Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Zusammenfassung

Mikroglia sind die primären Responder auf Zentralnervensystem Beschimpfungen; bleibt jedoch viel Unbekanntes über ihre Rolle bei der Regulierung der neuroinflammation. Mikroglia sind mesodermalen Zellen, die in der Vermessung entzündliche Stress ähnlich wie Makrophagen funktionieren. Der klassische (M1-Typ) und alternativer (M2-Typ) Aktivierungen von Makrophagen haben auch Mikroglia in dem Bemühen, erweitern das darunter liegende Zusammenspiel dieser Phänotypen haben in neuroinflammatorische Bedingungen wie Parkinson, Alzheimer und Huntington-Erkrankungen besser zu verstehen. In - vitro - Experimente unter Verwendung von primären Mikroglia bieten schnelle und zuverlässige Ergebnisse , die auf die in - vivo - Umgebung erweitert werden können. Obwohl dies ein klarer Vorteil gegenüber in vivo Experimenten Mikroglia zu isolieren , während eine adäquate Ausbeuten optimale Reinheit zu erreichen eine Herausforderung gewesen. Gängige Methoden zur Zeit in Gebrauch entweder leiden unter niedriger Erholung, geringe Reinheit, oder beides. Wir berichten hier über DMonstrate eine Verfeinerung der säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren, die eine hohe Zellgewinnung und eine verbesserte Reinheit in der Hälfte der Menge an Zeit erreicht. Wir schlagen vor, diese optimierte Methode als sehr nützliches Modell der primären Mikroglia-Isolierung für die Zwecke der neuroinflammation und Neurodegeneration zu studieren.

Einleitung

Mikroglia sind Myb unabhängige Makrophagen mesodermalen Ursprungs, die von c-kit + / CD45- unterscheiden erythromyeloid Vorläufern in den Blutinseln des Dottersacks ^{1, 2.} Sobald embryologischen Mikroglia das zentrale Nervensystem (ZNS) kolonisiert haben, Übergangs- sie von einer zu einer verästelten amoeboid Form ^3. Diese Erwachsenen Mikroglia als surveillant klassifiziert , da ihre dynamische Verzweigungen das gesunde Hirnparenchyms für mögliche Beleidigungen Sonde ^4. Obwohl nur Mikroglia auf etwa 10% der Bevölkerung CNS Zelle beitragen, ihre Fähigkeit , untereinander zu tile gewährleistet maximaler Abtastung des Parenchyms ^{4, 5.} Gefahren-associated molecular patterns (DAMPS), wie beispielsweise α-Synuclein ^{6, 7} und Amyloid-β ⁸ oder pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , wie beispielsweise Lipopolysaccharid (LPS) ^9, aktiviert klassisch Mikroglia eine entzündliche Reaktion durch Reversion zum amoeboid aktiven Zustand und die Produktion von Stickstoffmonoxid, Tumornekrosefaktor-α (TNF & agr;), Interleukin 1β gekennzeichnet Förderung (IL-1β), IL-6, IL-12 und das Chemokin CC motif Ligand 2 ^{9, 10, 11.} In neuroinflammatorischen Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, in denen pathogene α-Synuclein angesammelt hat, ist eine neurodegenerative Zyklus von dem Tod von dopaminergen Neuronen geschaffen, die mehr aggregierte α-Synuclein lösen, weitere klassische Aktivierung der Mikroglia ⁷ zu fördern. Ähnlich wie bei peripheren Makrophagen, Mikroglia kann auch die Fähigkeit hat, alternativ in der Gegenwart des anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 aktiviert, so dass ihnen die potenten gebenial neuronaler Reparatur zu fördern und zu dämpfen Entzündungen ^{2, 11.} Abgesehen von ihren immunologischen Funktionen im ZNS, Mikroglia wurden als vital Regulator der neuronalen Schaltkreise beschrieben von Synapsen während der Entwicklung Beschneiden. Zum Beispiel haben Cx3cr1- KO - Mäuse weniger dichte Mikroglia und reduziert synaptic pruning, was zu einer Überfülle von dendritischen Dornen führt, unreife Synapsen, und die elektrophysiologischen Muster eines unterentwickelten CNS ^12. diese physiologische Komplexität und die vielfältigen funktionalen Rollen des Mikroglia in der Homöostase des ZNS zu verstehen, ist für Therapeutika Targeting neurodegenerativen Erkrankungen zur Suche kritisch.

