Быстрое и рафинированное CD11b Магнитная изоляция первичной микроглии с повышенной чистоты и универсальности

Резюме

Здесь мы приводим протокол , чтобы изолировать микроглии от послеродовых щенков мышей (день 1) для экспериментов в пробирке. Этот импровизированный способ выделения генерирует и высокий выход и чистоту, значительное преимущество по сравнению с альтернативными методами, что позволяет широкий диапазон экспериментов для целей выяснения микроглии биологии.

Аннотация

Микроглия являются основными ответчиками к центральной системе нервных инсультам; Однако, многое остается неизвестным об их роли в регулировании нейровоспаления. Микроглия являются мезодермальными клетками, которые функционируют так же, как в макрофаги съемки воспалительного стресса. активаций макрофагов классической (М1-тип) и альтернативный (М2-типа) также были распространены на микроглии в попытке лучше понять основные взаимодействие эти фенотипы имеют в нейровоспалительных условиях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и Хантингтона. В пробирке экспериментов с использованием первичной микроглии предлагает быстрые и надежные результаты , которые могут быть распространены на окружающую среду в естественных условиях. Хотя это является явное преимущество по сравнению с экспериментированием в естественных условиях, выделение микроглии при достижении достаточных урожаев оптимальной чистоты была проблемой. Общие методы в настоящее время используются либо страдают от низкого извлечения, низкой чистоты, или обоих. При этом, мы демonstrate уточнения в CD11b метода магнитной сепарации без колонн, что обеспечивает высокое восстановление клеток и повышенную чистоту в половине количества времени. Мы предлагаем этот оптимизированный метод как весьма полезную модель первичной микроглии изоляции для целей изучения нейровоспаления и нейродегенерации.

Введение

Микроглия являются Myb-независимые макрофаги резидентов мезодермального происхождения, отличающие от с-Kit + / CD45- erythromyeloid клеток - предшественников в крови островках желточного мешок ^{1, 2.} После того, как эмбриологические микроглии колонизировали на центральную нервную систему (ЦНС), они переходят из амебоидных к разветвленной форме ^3. Эти взрослые микроглии классифицируются как Surveillant , поскольку их динамические последствия зондировать здоровую паренхиму мозга для потенциальных оскорблений ^4. Хотя микроглии только способствуют примерно 10% населения ЦНС клеток, их способность плитки между собой обеспечивает максимальное сканирование паренхимы ^{4, 5.} Опасность-ассоциированные молекулярные структуры (DAMPS), такие как альфа-синуклеин ^{6, 7} и амилоид-бета, ⁸ или рathogen-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs) , такие как липополисахариды (LPS) ^9, классически активации микроглии для содействия воспалительного ответа , характеризующийся реверсии в активное состояние амебоидной и производство оксида азота, фактора некроза опухоли-альфа (ФНО), интерлейкин 1 & beta ; (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, и хемокинов CC мотив лиганда 2 ^{9, 10, 11.} В нейровоспалительных условиях , таких как болезнь Паркинсона, в котором патогенные α-синуклеина накопил, нейродегенеративного цикл создается из смерти дофаминергических нейронов, которые высвобождают более агрегированный альфа-синуклеина, дальнейшее продвижение классической активации микроглии ^7. Подобно периферических макрофагах, микроглии может также иметь возможность альтернативно активировать в присутствии анти-воспалительных цитокинов IL-4 и IL-10, что дает им сильнодействующимIAL продвижения нейронную ремонта и ослабления воспаления ^{2, 11.} Помимо своих иммунологических ролей в ЦНС, микроглии были описаны как жизненно важные регуляторы нейронной цепи, сокращая синапсов в процессе разработки. Так , например, у мышей KO Cx3cr1- имеет менее плотные микроглии и снижение синаптической обрезку, что приводит к переизбытку дендритных шипов, незрелых синапсов и электрофизиологических моделей неразвитого ЦНСА ^12. Понимание этих физиологических сложностей и разнообразные функциональные роли микроглии в гомеостазе ЦНС имеет решающее значение для поиска терапевтических средств, ориентированных на нейродегенеративных расстройств.

