原代小胶质的快速和精细的CD11b电磁隔离带增强的纯度和多功能性

摘要

这里，我们提出用于体外实验的协议来隔离来自出生后小鼠幼仔的小胶质细胞（1天）。此简易分离方法产生了高收率和纯度，在替代方法一个优点显著允许阐明小胶质生物学的目的范围广泛的实验。

摘要

小胶质细胞是主要的反应，以中枢神经系统损伤;然而，还有许多关于他们在调节神经炎症的作用尚不清楚。小胶质细胞是功能类似于在巨噬细胞炎性测量应力中胚层细胞。经典的（M1型）和替代（M2型）的巨噬细胞的激活也已经扩展到小神经胶质细胞中是为了更好地理解下面的相互作用这些表型具有在神经炎性病症​​，例如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，和亨廷顿氏病。 体外实验利用初级小胶质细胞提供了可以扩展到体内环境的快速和可靠的结果。虽然这是在体内实验具有明显的优势，隔离的小胶质细胞而实现最佳的纯净，足够的产量一直是个挑战。目前使用的常用方法无论是从回收率低，纯度低，或两者受苦。在此，我们高程模型onstrate该实现中的时间量的一半高的细胞回收和提高的纯度的无柱的CD11b磁分离方法的改进。我们建议这种方法优化为主的小胶质细胞分离为研究神经炎症和神经退行性病变的目的非常有用的模型。

引言

小胶质细胞是中胚层起源的MYB-亚独立定居巨噬细胞，其选自c-kit + / CD45 -分化erythromyeloid在卵黄囊^1，2的血岛祖细胞。一旦胚胎的小胶质细胞已定植的中枢神经系统（CNS），它们从一个变形虫过渡到网状形式^3。因为它们的动态后果探测潜在的侮辱⁴良性脑实质这些成人小胶质细胞被列为监视者。虽然小胶质细胞只向CNS细胞群的约10％，其以瓦能力彼此之间确保了实质^4,5的最大扫描。危险相关的分子模式（DAMP的），如α突触核蛋白^6,7和淀粉样蛋白^β8，或对athogen相关分子模式（PAMP），如脂多糖^{（LPS）9，}经典激活的小胶质细胞，以促进其特征在于，回复到变形虫活动状态，产生一氧化氮，肿瘤坏死因子α（TNFα），白介素1β的炎症反应（IL-1β），IL-6，IL-12，和趋化因子CC基序配体2 ^{9，10，11。}在神经炎性病症，例如帕金森氏病，其中致病α突触核蛋白积累了，神经变性周期从多巴胺能神经元，其中释放出更多的聚集α突触核蛋白的死亡创建的，进一步促进小胶质细胞⁷的经典活化。类似于周巨噬细胞，小神经胶质细胞还可具有在抗炎细胞因子IL-4和IL-10的存在下交替地激活的能力，给他们的有效的促进神经修复和衰减炎症^2，11 IAL。除了在中枢神经系统的免疫作用，小胶质细胞已被开发过程中修剪突触描述为神经回路的重要调节器。例如，Cx3cr1- KO小鼠具有较少致密的小胶质细胞和减少突触修剪，这导致树突棘，未成熟的突触，并不发达CNS ¹²的电图案的过剩。在CNS中的稳态了解这些生理复杂性和小胶质细胞的各种功能性作用是对寻求治疗剂靶向神经变性疾病的关键。

在神经免疫学领域， 在体外实验是因为机理研究更大的可行性非常可取的，较低的维护成本，并为是少时间和劳动密集。 Furthermo再，以分离细胞群的能力是在规定条件下以描绘那些靶细胞的功能性是至关重要的。无数小胶质细胞的分离方法存在，但它们可通过它们，以获得相对高的数量和纯度为广泛的实验^13，14，15的能力的限制。例如，分化11b的簇（细胞CD11b）是单核细胞，巨噬细胞，小胶质细胞和¹⁶的共同的表面标志物。通过利用细胞CD11b，磁分离的方法最初被描述为每新生儿脑¹⁷产生了基于列的办法〜99.5％的纯度，和〜1.6×10 ⁶的小胶质细胞。我们实验室最近开发了一种无柱的CD11b磁分离方法^15，我们在聚苯乙烯管通过用缀合藻红蛋白（PE）的单克隆抗体标记的CD11b进行。一种双特异性第二ARY抗体到PE和与PE葡聚糖复合物。一旦结合，葡聚糖包被的磁性颗粒被引入，其结合所述抗体复合物的葡聚糖端。最后，聚苯乙烯管放置在小神经胶质细胞隔离的磁铁。这种方法增加了一倍的产率每〜新生儿脑，但在减少纯度〜97％的成本3.2×10 ⁶的小胶质细胞。

