Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post - natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.

Résumé

Les microglies sont les répondeurs principaux aux insultes du système nerveux central; Cependant, il reste encore beaucoup de leur rôle dans la régulation neuro-inflammation. Microglies sont des cellules mésodermiques qui fonctionnent de manière similaire aux macrophages dans le stress inflammatoire arpentage. Le classique (M1-type) et alternatif (M2 type) activations de macrophages ont également été étendues à microglie dans le but de mieux comprendre l'interaction sous-jacente de ces phénotypes ont dans des conditions neuro-inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, d'Alzheimer et la maladie de Huntington. Dans l' expérimentation in vitro en utilisant la microglie primaire offre des résultats rapides et fiables qui peuvent être étendues à l'environnement in vivo. Bien que ce soit un net avantage sur l' expérimentation in vivo, l' isolement microglies tout en obtenant des rendements adéquats de pureté optimale a été un défi. Les méthodes courantes actuellement utilisées souffrent soit de faible récupération, de faible pureté, ou les deux. Ici, nous demontrer un perfectionnement du procédé de séparation magnétique CD11b sans colonne qui permet d'obtenir une récupération élevée de cellules et de pureté améliorée dans la moitié de la quantité de temps. Nous vous proposons cette méthode optimisée comme un modèle très utile d'isolement microglie primaire aux fins de l'étude et la neuro-inflammation neurodégénérescence.

Introduction

Les microglies sont macrophages résidents Myb indépendants d'origine mésodermique, qui se différencient à partir de c-kit + / CD45- érythromyéloïde progéniteurs dans les îlots sanguins de la vésicule ombilicale ^{1, 2.} Une fois embryologique microglie ont colonisé le système nerveux central (SNC), leur transition d'une amoeboid à une forme ramifiée ^3. Ces microglies adultes sont classés comme Surveillant puisque leurs ramifications dynamiques sonde le parenchyme cérébral sain pour les insultes potentiels ^4. Bien que les microglies ne contribuent à environ 10% de la population de cellules du système nerveux central, leur capacité à carreaux entre l'autre assure la numérisation maximale du parenchyme ^{4, 5.} Motifs moléculaires associés danger (DAMPS), tels que α-synucléine ^{6, 7} et ⁸ β-amyloïde, ou pmotifs moléculaires associés athogen (PAMP) tels que le lipopolysaccharide (LPS) ^9, classiquement activer la microglie , de promouvoir une réaction inflammatoire caractérisée par le retour à l'état actif de amoeboid et la production d'oxyde nitrique, le facteur-α de nécrose tumorale (TNF), l' interleukine 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, et le ligand motif chimiokine CC 2 ^{9, 10, 11.} Dans des conditions neuro - inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, dans laquelle pathogène α-synucléine a accumulé, un cycle neurodégénérative est créé à partir de la mort des neurones dopaminergiques, qui libèrent α-synucléine agrégée plus, en favorisant en outre l' activation de la microglie classique ^7. Similaires aux macrophages périphériques, la microglie peut également avoir la capacité d'activer alternativement en présence des cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-10, en leur donnant la puissanteial de favoriser la réparation neuronale et l' inflammation ^{2 atténuer, 11.} En plus de leurs rôles immunologiques dans le système nerveux central, la microglie ont été décrits en tant que régulateurs vitaux des circuits neuronaux par la taille synapses au cours du développement. Par exemple, les souris KO ont Cx3cr1- microglie moins denses et réduit la taille synaptique, ce qui conduit à une surabondance d'épines dendritiques immatures, synapses, et les motifs électrophysiologiques d'une sous - développée du système nerveux central ^12. La compréhension de ces complexités physiologiques et les divers rôles fonctionnels des microglies dans l'homéostasie du système nerveux central est essentiel à la recherche de thérapies ciblant les maladies neurodégénératives.

Dans le domaine de la neuro - immunologie, des expériences in vitro sont hautement souhaitables en raison de la plus grande faisabilité des études mécanistes, les coûts d'entretien et d'être moins de temps et de main-d'œuvre. Furthermore, la capacité d'isoler des populations de cellules est essentielle pour délimiter la fonctionnalité de ces cellules cibles dans des conditions prescrites. De nombreuses méthodes d'isolement microgliales existent, mais ils sont limités par leur capacité à obtenir un nombre relativement élevé et la pureté pour une large expérimentation ^{13, 14, 15.} Par exemple, un groupe d'11b de différenciation (CD11b) est un marqueur de surface commune des monocytes, les macrophages et les microglies ^16. En exploitant CD11b, un procédé de séparation magnétique a d' abord été décrit comme étant une approche basée sur colonne qui a donné ~ pureté de 99,5% et ~ 1,6 x 10 ⁶ par la microglie cerveau néonatal ^17. Notre laboratoire a récemment mis au point un procédé de séparation magnétique CD11b libre de la colonne ^15, que nous avons effectuée dans un tube de polystyrène par le marquage CD11b avec un anticorps monoclonal conjugué à la phycoérythrine (PE). Un bispécifique secondary anticorps à PE et complexes dextrane avec le PE. Une fois lié, les particules magnétiques revêtues de dextrane sont introduits, qui se lient à la fin de dextrane du complexe d'anticorps. Enfin, le tube en polystyrène est placé dans un aimant pour l'isolement de la microglie. Cette approche a doublé le rendement à ~ 3,2 x 10 ⁶ microglies par cerveau du nouveau - né , mais au coût de la réduction à la pureté ~ 97%.

