Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Riepilogo

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Abstract

La purificazione della proteina-proteina attiva e complessi acido nucleico-proteina è cruciale per la caratterizzazione delle attività enzimatiche e de novo identificazione di nuovi subunità e modificazioni post-traduzionali. sistemi batterici permettono l'espressione e la purificazione di una grande varietà di singoli polipeptidi e proteine ​​complessi. Tuttavia, questo sistema non consente la purificazione di subunità proteiche che contengono modificazioni post-traduzionali (ad esempio, fosforilazione e acetilazione), e l'identificazione di nuovi subunità regolatorie che sono presenti solo / espressi nel sistema eucariotico. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un romanzo, robusto, ed efficiente metodo di purificazione tandem affinità (TAP) utilizzando STREP- e le proteine ​​FLAG-tag che facilita la purificazione di complessi proteici con transitoriamente o stabilmente espresso proteine ​​epitopi-tag da cellule eucariotiche. Questo protocollo può essere applicata per caratterizzare protEin funzionalità complesse, alla scoperta di modificazioni post-traduzionali su subunità complesse, e per identificare nuovi componenti complessi normativi mediante spettrometria di massa. In particolare, questo metodo TAP può essere applicato per studiare complessi proteici formati da componenti eucariotiche o patogeni (virali e batteriche), ottenendo così una vasta gamma di possibilità sperimentali valle. Proponiamo che i ricercatori che lavorano con i complessi proteici potrebbero utilizzare questo approccio in molti modi diversi.

Introduzione

Interazioni proteina-proteina (PPI) sono fondamentali per la precisa regolazione dei processi biologici ^1, e ulteriori studi su questi inibitori della pompa protonica può dare informazioni relative la loro funzione ^2. Diversi approcci sono stati ideati per lo studio e la caratterizzazione di IPP e per l'identificazione de novo di nuove componenti proteici normativi. Nel 1989, Stanley Campi e colleghi hanno riportato il lievito doppio ibrido (Y2H) test ^3. Questo approccio consente l'identificazione imparziale e completa di interattori (prede) per una proteina definito di interesse (esche) in Saccharomyces cerevisiae. Oltre alla sua notevole utilità per scoprire IPP, il saggio Y2H può essere utilizzato per caratterizzare coppie di proteine ​​in cellule di lievito, definendo domini interagenti minime, e identificare mutazioni che aboliscono tali interazioni. Modificando il test Y2H, inibitori della pompa protonica può anche essere studiata in cellule di mammiferoclass = "xref"> 4. Variazioni del dosaggio Y2H (ad esempio, il sistema di lievito tre ibrido) possono essere applicate anche a studiare proteina-RNA e proteina-piccola interazioni legante organico nelle cellule.

Un altro strumento comunemente utilizzato per studiare PPI in un sistema omologo è il test ⁵ co-immunoprecipitazione (co-IP). Utilizzando un anticorpo per immunoprecipitare una proteina di interesse, il test di co-IP permette ai ricercatori di monitorare PPI nelle celle per diverse condizioni ambientali e situazioni sperimentali. L'uso di proteine epitopi-tag (ad esempio, la bandiera, Myc, STREP, e HA, tra gli altri) in purificazione di affinità (AP) metodi ha facilitato l'isolamento di proteine da miscele complesse di proteine per diversi saggi a valle, tra cui Western Blot, macchia d'argento , e l'analisi enzimatica. Tuttavia, nessuno di questi approcci precedenti consentire l'isolamento di grandi quantità di complessi proteici per un'ulteriore caratterizzazione compreso in vitro unssays, scoperta di subunità regolatorie mediante spettrometria di massa, e l'identificazione di modificazioni post-traslazionali. Una versione migliorata del metodo AP viene chiamato Tandem AP (TAP), che è una tecnica di purificazione per studiare IPP creando una proteina di fusione con due epitopi che viene purificato mediante due AP successive ^{6, 7.} In questo articolo, vi presentiamo una variante del metodo TAP per purificare complessi proteici in cui due subunità sono contrassegnati con diversi epitopi e poi purificato attraverso due punti di accesso sequenziali (STREP AP seguiti da FLAG IP). In primo luogo abbiamo a disposizione una panoramica minimalista di TAP (figura 1) e poi una descrizione dettagliata di tutte le fasi sperimentali (figura 2), in modo che i ricercatori li possono applicare alla loro complesso proteina di interesse.