Im Bereich der Neuroimmunologie, sind in - vitro - Experimente sehr wünschenswert , wegen der größeren Machbarkeit für mechanistische Studien, die geringer Wartungskosten, und für weniger zeit- und arbeitsintensiv. FurthermoRe, ist die Fähigkeit, Zellpopulationen zu isolieren, kritisch, um die Funktionalität dieser Zielzellen unter vorgeschriebenen Bedingungen zu beschreiben. Zahlreiche Mikroglia - Isolierungsmethoden existieren, aber sie sind durch ihre Fähigkeit begrenzt relativ hohe Zahlen und Reinheit für breites Experimentieren ^{13, 14, 15} zu erhalten. Zum Beispiel ist ein Cluster der Differenzierung 11b (CD11b) ein gemeinsamer Oberflächenmarker von Monozyten, Makrophagen und Mikroglia ^16. Durch Ausnutzen CD11b wurde ein Verfahren zur magnetischen Trennung zunächst als säulenbasierte Ansatz beschrieben , dass ~ 99,5% Reinheit ergab und ~ 1,6 × 10 ⁶ pro Mikrogliazellen neonatalen Gehirn ^17. Unser Labor vor kurzem entwickelte eine säulenfreien CD11b magnetischen Trennverfahren ^15, die wir mit Tagging CD11b mit einem monoklonalen Antikörper in einem Polystyrol - Röhrchen durchgeführt , konjugiert an Phycoerythrin (PE). Ein bispezifischer secondary Antikörper an PE und Dextran-Komplexe mit dem PE. Einmal gebunden, Dextran-beschichtete magnetische Partikel eingebracht, die an das Dextran Ende des Antikörper-Komplex binden. Schließlich wird die Polystyrol-Röhrchen in einem Magnet für Mikroglia-Isolierung angeordnet. Dieser Ansatz verdoppelte sich die Ausbeute auf ~ 3,2 x 10 ⁶ Mikroglia pro neonatalen Gehirn , sondern auf Kosten der Reinheit reduziert auf ~ 97%.

Hier zeigen wir , eine schnelles und verfeinertes säulenfreien CD11b magnetische Trennung Protokoll (Abbildung 1). Diese verbesserte Methode bleibt wie möglich als unsere ursprüngliche säulenfreie Methode, da der Preis des CD11b magnetische Trennung Satzes gleich ist. Die Ausführungszeit wird in die Hälfte reduziert, was zur Maximierung der Ausbeute und das Überleben der Zellen von entscheidender Bedeutung sein kann. Bemerkenswerterweise ist die Reinheit von diesen optimierten Verfahren erreicht ~> 99%, eine deutliche Verbesserung gegenüber der Reinheit von dem ursprünglichen säulenfreien Verfahren durch unser Labor ¹⁵ entwickelt erreicht. Am wichtigsten ist, CD11b-PEnicht verwendet wird, von der Licht entfällt die Notwendigkeit, und die Verwendung des roten Kanal für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht inkubieren entfernt. Schließlich ist, wie in dem ursprünglichen CD11b-Verfahren, eine astrozytären Fraktion von hohen Ausbeute und Reinheit mit diesem verbesserten Verfahren erhalten. Astrozyten sind die zahlreichen Gliazellen im ZNS, die Idee führt , dass ihre homöostatischen Funktionen ¹⁸ in Bezug auf Pathophysiologie unverzichtbar sind. Diese gliale Zellen spielen eine Rolle bei verschiedenen physiologischen Funktionen wie die Blut-Hirn-Schranke bilden, nährstoff Unterstützung, Neurotransmitter Aufrechterhaltung der Homöostase, bilden glial Narben in Reaktion auf eine Verletzung, Neuroprotektion, Lernen und Gedächtnis, und Neuroinflammation, beispielhaft ihre investigatory Potential in glial Biologie ^19. Morphologie und Funktionalität von Mikroglia und Astrozyten wurden durch konfokale Mikroskopie, Western-Blot, quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), G ermitteltRiess Nitrit-Test und der Multiplex-Zytokin-Assay Luminex. Die Verfeinerung dieses Protokoll zur Verfügung gestellt bietet mehr Vertrauen zu Mikroglia oder Astrozyten Reinheit, eine breitere Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie mit der Verfügbarkeit des roten Kanals betreffen, und spart Zeit, die alle für die in - vitro - Experimente wichtig sind.

