5 דקות ב 4 ° C ו צנטריפוגות ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. חזור עבור סכום כולל של 4 שוטף ולהסיר את supernatant לאחר כל שטיפה.
   הערה: לפני בכביסה הרביעית, להעביר את פתרון חלבון-חרוז לצינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge חדש כדי להפחית את הרקע. צעד זה חיוני.
3. הסר את supernatant מן הסיבוב האחרון ולהוסיף 30 μL של חיץ לשטוף FLAG המכיל 200 ng / μl של פפטיד FLAG לתוך חרוזים. וורטקס ב 800 סל"ד במשך שעה 2 ב 4 ° C..
4. ספין למטה ההשעיה ב 1500 XG במשך 2 דקות ב 4 ° C. קציר supernatant וחנות ב 4 ° C כמו "FLAG IP Elution."
   הערה: דגימות elution יכולות להיות מאושרות על ידי כתם כסף ו / או כתם מערבי באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ^16, והם מוכנים מבחני חלבון נוספים. בעת הגדרת כתם מערבי, להפעיל את כל הדגימות הבאות: (1) קלט AP סטרפטוקוקוס, (2) סטרפטוקוקוס AP FT, (3) סטרפטוקוקוס AP Elutiעל, (4) דגל IP FT, ו (5) דגל IP Elution. כרכים הטעונים יצטרכו להיקבע עבור כל ניסוי. כל הדגימות וחרוזים שנאספו ניתן לאחסן ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר ב -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. דגימות TAP יכולות להיות מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה כדי לאמת את הזהות ומרכיביהן, לזהות שינויים שלאחר translational רומן (PTMs), ו / או לגלות כל אינטראקצית חלבון רומן עם המורכבות המטוהרות ^{2, 17.} לשם כך, אחרי ריצת כתם ג'ל או כסף coomassie, להקות ניתן ניכרו מן ג'ל באמצעות אזמל נקי. ביקורות מצוינות כמה דנים בשיטות ספקטרומטריית מסה פורסמו בעבר ^{18, 19.}

תוצאות

במאמר זה, אנחנו מדגימים את תחולתה של שיטת TAP למתחם CycT1-CDK9 היטב מאופיין (הידוע גם בשם קינאז P-TEFb).

פלסמידים קידוד Cyclin T1-סטרפטוקוקוס (CycT1: S) ו-FLAG CDK9 (CDK9: F), או CDK9-סטרפטוקוקוס (CDK9: S) ו Cyclin T1-FLAG (CycT1: F) (טב...

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן לביטוי והבידוד של קומפלקסי חלבונים מתאים איקריוטיים אינו מוגבל באפיון ביוכימי של מכלולים מולקולריים כזה, אבל יכול גם להיות מנוצל לצורך זיהוי של interactors רומן שלאחר translational שינויים שיכולים לווסת את תפקידם. הניצול של תגי קרבה אינו מוגבל למה מוזכר בפ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag elution buffer	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
48 hole micro tube foam rack	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake shaker rotisserie	Thermo	415110