Per dimostrare l'applicabilità del metodo di TAP, abbiamo scelto un ben caratterizzato ciclina-CDK complesso (di seguito PTEFB chinasi), che è composto della ciclina T1 subunità regolatrice (CycT1) e una chinasi (CDK9), ed è coinvolto nella regolazione della trascrizione di RNA polimerasi II (Pol II) ^{8, 9, 10.} P-TEFb fosforila il dominio C-terminale di Pol II e dei suoi fattori di allungamento negativi associati, che allevia la pausa trascrizionale al promotore e facilita in tal modo la trascrizione allungamento ^{11, 12, 13.} Con questa interazione conosciuta in mente, STREP-tag CycT1 e CDK9 FLAG-tag sono stati oltre espresso in cellule HEK293T. Un esperimento TAP reciproca è stata eseguita con CDK9 STREP-tag e FLAG-tagged CycT1 per convalidare ulteriormente che l'interazione proteina è indipendente dalle epitopi utilizzati. Le cellule sono state raccolte e lisate 48 ore dopo la trasfezione. Il lisato solubile è stato purificato dalla TAP (STREP AP seguito da FLAGIP). Input e proteine purificate sono state analizzate mediante western blot e macchia d'argento (Figura 3).

Protocollo

1. Cellule placcatura

1. Un giorno prima della trasfezione, piastra di 3,5 x 10 ⁶ cellule HEK293T in 10 mL di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino (FBS) e 1% (v / v) di penicillina / streptomicina (10.000 U / ml magazzino) per ogni piatto a 100 mm. Tavola 3 - 5 100 piatti mm per esperimento / condizione per garantire il recupero di proteine ​​sufficiente.
   NOTA: Il numero di lastre deve essere determinato per ogni esperimento / condizione, che si baserà sui livelli di espressione e la solubilità del complesso proteina di interesse. In alternativa, se è necessaria la purificazione scala ingrandita, linee cellulari possono essere adattati a crescere in sospensione in fiaschi filatore ^2, ma questo metodo non funziona per trasfezioni transitorie.

2. transfecting cellule o indurre linee cellulari stabili

1. Il giorno seguente, controllare le cellule sotto il microscopio. Le cellule devono essere 70 - 80% confluenti prima proceEding.
2. Trasfezione delle cellule con una miscela totale di 7 mg di DNA plasmidico e 21 ml di reagente per trasfezione piatto a 100 mm. Cellule trasfezione con un vettore che esprime GFP (Tabella 1) come controllo per l'efficienza di trasfezione.
   NOTA: Se si utilizza un HEK293-T-Rex o simile linea cellulare stabile che induce l'espressione di due o più complessi subunità in risposta alla doxiciclina ^{14, 15,} l'induttore dovrà essere aggiunto alle cellule e incubate per 48 ore. Analogamente, una linea cellulare stabile che induce l'espressione di GFP dopo l'aggiunta del induttore sarebbe necessaria anche per scopi di convalida. Passare al punto 2.7.
3. Preparare la miscela di trasfezione per ogni piatto a 100 mm. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, miscelare 500 ml di DMEM senza supplementi con 7 mg di DNA plasmidico totale (corrispondente a due o più plasmidi). In una provetta separata, mescolare 500 ml di DMEM senza supplementi with 21 ml di reagente di trasfezione. Ripetere l'operazione per ogni reazione trasfezione.
4. Pipetta la soluzione di trasfezione del reagente nella soluzione plasmide DNA (non mescolare soluzioni in ordine inverso). Mescolare pipettando almeno 4 volte.
5. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 - 15 min, ma non più di 15 min.
6. La piastra per creare un serbatoio media e accuratamente pipetta la miscela di trasfezione goccia a goccia sul lato interno della piastra senza disturbare le cellule. Riportare il piatto nella posizione piatta originale e miscelare delicatamente per distribuire il composto.
7. Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato coltura cellulare con 5% di CO ₂ (questa condizione è seguito indicato come "coltura tissutale incubatore"). Sostituire i media 5 ore dopo la trasfezione (opzionale).

