Isolamento magnético rápido e refinado CD11b da Primária Microglia com pureza e versatilidade

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para isolar microglia de crias de rato pós-natais (dia 1) para experimentação in vitro. Este método improvisada de isolamento gera tanto rendimento e pureza elevados, uma vantagem significativa em relação aos métodos alternativos que permite a ampla gama de experimentação para efeitos de elucidação da biologia da microglia.

Resumo

Microglia são os principais respondedores a insultos do sistema nervoso central; no entanto, muito permanece desconhecido sobre o seu papel na regulação da neuroinflamação. Microglia s culas da mesoderme que funcionam de forma semelhante aos macrófagos na topografia de stress inflamatório. O (M1-type) clássica e alternativa (do tipo M2) ativações de macrófagos também foram estendidos para microglia em um esforço para melhor compreender a interação subjacente estes fenótipos têm em condições neuroinflamat�ios como Parkinson, Alzheimer e doença de Huntington. Em experiências in vitro, utilizando a microglia primário oferece resultados rápidos e fiáveis, que podem ser estendidos para o ambiente in vivo. Embora esta seja uma clara vantagem sobre a experimentação in vivo, isolando microglia ao conseguir rendimentos adequados de pureza óptima tem sido um desafio. Os métodos mais comuns actualmente em uso quer sofrem de baixa recuperação, baixo grau de pureza, ou ambos. Aqui, nós demmonstrar um refinamento do CD11b método de separação magnética sem colunas que atinge uma célula de recuperação elevado e pureza melhorada em metade da quantidade de tempo. Propomos este método otimizado como um modelo altamente útil de isolamento microglial primário para fins de estudar neuroinflamação e neurodegeneração.

Introdução

Microglia são macrófagos residentes Myb-independentes de origem mesodérmica, que diferenciam a partir de c-kit + / CD45- erythromyeloid progenitores nas ilhas de sangue do saco vitelino ^{1, 2.} Uma vez que a microglia embriológicos colonizaram o sistema nervoso central (SNC), que a transição de uma para uma forma amebóide ramificado ^3. Estes microglia adultos são classificados como surveillant desde suas ramificações dinâmicas sondar o parênquima cerebral saudável para potenciais insultos ^4. Embora microglia só contribuem para aproximadamente 10% da população de células do SNC, a sua capacidade de telha entre si assegura varrimento máxima do parênquima ^{4, 5.} Padrões perigo-associados moleculares (amortece), tais como α-sinucleína ^{6, 7} e ^8-amilóide β, ou ppadrões moleculares athogen-associados (PAMP), tais como lipopolissacáridos (LPS) ^9, classicamente activar microglia para promover uma resposta inflamatória, caracterizada pela reversão para o estado activo amebóide e a produção de óxido nítrico, factor de necrose tumoral-α (TNF?), 1β interleucina ligando (IL-1β), IL-6, IL-12, e o motivo de quimiocina CC 2 ^{9, 10, 11.} Em condições neuro-inflamatórias, tais como a doença de Parkinson, em que patogénico α-sinucleína acumulou, um ciclo neurodegenerativa é criada a partir da morte de neurónios dopaminérgicos, que libertam mais agregado α-sinucleína, promovendo ainda mais a activação de microglia clássica ^7. Semelhante aos macrófagos periféricos, microglia pode também ter a capacidade para activar, alternativamente, na presença das citocinas anti-inflamatórias de IL-4 e IL-10, dando-lhes a potenteial de promover a reparação neural e atenuar a inflamação ^{2, 11.} Para além das suas funções imunológicas no SNC, microglia foram descritos como reguladores vitais do circuito neuronal pela poda sinapses durante o desenvolvimento. Por exemplo, os ratinhos KO Cx3cr1- têm microglia menos densas e reduzida poda sináptica, o que leva a um excesso de espinhas dendriticas, sinapses imaturas, e os padrões electrofisiológicas de um CNS subdesenvolvida ^12. Compreender estas complexidades fisiológicas e os diversos papéis funcionais da microglia na homeostase do SNC é crítica para a procura de agentes terapêuticos alvo desordens neurodegenerativas.