В области нейроиммунологии, в пробирке эксперименты весьма желательны из - за большей возможности для механистических исследований, более низкие затраты на техническое обслуживание, а также за то , что меньше времени и трудоемким. Furthermoповторно, способность изолировать популяции клеток имеет решающее значение для очерчивания функциональных возможностей этих клеток-мишеней при заданных условиях. Существует множество способов микроглии изоляции, но они ограничены по своей способности получать относительно высоких количеств и чистоты для широких экспериментов ^{13, 14, 15.} Например, кластер дифференцировки 11b (CD11b) является общим поверхностным маркером моноцитов, макрофагов и микроглии ^16. При эксплуатации CD11b, метод магнитной сепарации был впервые описан как подход колонке на основе , которая давала ~ 99,5% чистоты и ~ 1,6 × 10 ⁶ микроглии в неонатальном мозге ^17. В нашей лаборатории недавно разработала CD11b магнитный метод разделения без колонн ^15, который мы провели в полистирольной трубке, помечая CD11b с моноклональным антителом , конъюгированным с фикоэритрином (PE). Биспецифическое SecondaRy антитела к РЕ и декстран комплексы с ПЭ. После связывания, декстран покрытием магнитные частицы вводятся, которые связываются с декстрана конце комплекса антитела. Наконец, полистирола пробирку помещают в магнит для микроглии изоляции. Этот подход в два раза выход до ~ 3,2 × 10 ⁶ микроглии в неонатальном мозге , но за счет снижения чистоты до ~ 97%.

В данном случае мы демонстрируем быстрый и рафинированный без колонн CD11b магнитной сепарации протокола (Рисунок 1). Этот усовершенствованный метод остается, насколько это возможно, как наш оригинальный метод без колонн, так как цена комплекта магнитной сепарации CD11b является то же самое. Время завершения уменьшается в два раза, что может иметь решающее значение для максимизации выживаемости клеток и выход. Следует отметить, что чистота достигается с этим оптимизированным метода составляет ~> 99%, значительное улучшение по чистоте , достигнутой от первоначального способа без колонн , разработанного нашей лабораторией ^15. Самое главное, что CD11b-PEне используется, исключая необходимость инкубировать в защищенном от света и позволяет использовать красный канал для флуоресцентной микроскопии. И, наконец, как в оригинальном способе CD11b, астроциты фракции с высоким выходом и чистоты получается с этим усовершенствованным способом. Астроциты являются наиболее многочисленные глиальные клетки в ЦНС, что приводит к тому , что их гомеостатические функции являются обязательными в отношении патофизиологии ^18. Эти глиальные клетки играют важную роль в различных физиологических функций, таких как формирование гематоэнцефалический барьер, обеспечивая питательную поддержку, поддерживая нейромедиатора гомеостаза, образуя глиальные рубцы в ответ на повреждение, нейропротекции, обучения и памяти, а также нейровоспаления, иллюстрирующих их следственную потенциал в глиальных биология ^19. Морфология и функциональность микроглии и астроцитов уже было установлено с помощью конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга, количественное в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР QRT), GРисс анализа нитрита, а также мультиплексной цитокин анализа Luminex. Уточнение предусмотрено этот протокол обеспечивает повышенную уверенность , относящуюся к микроглии или астроцитов чистоты, более широкому применению флуоресцентной микроскопии с наличием красного канала, а также экономит время, все из которых имеет важное значение для экспериментов в пробирке.

протокол

Использование животных и протокольные процедуры были утверждено и контролируется по уходу и использование комитет Институциональных животных (IACUC) в Университете штата Айова (Ames, IA, США) по

1. Выращивание смешанных глиальных культур

1. Обезглавьте 1- 2 дневных щенков быстро с 5,5-дюймовыми работающими ножницами, и сразу же поместить головы в 50 мл пробирку на льду. Обратите внимание, что это обезглавливание является режим эвтаназии.
2. В ламинарном воздушном потоке, сделать небольшой разрез в черепах и мозговых оболочках с использованием 4,5 - дюймовыми прямыми микро-рассечением ножницы. Начало резки от хвостового конца до конца рострального (нос). Получить под кожу, используя отверстие , образованное обезглавливание.
   1. После разреза, очистить один из полушарий в сторону. Затем с помощью пару изогнутого или загнутого пинцета, чтобы удалить весь мозг.
3. Погрузить мозг (ы) в новом 50 мл пробирку, содержащую 0,25% трипсин-ethylenediaminetetraacetели кислоту (ЭДТА) в течение 15 мин в С водяной бане при 37 °. С помощью 2 мл трипсина-ЭДТА в мозге.
4. Промыть мозг (ы) со свежей ростовой среде (10% FBS, DMEM / F12, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% L-глутамина, 1% пирувата натрия и 1% заменимых аминокислот) путем добавления и удаления СМИ. Повторите 4 раза.
5. Для каждого мозга, пластины две Т-75 колбы, содержащей культуральную среду. Поэтому, добавляют 2 мл питательной среды в мозг к трубке. Таким образом, это будет эквивалент 1 мл гомогенизированного мозга с 8-9 мл питательной среды в Т-75 колбу.
6. Однородный растиранием мозг (ы) с пипетками различных размеров диафрагмы, в порядке от наибольшего к наименьшему. Когда видно , что ткани мозга не уменьшается, переход к следующей пипетке. В конце растирания, подвеска должно быть ясно, без каких - либо видимых кусков.
   1. Используйте 25 мл пипетки, 5 мл пипетки, а затем 10 мл пипетки последовательно.
7. Передайте каждый гомогенenous суспензии мозга через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы сделать его в одной клеточной культуре.
8. Для каждого гомогенизированного мозга, пластинчатые две Т-75 колбы, содержащие культуральную среду, как описано на стадии 1.5 (1 мл гомогенизированного мозга с 8-9 мл питательной среды в Т-75 колбу).
9. Изменение питательной среды после 6 дней и расти до изоляции на 16 - ^й день.