3. Controllo Transfection o induzione efficienza

1. A 24 ore dopo la trasfezione, visualizzare le cellule in una influenzaMicroscopio orescent per verificare l'efficienza di trasfezione (o induzione di controllo HEK293T-Rex linea cellulare stabile che esprimono GFP). Incubare per altre 24 ore.

4. STREP Affinity Purification (STREP AP)

1. Raccogliere le cellule
   1. A 48 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto e aggiungere 8 ml di soluzione fisiologica fredda 1x tampone fosfato (PBS). Pipettare su e giù per staccare le cellule dalla piastra.
   2. Raccogliere e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e girare le celle in basso a 800 xg per 4 minuti a 4 ° C.
   3. Rimuovere il surnatante PBS. Ripetere la rotazione verso il basso (800 xg per 1 min a 4 ° C) per eliminare eventuali residui di PBS. Conservare il pellet a -80 ° C per un uso futuro o seguire la procedura qui sotto per continuare purificazione della proteina.
2. Lisi delle cellule
   1. Risospendere il pellet di cellule utilizzando 5 × volume pellet cellulare (~ 250 microlitri per piastra) di Passive Lysis Buffer(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl _2, 1 mM DTT, proteasi tablet inibitore cocktail, 5% v / v di glicerolo, e 1,0% NP-40) e trasferire la sospensione cellulare in un 1,5 ml provetta.
   2. Brevemente vortice sospensione e nutate per 30 minuti a 4 ° C.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C.
   4. Trasferire i lisati solubili in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il pellet di cellule. Risparmi 10% del volume finale del lisato solubile "STREP AP Input." Conservare a 4 ° C.
3. Equilibrando le perline STREP
   NOTA: Utilizzare STREP perline per il primo passo di AP! Complessi tirato giù con perline STREP recuperare significativamente più proteine ​​di quelle abbattute con perline FLAG.
   1. Estrarre (n × 40 ml) + n ml di STREP tallone slurry 50% (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
      NOTA: utilizzare in tutto il mpunte outhed a perline pipetta.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di PLB ai talloni. Nutate la miscela perline per 5 minuti a 4 ° C. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
      1. Ripetere per un totale di 3 lavaggi. Risospendere le sfere in PLB ad un volume finale di n × 40 microlitri.
   3. Aggiungere 40 ml di 50% STREP tallone slurry per ogni campione lisato cellulare e nutate per 2 ore a 4 ° C.
4. STREP AP
   1. Spin down soluzione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
   2. Rimuovere il surnatante e conservare come "STREP AP flusso-through (FT)" a 4 ° C.
   3. Aggiungere 500 pl di STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl _2, 1 mM DTT, 5% glicerolo e 0,2% NP-40) ai talloni. Nutate la miscela perline per 5 minuti a 4 ° C e centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante.
      1. Ripetere per un totale di 4 lavaggi.
         NOTA: Prima quarto lavaggio, trasferire la soluzione perline in una nuova provetta da 1,5 ml ridurre lo sfondo proteine. Questo passaggio è fondamentale.
   4. Aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, e 1 mM EDTA) ed equilibrare le perline invertendo i tubi. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
   5. Eluire la proteina di interesse con 50 ml di tampone di eluizione STREP (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2,5 mM Desthiobiotin). Vortex a 800 rpm per 15 min a 4 ° C.
   6. Spin giù le perline a 1.500 xg per 1 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante. Tale quota corrisponde al campione "STREP AP Elution".
   7. Salvare la frazione perline a 4 ° C per una seconda eluizione, che potrebbe produrre fino a metà della quantità di proteina ottenuta con la prima eluizione. Aliquotare 10% del STREP AP Elution per la colorazione argento e / o western blotting^16.
5. Equilibrando le perline FLAG
   1. Estrarre (nx 16 ml) + n ml di soluzione di FLAG perline (n = numero di campioni) e spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C.
      NOTA: utilizzare punte bocca larga per perline pipetta.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% NP-40) ai talloni. Spin down a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere per un totale di 3 lavaggi.
   3. Risospendere le sfere in tampone di lavaggio FLAG ad un volume finale di nx 16 ml.
   4. Aggiungere 16 ml di liquame FLAG tallone per il restante eluizione STREP AP e pernottamento nutate a 4 ° C.