Na área de neuroimmunology, em experiências in vitro são altamente desejável por causa da maior viabilidade para estudos mecanicistas, os mais baixos custos de manutenção, e por ser menos tempo e trabalho intensivo. Furthermore, a capacidade para isolar populações de células é crítica para delinear a funcionalidade dessas células alvo sob condições prescritas. Existem numerosos métodos de isolamento microgliais, mas são limitadas pela sua capacidade para obter números relativamente elevados e pureza para a experimentação ^{13, 14, 15.} Por exemplo, um aglomerado de diferenciação 11b (CD11b) é um marcador de superfície comum de monócitos, macrófagos, e microglia ^16. Através da exploração de CD11b, um método de separação magnética foi descrito pela primeira vez como uma abordagem baseada em coluna que produziu ~ 99,5% de pureza e ~ 1,6 x 10 ⁶ por microglia cerebral neonatal ^17. O nosso laboratório desenvolvido recentemente um método de separação magnética CD11b livre de coluna ^15, o que foi realizado num tubo de poliestireno por marcação CD11b com um anticorpo monoclonal conjugado com ficoeritrina (PE). A seconda biespec�icaanticorpo ry a PE e complexos de dextrano com o PE. Uma vez ligado, partículas magnéticas revestidas com dextrano são introduzidos, os quais se ligam ao fim de dextrano do complexo anticorpo. Por fim, o tubo de poliestireno é colocado em um íman para o isolamento da microglia. Esta abordagem duplicou o rendimento de ~ 3,2 x 10 ⁶ por microglia do cérebro neonatal, mas à custa de reduzir a pureza de ~ 97%.

Aqui, demonstramos uma coluna isenta de CD11b protocolo de separação magnética rápida e refinado (Figura 1). Este método melhorado permanece como viável como o nosso método isento de coluna original já que o preço do kit de separação magnética CD11b é o mesmo. O tempo de conclusão é reduzido para metade, o que pode ser crucial para maximizar a sobrevivência das células e o rendimento. Notavelmente, a pureza conseguida por este método é optimizado ~> 99%, uma melhoria significativa sobre a pureza obtida a partir do método isento de coluna original desenvolvido pelo nosso laboratório ^15. Mais importante ainda, CD11b-PEnão é utilizado, eliminando a necessidade de incubar ao abrigo da luz e permitindo o uso do canal de vermelho para a microscopia de fluorescência. Por último, tal como no método CD11b original, uma fracção astrocítica de elevado rendimento e pureza é obtida com este método melhorado. Os astrócitos são as mais numerosas células gliais no sistema nervoso central, levando à idéia de que as suas funções homeostáticas são indispensáveis em relação à fisiopatologia ^18. Estas células gliais desempenhar um papel em diversas funções fisiológicas, tais como a formação da barreira sangue-cérebro, proporcionando suporte de nutrientes, mantendo neurotransmissor homeostase, formando cicatrizes gliais em resposta a uma lesão, a neuroproteco, a aprendizagem e a memória, e neuroinflamao, exemplificando o seu potencial de investigação no glial biologia ^19. Morfologia e funcionalidade da microglia e astrócitos foram verificados através de microscopia confocal, transfercia de Western, quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR), Lensaio de nitritos Riess, e o ensaio multiplex citocina Luminex. O refinamento fornecida por este protocolo oferece maior confiança relativos à pureza da microglia ou astrócitos, a aplicação mais ampla da microscopia de fluorescência com a disponibilidade do canal de vermelho, e economiza tempo, todos os quais são importantes para experimentação in vitro.

Protocolo

O uso dos animais e procedimentos protocolares foram aprovados e supervisionados pela Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade Estadual de Iowa (Ames, IA, EUA)

1. Crescimento de culturas gliais mistas

1. Decapitar 1- filhotes de 2 dias de idade rapidamente com uma tesoura que operam 5,5 polegadas, e colocar as cabeças imediatamente em um tubo de 50 ml em gelo. Note que esta decapitação é o modo de eutanásia.
2. Num capuz de fluxo de ar laminar, fazer uma pequena incisão no crânio e as meninges utilizando 4,5 polegadas rectas-dissecando micro tesouras. Começar a cortar a partir do final caudal à extremidade rostral (nariz). Obter por baixo da pele utilizando a abertura formada pela decapitação.
   1. Após a incisão, descascar um dos hemisférios até a lado. Em seguida, usar um par de pinças curvas ou em forma de gancho para remover todo o cérebro.
3. Mergulha-se o cérebro (s) em um tubo de 50 ml novo, contendo 0,25% de tripsina-ethylenediaminetetraacetComeram ácido acético (EDTA) durante 15 min num banho de água a 37 ° C. Utilizam-se 2 ml de tripsina-EDTA por cérebro.
4. Lavar o cérebro (s) com meio fresco de crescimento (10% de FBS, DMEM / F12, 1% de penicilina / estreptomicina, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sódio, e 1% aminoácidos não-essenciais) através da adição e remoção do meios de comunicação. Repita este 4x.
5. Para cada cebro, placa dois frascos T-75 contendo o meio de crescimento. Por isso, adicionar 2 ml de meio de crescimento por cérebro para o tubo. Assim, será um equivalente de 1 ml de homogeneizado cerebral com 9/8 mL de meio de crescimento por T-75 balão.
6. Homogeneizar por trituração do cérebro (s) com pipetas de diferentes tamanhos de abertura, na ordem da maior para a menor. Quando é visível que o tecido cerebral não está ficando menor, a transição para a próxima pipeta. No final da trituração, a suspensão deve ser claro, sem pedaços visíveis.
   1. Usar uma pipeta de 25 mL, 5 mL de pipeta, e, em seguida, uma pipeta de 10 sequencialmente.
7. Passe cada homogsuspensão cérebro enous através de um filtro de células de 70 ^ m a torná-lo em uma única cultura celular.
8. Para cada cerebral homogeneizado, placa dois frascos T-75 contendo o meio de crescimento, tal como descrito no passo 1.5 (1 ml de homogeneizado cerebral com 9/8 mL de meio de crescimento por T-75 balão).
9. Mudar o meio de crescimento depois de 6 d e crescer até isolamento no ^16º dia.