在本文中，我们展示了一个快速和精制无柱的CD11b磁选协议（ 图1）。由于CD11b的磁分离试剂盒的价格是一样的这种改进的方法仍然是我们原来的无柱的方法是可行的。完成时间减半，这可以最大限度地提高细胞的存活和产量至关重要的减少。值得注意的是，从这个优化的方法实现纯度〜> 99％，比从我们的实验室¹⁵开发的原始无柱方法实现的纯度显着改善。最重要的是，细胞CD11b-PE没有被利用，从而无需从光孵育远，并允许荧光显微镜使用红色通道的。最后，如在原来的CD11b的方法，用这种改进的方法获得高产率和高纯度的星形细胞级分。星形胶质细胞是中枢神经系统中最大量的胶质细胞，导致的想法，他们的自我平衡的功能有关的病理生理学¹⁸不可缺少的。这些胶质细胞在不同的生理功能，如形成血 - 脑屏障，提供营养支持，维持神经递质的动态平衡，响应损伤神经保护作用形成胶质疤痕，学习和记忆，和神经炎症，体现他们的调查潜在的胶质中发挥作用生物学^19。形态与小胶质细胞和星形胶质细胞的功能都通过激光共聚焦显微镜，免疫印迹，实时定量聚合酶链反应（定量RT-PCR），G被确定里斯亚硝酸盐测定中，和Luminex多重细胞因子测定。由这个协议所提供的精细化提供更高的置信度涉及小胶质星形细胞或纯度，与红色信道的可用性荧光显微镜的更广泛的应用，并节省了时间，所有这些都是在体外实验重要。

研究方案

动物和协议的程序使用批准和机构动物护理和使用委员会（IACUC）在爱荷华州立大学（埃姆斯，IA，USA）的监督

1.混合胶质细胞培养物的种植

1. 迅速斩首1-2日龄幼仔用5.5英寸操作剪刀，并立即放置在头冰上的50毫升管中。请注意，这是断头安乐死的方式。
2. 在层流气流罩，使在颅骨和使用4.5英寸直微解剖剪脑膜一个小切口。开始从尾端切割喙端（鼻）。通过使用由断头形成的开口获取的皮肤下面。
   1. 切口后，剥离半球一侧的一个。然后使用一对弯曲的或钩状镊子的删除整个大脑。
3. 沉浸大脑（一个或多个）在含有0.25％胰蛋白酶ethylenediaminetetraacet新50mL试管在37℃水浴中吃15分钟乙酸（EDTA）。使用2毫升每脑胰蛋白酶-EDTA的。
4. 通过添加和删除的新鲜生长培养基（10％FBS，DMEM / F12，1％青霉素/链霉素，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸钠和1％非必需氨基酸）洗涤脑（S）媒体。重复此4倍。
5. 对于每个脑，板含有生长培养基两个T-75烧瓶中。因此，每个脑加入2毫升的生长培养基到管上。因此，这将是1毫升脑匀浆中的与8-9毫升，每T-75烧瓶中的生长培养基的等效。
6. 通过研磨脑（或多个）具有不同开口尺寸的移液管，以便从最大到最小均化。当它是可见的大脑组织没有变小，过渡到下一个吸管。在研磨结束时，悬挂应该是明确的，没有可见的块。
   1. 使用一个25毫升移液管，5毫升吸管，然后毫升吸管顺序10中。
7. 通过每个homog通过70微米的细胞滤网enous脑悬浮液，使之成为一个单一的细胞培养物。
8. 对于每个匀化脑，包含板两个T-75烧瓶生长培养基中，在步骤1.5（均化脑的1毫升8-9毫升，每T-75烧瓶中的生长培养基）中所述。
9. 转变增长媒体6 d后，成长，直到^第 16天的隔离。