Protokoll

Die Verwendung der Tiere und Protokollverfahren genehmigt und überwacht von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Iowa State University (Ames, IA, USA)

1. Anbau von Mixed Gliakulturen

1. Köpfen 1- 2 Tage alten Welpen schnell mit 5,5-Zoll-Betriebs Schere, und legen die Köpfe sofort in ein 50 ml Röhrchen auf Eis. Beachten Sie, dass diese Enthauptung der Modus der Euthanasie ist.
2. In einer laminaren Luftstrom Haube, macht einen kleinen Schnitt in dem Schädel und Hirnhaut mit 4,5 Zoll gerade Mikro-Dissektionsscheren. Beginnen vom Schwanzende zum rostralen Ende Schneiden (Nase). Holen Sie unter der Haut durch die Öffnung durch die Enthauptung gebildet werden.
   1. Nach der Inzision abschälen einer der Halbkugeln an der Seite. Dann mit einem Paar von gekrümmten bzw. Haken Pinzette das gesamte Gehirn zu entfernen.
3. Tauchen Gehirn (s) in einem neuen 50-ml-Röhrchen, das 0,25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetaß Säure (EDTA) für 15 min in einem 37 C-Wasserbad °. Verwenden Sie 2 ml Trypsin-EDTA pro Gehirn.
4. Waschen Sie das Gehirn (s) mit frischem Wachstumsmedium (10% FBS, DMEM / F12, 1% Penicillin / Streptomycin, 1% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und 1% nicht-essentielle Aminosäuren) durch Hinzufügen und Entfernen der Medien. Wiederholen Sie diesen 4x.
5. Für jedes Gehirn, die Platte zwei T-75-Kolben Wachstumsmedien enthalten. Daher fügen Sie 2 ml Wachstumsmedium pro Gehirn auf das Rohr. So wird es ein Äquivalent von 1 ml der homogenisierten Gehirn mit 8-9 ml Wachstumsmedium pro T-75-Kolben sein.
6. Homogenisieren durch Verreiben des Gehirns (n) mit Pipetten von Größen Öffnung unterscheiden, um vom größten bis zum kleinsten. Wenn es sichtbar ist , dass das Hirngewebe nicht immer kleiner, Übergang zur nächsten Pipette. Am Ende des Verreiben sollte die Suspension klar sein, ohne sichtbare Klumpen.
   1. Verwenden einer 25-ml-Pipette wurden 5 ml-Pipette und dann eine 10 ml-Pipette sequentiell.
7. Übergeben Sie jede homogenous Gehirnsuspension durch ein 70 & mgr; m Zellsieb es in einer einzigen Zellkultur zu machen.
8. Für jedes homogenisierte Gehirn Platte zwei T-75-Kolben, enthaltendes Wachstumsmedium, wie in Schritt 1.5 (1 ml homogenisiert Gehirn mit 8-9 ml Wachstumsmedium pro T-75 Kolben) beschrieben.
9. Ändern Nährmedien nach 6 d und wachsen , bis Isolation am ^16. Tag.