2. Выделение клеток микроглии

1. Через 16 дней, удалить культуральную среду из колбы и поместите его в свежей пробирке 50 мл. Добавьте 3 мл 0,25% трипсин-ЭДТА к каждому Т-75 колбу. Встряхните колбы в течение 5 мин при комнатной температуре на орбитальном шейкере.
   1. Центрифуга удаляют ростовую среду при 0,4 мкг в течение 5 мин и использовать для остановки трипсина-ЭДТА реакции в последующей стадии.
2. После встряхивания в течение 5 мин, добавляют минимум 4 мл среды роста (свежей или использованной среды из 2.1.1), чтобы остановить трипсина-ЭДТА реакции.
3. Растирают, чтобы гарантировать, что все сгезов были отделены.
4. После растирания, проходят клетки через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы сделать его в одной культуре клеток, выполнить подсчет клеток, а затем спином вниз клеток при 0,4 мкг в течение 5 мин.
5. На каждые 100 × 10 ⁶ клеток (примерно 15 х Т-75 колбы), используют 1 мл Рекомендуемый носитель (2% FBS, DPBS (кальций и магний хлоридов), 1 мМ ЭДТА) , чтобы ресуспендируют осадок клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги приспособлены для разделения 1 мл.
6. Возьмите 5 мл полистирола пробирку, добавляют 1 мл Рекомендованный СМИ, и отметьте мениск. Добавить Рекомендуемый носитель до 2,5 мл, и отметьте это, как хорошо. Отменить Рекомендуемый носитель и передавать ресуспендировали клетку к полистирольной трубке 5 мл.
7. Добавьте 50 мкл сыворотки крысы на каждые 1 мл суспендированных клеток. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Приготовьте коктейль выбора путем смешивания 25 мкл компонента А и 25 мкл компонента В. Эти компоненты являются собственностью.
9. Добавить 501; л выбора коктейля к клеткам. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
   Примечание: Для получения более чистых культур, повторите шаг 2,9 (рекомендуется, но не обязательно).
10. Вихревые микросферы в течение 45 сек. Добавьте 80 мкл микросфер на 1 мл образца. Инкубирую в течение 3 мин при комнатной температуре.
11. Довести объем до 2,5 мл в пробирку полистирола путем добавления Рекомендуемый носитель.
12. Поместите трубку в магните в течение 3 мин при комнатной температуре. Регулировка инкубации повысить чистоту. Медленно вылейте Рекомендуемый носитель в 15 мл трубки с магнитом еще в полистирольной трубке.
13. Повторите шаг 2.12 еще три раза. Дополнительное магнитное инкубирование может быть выполнено, чтобы повысить чистоту.
14. Добавьте 3 мл среды роста и подсчет количества клеток с использованием счетчика клеток.
15. Пластина клетки, соответственно, в поли-D-лизине (PDL) для пластин -покрытия обработок. Относиться к клеткам через 48 ч после посева пластин inPDL-покрытия. Это позволяет клеткам восстановиться после стресса разделения.
    Примечание: Cheск чистоты культуры с использованием иммуноцитохимии , как описано выше ^15.
16. Пластинчатый негативную фракцию (собранную в 15 мл трубки), которая в основном содержит астроциты, в Т-75 колбах в среде роста.
17. После того, как по меньшей мере 6 ч инкубации в 37 ° C инкубатор, изменить среду, и пусть растут O / N. Разделить астроциты на следующий день для лечения.

Результаты

Микроглия изолированы с использованием набора CD11b-позитивной селекции II, имеют высокую чистоту

Первичные микроглии мыши были выделены с использованием вышеуказанного протокола и высевали на покровные поли-D-лизин-покрытием, чтобы про?...

Обсуждение

Старые способы микроглии изоляции имеют ограниченные извлечения, которые не подходят для различных белков анализов методом вестерн-блоттинга и РНК с помощью анализа QRT-PCR. Дифференциальное сцепление и мягкие методы трипсина два общих подход с низкими выходами микроглии ^13,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360070
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamine (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	13H469
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190250