2. Isolamento de células microgliais

1. Após 16 dias, remover o meio de crescimento a partir do frasco e colocá-lo em um tubo de 50 ml fresco. Adicionar 3 ml de 0,25% de tripsina-EDTA a cada frasco T-75. Agitar os frascos de 5 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital.
   1. Centrifugar o meio de crescimento removido em 0,4 xg durante 5 min e utilizar para parar a reacção de tripsina-EDTA no passo subsequente.
2. Após agitação durante 5 min, adicionar um mínimo de 4 ml de meio de crescimento (fresco ou o meio utilizado a partir de 2.1.1) para parar a reacção de tripsina-EDTA.
3. Triturar para garantir que todos os cells foram destacados.
4. Após trituração, passar as células através de um coador de células de 70 ^ m a torná-lo em uma cultura de células individuais, realizar uma contagem de células, e depois girar para baixo as células a 0,4 x g durante 5 min.
5. Para cada 100 x 10 ⁶ culas (cerca de 15 x frascos T-75), 1 mL de usar materiais recomendados (2% de FBS, DPBS (cálcio e magnésio livre de cloreto), EDTA 1 mM) para ressuspender o sedimento celular.
   NOTA: Todos os passos que se seguem foram concebidos para um mL de separação 1.
6. Tome um mL tubo de 5 poliestireno, adicionar 1 ml de materiais recomendados, e marcar o menisco. Adicionar mídia recomendada até 2,5 mL e marcar este também. Descartar a materiais recomendados e transferência das células ressuspensas para o tubo de polistireno de 5 ml.
7. Adicionar 50 uL de soro de rato para cada 1 mL de células em suspensão. Incubar durante 5 min à TA.
8. Prepare cocktail selecção por mistura de 25 uL de componente A e 25 mL de componente B. Estes componentes são proprietários.
9. Adicionar 501; L de cocktail de selecção para as células. Incubar durante 5 min à TA.
   NOTA: Para obter culturas puras, repita o passo 2.9 (recomendado, mas não obrigatório).
10. microesferas de vórtice durante 45 segundos. Adicionar 80 ul de microesferas por 1 ml de amostra. Incuba-se durante 3 minutos à temperatura ambiente.
11. Levar o volume até 2,5 mL em tubo de poliestireno, adicionando a materiais recomendados.
12. Colocar o tubo no íman durante 3 minutos à temperatura ambiente. Ajustar a incubação para aumentar a pureza. Lentamente, deitar fora a mídia recomendada para um tubo de 15 mL com o ímã ainda no tubo de poliestireno.
13. Repita o passo 2,12 mais três vezes. incubações magnéticos adicionais podem ser realizadas para aumentar a pureza.
14. Adicionar 3 ml de meio de crescimento e contar o número de células utilizando um contador de células.
15. células da placa em conformidade em Poli-D-lisina (PDL) revestidas com placas de tratamentos. Tratar as células 48 h após a sementeira placas inPDL-revestidos. Isto permite que as células para recuperar do stress de separação.
    NOTA: Check a pureza da cultura usando imunocitoquímica, tal como descrito anteriormente ^15.
16. Placa da fracção negativa (recolhida num tubo de 15 mL), o qual contém principalmente os astrócitos, em frascos T-75 em meio de crescimento.
17. Depois de pelo menos 6 horas de incubação em 37 ° C incubadora, mudar o meio e deixar crescer O / N. Dividir os astrócitos no dia seguinte para tratamentos.

Resultados

Microglia isolado utilizando o kit de CD11b selecção positiva II têm alta pureza

microglia primários de ratinho foram isolados utilizando o protocolo acima mencionado e plaqueadas em lamelas de poli-D-lisina-revestidas para verificar a pureza de isolamento. Dez mil células foram plaqueadas por cavidade e análise imunocitoquimica foi efectuada utilizando molécula de adaptador se liga a cálcio ionizado 1 (Iba1) como um marc...

Discussão

Mais antigos métodos de isolamento microgliais têm recuperações limitados que não são apropriados para diversas análises de proteína por transferência de Western e análise de RNA por qRT-PCR. A adesão diferencial e métodos tripsinização leves são duas abordagens comuns, com baixos rendimentos microgliais ^{13, 14, 15.} A abordagem baseada em CD11b coluna também tem baixa recuperação, mas consegue uma maior pureza...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360070
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamine (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	13H469
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190250