2.小​​胶质细胞的分离

1. 后16天，从烧瓶中除去生长培养基，并放置在新的50ml管中。加入3毫升0.25％胰蛋白酶-EDTA的每个T-75烧瓶中。摇定轨振荡器上在室温下5分钟的烧瓶中。
   1. 离心机在0.4×g离心5分钟，除去的生长培养基，并使用停止在随后的步骤中胰蛋白酶-EDTA反应。
2. 振摇5分钟后，添加至少4毫升生长培养基（新鲜的或从2.1.1所使用的介质）中的以停止胰蛋白酶-EDTA反应。
3. 磨碎，以确保所有的C厄尔已经分离。
4. 研磨后，通过将细胞通过70微米的细胞滤网，以使之成为一个单一的细胞培养物，进行细胞计数，然后在0.4×g下降速细胞5分钟。
5. 对于每100×10 ^6个细胞（大约15×T-75烧瓶中），可以使用1毫升推荐的介质（2％FBS，DPBS（钙和镁的氯化物免费），1mM EDTA）中的重悬细胞沉淀。
   注:所有下列步骤专为1层毫升分离。
6. 取5毫升聚苯乙烯管中，加入推荐的介质的1毫升，并标记弯液面。添加推荐的介质为2.5毫升和标记这一点。丢弃所推荐的媒体和重新悬浮的细胞转移到5毫升聚苯乙烯管。
7. 添加大鼠血清50μL的每1毫升悬浮细胞的。在室温下孵育5分钟。
8. 通过混合组分A的25μL和组分B的25μL这些组件是专有的制备选择鸡尾酒。
9. 添加501，L选择鸡尾酒与细胞的。在室温下孵育5分钟。
   注:对于更纯粹的文化，重复步骤2.9（建议，但不是强制性的）。
10. 涡街球为45秒。添加80μL每1mL样品的微球。在室温下孵育3分钟。
11. 通过将推荐的介质使体积到在聚苯乙烯管2.5毫升。
12. 放管中的磁体，在室温下3分钟。调整孵化，以增加纯度。慢慢倾出推荐的介质到15mL管与磁体仍然在聚苯乙烯管中。
13. 重复步骤2.12三次。附加磁性孵育可以被执行以增加纯度。
14. 加入3毫升的生长培养基和计数使用细胞计数器细胞的数目。
15. 板的细胞在相应聚-D-赖氨酸（PDL）的治疗中包被的平板上。处理细胞接种inPDL包被的板上之后48个小时。这允许细胞从分离的压力中恢复。
    注:车使用完蛋免疫细胞化学如前面¹⁵所描述的培养物的纯度。
16. 板中的负部分（在一个15毫升管中收集），其大多含有星形胶质细胞，在生长培养基的T-75烧瓶中。
17. 在37℃培养箱中温育至少6个小时后，改变培养基，并让它生长O / N。拆分星形胶质细胞，第二天的治疗。

结果

小神经胶质细胞使用细胞CD11b阳性选择试剂盒分离II具有高纯度

原代小鼠的小胶质细胞使用上述方案分离并接种于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，以检查隔离的纯度。每孔和免疫细胞化学分析铺板万个细胞使用离子化的钙结合适配器分子1（Iba1）作为小胶质细胞和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞的标记物的标记物以?...

讨论

旧版小胶质细胞的分离方法具有有限的回收率关于各种蛋白通过Western印迹分析和RNA通过qRT-PCR分析是不恰当的。差分的粘附性和温和的胰蛋白酶消化的方法是具有低的小神经胶质收率^13，14，15两种常用的方法。基于列的CD11b的方法也有低回收率，但实现了比差的粘附性和温和的胰蛋白酶消化

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360070
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamine (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	13H469
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190250