5. FLAG IP

1. Spin giù la sospensione perline FLAG a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante e conservare come la "FLAG IP Flow-through" (FT) a 4 ° C.
2. Aggiungere 50081; l di tampone di lavaggio FLAG alla soluzione. Nutate per 5 minuti a 4 ° C e centrifugare a 1500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Ripetere per un totale di 4 lavaggi e rimuovere il surnatante dopo ogni lavaggio.
   NOTA: prima il quarto lavaggio, trasferire la soluzione proteica-perline in una nuova provetta da 1,5 ml per ridurre sfondo. Questo passaggio è fondamentale.
3. Rimuovere il surnatante dalla centrifuga finale e aggiungere 30 ml di tampone di lavaggio FLAG contenente 200 ng / ml di FLAG peptide nelle perline. Vortex a 800 rpm per 2 ore a 4 ° C.
4. Centrifugare la sospensione a 1.500 xg per 2 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservare a 4 ° C come la "FLAG IP eluizione."
   NOTA: I campioni di eluizione possono essere confermate con macchia d'argento e / o Western Blot utilizzando protocolli standard ^{di 16,} e sono pronti per ulteriori analisi di proteine. Quando si imposta un Western Blot, eseguire tutti i seguenti campioni: (1) STREP AP Ingresso, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutisu, (4) FLAG IP FT, e (5) bandiera IP eluizione. I volumi caricati dovranno essere determinati per ogni esperimento. Tutti i campioni raccolti e perline possono essere conservati a 4 ° C per una conservazione a breve termine e a -80 ° C per una conservazione a lungo termine. Campioni TAP possono essere analizzati mediante spettrometria di massa per verificare l'identità dei loro componenti, per identificare nuove modificazioni post-traduzionali (PTM), e / o per scoprire ogni interazione proteina romanzo con il complesso purificato ^{2, 17.} A tale scopo, dopo l'esecuzione di un gel Coomassie o argento macchia, bande possono essere tagliate dal gel utilizzando un bisturi pulito. Diversi ottime recensioni che discutono i metodi di spettrometria di massa sono stati pubblicati in precedenza ^{18, 19.}

Risultati

In questo articolo, abbiamo dimostrato l'applicabilità del metodo TAP per il ben caratterizzato CycT1-CDK9 complesso (noto anche come P-TEFb chinasi).

I plasmidi codificanti ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabella 1), sono state trasfettate in cellule HEK293T . I controlli negativi inclusi trasfezioni con un vettore vuoto e il CDK9: F...

Discussione

Il protocollo qui descritto per l'espressione e l'isolamento di complessi proteici da cellule eucariotiche non è limitata alla caratterizzazione biochimica di tali complessi molecolari, ma può anche essere utilizzato per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che potrebbe regolare la loro funzione. L'utilizzo di tag di affinità non si limita a ciò che è menzionato in questo protocollo; ma la nostra esperienza suggerisce che l'utilizzo STREP come primo passo AP m...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH3002.2FS
Fetal bovine serum	GE Healthcare Life Sciences/Hyclone	SH30071
Penicillin/Streptomycin	MP Biomedicals	MP091670049
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836153001
STREP-Tactin Superflow	IBA Lifesciences	2-1208-010
STREP-tag elution buffer	IBA Lifesciences	2-1000-025
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	F2426
Corning 100 mm × 20 mm style dish cell culture treated nonpyrogenic polystyrene 20/sleeve	Corning	430167
Protein Lo-Bind Eppendorf	Eppendorf	022431081
Digital Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-370
48 hole micro tube foam rack	Fisher Scientific	02-215-386
Labquake shaker rotisserie	Thermo	415110