Ici, nous démontrons un protocole magnétique CD11b sans colonne rapide et raffinée séparation (figure 1). Cette méthode améliorée reste aussi possible que notre méthode sans colonne d'origine puisque le prix du kit de séparation magnétique CD11b est le même. La durée de traitement est réduit de moitié, ce qui peut être crucial pour optimiser le rendement et la survie cellulaire. En particulier, la pureté obtenue à partir de cette méthode optimisée est ~> 99%, une nette amélioration par rapport à la pureté obtenue à partir de la méthode sans colonne originale développée par notre laboratoire ^15. Plus important encore, CD11b-PEn'est pas utilisé, ce qui élimine la nécessité de laisser incuber abri de la lumière et permettant l'utilisation du canal rouge pour la microscopie de fluorescence. Enfin, comme dans le procédé CD11b original, une fraction astrocytaire de rendement élevé et une pureté est obtenue avec ce procédé amélioré. Les astrocytes sont les plus nombreuses cellules gliales du système nerveux central, ce qui conduit à l'idée que leurs fonctions sont indispensables homéostatique par rapport à ¹⁸ physiopathologie. Ces cellules gliales jouent un rôle dans diverses fonctions physiologiques telles que la formation de la barrière hémato-encéphalique, fournissant un soutien en éléments nutritifs, le maintien de l'homéostasie des neurotransmetteurs, formant des cicatrices gliales en réponse à des blessures, la neuroprotection, l'apprentissage et la mémoire, et neuroinflammation, ce qui illustre leur potentiel d'enquête dans gliale biologie ^19. Morphologique et la fonctionnalité de la microglie et astrocytes ont été vérifiés par microscopie confocale, Western Blot quantitative en temps réel Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gdosage de nitrite Riess, et le dosage des cytokines multiplex Luminex. Le raffinement fourni par ce protocole offre une plus grande confiance concernant la pureté des microglies ou astrocytes, une application plus large de la microscopie à fluorescence avec la disponibilité du canal rouge, et fait gagner du temps, qui sont tous importants pour l' expérimentation in vitro.

Protocole

L'utilisation des animaux et des procédures de protocole ont été approuvés et supervisés par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à l'Iowa State University (Ames, IA, États-Unis)

1. Croissance des cultures mixtes gliales

1. 1- 2 chiots Décapitez âgés jour rapidement avec 5,5 pouces ciseaux d'exploitation, et placer les têtes immédiatement dans un tube de 50 ml sur la glace. Notez que cette décapitation est le mode d'euthanasie.
2. Dans une hotte à flux laminaire, une petite incision dans le crâne et les méninges en utilisant 4,5 pouces ciseaux micro-dissection droites. Commencer à couper à partir de l'extrémité caudale à l'extrémité rostrale (nez). Obtenir sous la peau à l'aide de l'ouverture formée par la décapitation.
   1. Après l'incision, peler une des hémisphères sur le côté. Ensuite, utilisez une paire de pinces courbes ou crochet pour enlever l'ensemble du cerveau.
3. Immerger le cerveau (s) dans un nouveau tube de 50 ml contenant 0,25% de trypsine-ethylenediaminetetraacetmangé acide (EDTA) pendant 15 min dans un bain d'eau à 37 ° C. Utiliser 2 ml de trypsine-EDTA par cerveau.
4. Laver le cerveau (s) avec des produits frais du milieu de croissance (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de pénicilline / streptomycine, 1% de L-glutamine, 1% de pyruvate de sodium, et 1% d'acides aminés non essentiels) en ajoutant et en enlevant le médias. Répétez cette 4x.
5. Pour chaque cerveau, plaque deux T-75 flacons contenant un milieu de croissance. Par conséquent, ajouter 2 ml de milieu de croissance par cerveau au tube. Ainsi, il sera un équivalent de 1 ml de cerveau homogénéisés avec 8-9 ml de milieu de croissance par flacon T-75.
6. Homogénéiser par triturer le cerveau (s) avec des pipettes de différentes tailles d'ouverture, pour le plus grand au plus petit. Quand il est visible que le tissu du cerveau ne reçoit pas plus petit, la transition à la pipette suivante. A la fin de la trituration, la suspension doit être claire, sans morceaux visibles.
   1. Utiliser une pipette de 25 ml, pipette 5 ml, puis une pipette de 10 ml de manière séquentielle.
7. Passez chaque homogsuspension Enous du cerveau à travers un tamis cellulaire de 70 um à en faire une culture d'une cellule unique.
8. Pour chaque cerveau homogénéisé, plaque deux flacons T-75 contenant un milieu de croissance, tel que décrit à l'étape 1.5 (1 ml de cerveau homogénéisé avec 8-9 ml de milieu de croissance par flacon T-75).
9. Changer les médias de croissance après 6 d et croître jusqu'à l' isolement le 16 ^e jour.