2. Isolierung von Mikroglia-Zellen

1. Nach 16 Tagen, das Wachstumsmedium aus dem Kolben entfernen und sie in einer frischen 50 - ml - Röhre platzieren. 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA zu jedem T-75 - Kolben. Schütteln Sie die Kolben für 5 min bei RT auf einem Schüttler.
   1. Zentrifuge entfernt das Wachstumsmedium bei 0,4 × g für 5 min und verwendet, um die Trypsin-EDTA-Reaktion in dem nachfolgenden Schritt zu stoppen.
2. Nach Schütteln für 5 Minuten, ein Minimum von 4 ml Wachstumsmedium (frisch oder den verwendeten Medien aus 2.1.1) in die Trypsin-EDTA-Reaktion zu stoppen.
3. Man reibt, um sicherzustellen, dass alle cells haben abgenommen worden ist.
4. Nach Digerieren, um die Zellen durch einen 70 & mgr; m Zellsieb passieren sie in eine einzige Zellkultur zu machen, eine Zellzählung durchzuführen, und dann dreht die Zellen bei 0,4 × g für 5 min nach unten.
5. Für jede 100 x 10 ⁶ Zellen (etwa 15 x 75 T-flasks) Verwenden 1 ml Empfohlene Medien (2% FBS, DPBS (Calcium und Magnesiumchlorid-frei), 1 mM EDTA) , um das Zellpellet resuspendieren.
   HINWEIS: Alle folgenden Schritte für eine 1-ml-Trennung zugeschnitten sind.
6. Nehmen Sie ein 5 ml Polystyrolröhrchen, 1 mL Empfohlene Medien und den Meniskus markieren. In Empfohlene Medien bis zu 2,5 ml und markieren Sie diese auch. Verwerfen Sie den Empfohlene Materialien und übertragen die resuspendierten Zellen in den 5 ml Polystyrolröhrchen.
7. Zugeben von 50 & mgr; l Rattenserum für je 1 ml suspendierter Zellen. Inkubieren für 5 min bei RT.
8. Bereiten Auswahl-Cocktail durch 25 & mgr; l der Komponente A gemischt und 25 & mgr; l der Komponente B. Diese Komponenten proprietär sind.
9. In 501; L des Auswahl Cocktail an die Zellen. Inkubieren für 5 min bei RT.
   HINWEIS: Bei reinen Kulturen, wiederholen Sie den Schritt 2.9 (empfohlen, aber nicht zwingend).
10. Vortex-Mikrokugeln für 45 s. In 80 & mgr; l Mikrokügelchen pro 1 ml Probe. Inkubieren für 3 min bei RT.
11. Bringen Sie das Volumen auf 2,5 ml in Polystyrolröhrchen durch die Zugabe von Empfohlene Materialien.
12. Setzen Sie den Schlauch in den Magneten für 3 min bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Inkubation Reinheit zu erhöhen. ausgießen langsam Empfohlene Medien in ein 15-ml-Röhrchen mit dem Magneten noch in den Polystyrol-Röhrchen.
13. Wiederholen Sie Schritt 2.12 drei weitere Male. Zusätzliche magnetische Inkubationen können zu erhöhen Reinheit durchgeführt werden.
14. In 3 ml Nährmedien und zählen die Anzahl der Zellen einen Zellzähler verwendet wird.
15. Platten Zellen entsprechend in Poly-D-lysin (PDL) -beschichtete Platten für die Behandlungen. Man behandelt die Zellen 48 h nach inPDL beschichteten Platten Säen. Auf diese Weise können die Zellen aus dem Stress der Trennung erholen.
    HINWEIS: Check die Reinheit der Kultur unter Verwendung von Immuncytochemie wie zuvor beschrieben ^15.
16. Plattieren der negativen Fraktion (in einem 15 ml-Röhrchen gesammelt), die meist Astrozyten, in T-75-Kolben in dem Wachstumsmedium enthält.
17. Nach mindestens 6 h Inkubation bei 37 ° C-Inkubator, um das Medium zu ändern und läßt es O / N wachsen. Teilen Sie die Astrozyten am nächsten Tag für Behandlungen.

Ergebnisse

Mikroglia isoliert CD11b Positive Selection Kit II hohe Reinheit

Primäre Maus Mikroglia wurden unter Verwendung des oben genannten Protokolls isoliert und ausplattiert auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser, die Reinheit der Isolation zu prüfen. Zehntausend Zellen wurden pro Napf und immunzytochemische Analyse ausplattiert wurde mit ionisiertem Calcium bindende Adaptormolekül 1 durchgeführt (Iba1) als Marker für Mikroglia...

Diskussion

Ältere Mikroglia-Isolationsmethoden haben begrenzte Wiederherstellungen, die nicht geeignet sind für verschiedenes Protein durch Western-Blot-Analysen und RNA-Analysen durch qRT-PCR. Die differentielle Adhärenz und milde Trypsinisierung Methoden sind zwei gemeinsame Ansätze mit niedrigeren Ausbeuten Mikroglia ^{13, 14, 15.} Die Säule basierte CD11b Ansatz hat auch eine geringe Erholung, aber erreicht eine höhere Reinheit als...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasySep CD11b Separation Kit II	StemCell Technologies	18970
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)	Life Technologies	11330057
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360070
MEM Non-essential amino acids (100x)	Life Technologies	11140050
L-Glutamine (100x)	Life Technologies	25030081
EDTA	Fisher Scientific	AM9260G
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	13H469
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco by Life Technologies	25200
Dulbecco's PBS (DPBS)	Gibco by Life Technologies	14190250