2. Isolement des cellules microgliales

1. Après 16 jours, retirez le support de croissance du ballon et le placer dans un nouveau tube de 50 ml. Ajouter 3 ml de 0,25% de trypsine-EDTA à chaque flacon T-75. Agiter les flacons pendant 5 min à température ambiante sur un agitateur orbital.
   1. Centrifuger la milieu de croissance retiré à 0,4 g pendant 5 min et en utilisant pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA dans l'étape suivante.
2. Après agitation pendant 5 min, ajouter un minimum de 4 ml de milieu de croissance (frais ou le support utilisé à partir 2.1.1) pour arrêter la réaction de la trypsine-EDTA.
3. Triturer pour faire en sorte que tous les cElls ont été détachés.
4. Après trituration, passer les cellules à travers un tamis cellulaire de 70 um pour en faire une seule culture cellulaire, effectuer une numération cellulaire, puis centrifuger les cellules à 0,4 g pendant 5 min.
5. Pour chaque 100 x 10 ⁶ cellules (environ 15 x flacons T-75), en utilisant 1 ml de milieu recommandé (2% de FBS, du DPBS (calcium et sans chlorure de magnésium), EDTA 1 mM) pour remettre en suspension le culot cellulaire.
   REMARQUE: Toutes les étapes suivantes sont adaptées pour une séparation 1 ml.
6. Prenez un tube de polystyrène 5 ml, ajouter 1 ml de supports recommandés, et marquer le ménisque. Ajouter un média recommandée jusqu'à 2,5 ml et marquer aussi. Jeter les médias recommandée et transférer les cellules remises en suspension dans le tube de polystyrène 5 ml.
7. Ajouter 50 pi de sérum de rat pour chaque 1 ml de cellules en suspension. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
8. Préparer cocktail de sélection en mélangeant 25 pi de composant A et 25 ul de composant B. Ces composants sont exclusifs.
9. Ajouter 501; L du cocktail de sélection aux cellules. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
   NOTE: Pour les cultures plus pures, répétez l'étape 2.9 (recommandé mais non obligatoire).
10. microsphères de Vortex pour 45 s. Ajouter 80 pi de microsphères par 1 ml d'échantillon. Incuber pendant 3 min à température ambiante.
11. Porter le volume à 2,5 ml dans le tube de polystyrène en ajoutant les supports recommandés.
12. Placer le tube dans l'aimant pendant 3 min à température ambiante. Ajuster l'incubation pour augmenter la pureté. Verser lentement le support recommandé dans un tube de 15 ml avec l'aimant toujours dans le tube de polystyrène.
13. Répétez l'étape 2,12 trois fois plus. peuvent être effectués incubations magnétiques supplémentaires pour augmenter la pureté.
14. Ajouter 3 ml de milieu de croissance et compter le nombre de cellules en utilisant un compteur de cellules.
15. Cellules de la plaque en conséquence de Poly-D-Lysine (PDL) des plaques revêtues d'pour les traitements. Traiter les cellules 48 h après l'ensemencement des plaques revêtues de inPDL. Cela permet aux cellules de récupérer du stress de la séparation.
    NOTE: Check la pureté de la culture en utilisant une immunocytochimie comme décrit précédemment ^15.
16. Plaque de la fraction négative (recueilli dans un tube de 15 ml), qui contient principalement des astrocytes, dans des flacons T-75 dans le milieu de croissance.
17. Après au moins 6 heures d'incubation à 37 ° C incubateur, changer le milieu et laisser croître O / N. Diviser les astrocytes le lendemain pour les traitements.

Résultats

Microglie isolés en utilisant le kit de sélection positive CD11b II ont une grande pureté

microglies de souris primaires ont été isolés en utilisant le protocole mentionné ci-dessus et étalées sur des lamelles revêtues de poly-D-lysine pour vérifier la pureté de l'isolement. Dix mille cellules ont été étalées par puits et l'analyse immunocytochimique a été effectuée en utilisant la molécule d'adapt...

Discussion

Anciennes méthodes d'isolement microgliales ont des recouvrements limités qui ne sont pas appropriés pour diverses analyses de protéines par Western Blot et des analyses ARN par qRT-PCR. L'adhérence différentielle et les méthodes de trypsinisation douces sont deux approches courantes avec de faibles rendements microgliales ^{13, 14, 15.} L'approche basée CD11b colonne de récupération est également faible, ma...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360070
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamine (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	13H469
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190250