面对小鼠血液制备

摘要

描述了制备小鼠颈动脉和主动脉的方法。当用特异性抗体进行免疫荧光染色时，这样的制剂使得我们能够研究蛋白质的定位和通过共聚焦显微镜在整个血管壁内鉴定细胞类型。

摘要

石蜡包埋组织的切片常规用于研究组织组织学和组织病理学。然而，很难从这些部分确定三维组织形态。此外，检查的组织切片可能不包含组织内为进行研究目的所必需的区域。后一种限制阻碍血管的组织病理学研究，因为血管病变以聚焦方式发展。这需要一种使我们能够从其表面到更深的区域调查血管壁的广泛区域的方法。一个完整的血管准备满足了这一要求。在本文中，我们将展示如何使小鼠主动脉和颈动脉进行面部准备，并对共聚焦显微镜和其他类型的荧光成像进行免疫荧光染色。

引言

通过光学显微镜进行组织病理学研究，常规处理生物组织三维片段进行石蜡包埋，然后进行切片和染色。石蜡包埋的组织样品可以在所有三维中为几毫米。然而，为了光学显微镜的目的，它必须首先切片，使得光可以通过然后染色，使得薄部分产生足够的成像对比度。由于切片样品的厚度通常为5-10微米，所以每次只能看到整个样品的二分之一。可以收集连续的部分，并且在单独成像每个部分之后，对3D图像进行计算机辅助重建，但是这是一个繁琐的工作。血管的组织病理学，特别是研究动脉粥样硬化的发病机制，具有独特的问题。动脉粥样硬化是一种发展的重点疾病局部发生血流紊乱的地区。此外，该疾病是在内膜内开始的，一个由大量动脉的内皮细胞和细胞外基质的单层组成的薄组织。由于这些原因，使用分段血管来定位和研究早期病变是一个挑战，因为可以容易地错过切片病变。即使部分确实包括患病区域，在介质和外膜中只能看到含有内皮细胞和其他血管壁细胞的5-10μm部分。

整个安装面（发音为änfäs）的准备工作使我们可以从主动脉根部一直到髂总动脉，调查血管表面的广泛区域，如整个主动脉。使用这样的标本用特异性抗体和其他特异性探针染色，可以确定病变的位置，同时也可以在内皮细胞中发生各种分子事件动脉粥样硬化形成，如蛋白质的表达，定位和翻译后修饰的变化。除了研究动脉粥样化形成外，在面部制剂中观察到的内皮细胞形状被用作区域时间平均血流模式的指标。这些数据对于研究原位内皮细胞的机械信号是很重要的。为此，常规的组织学横切血管是无用的。因此，对于血管医学和生物学，特别重要的是获得一种用于制造血管的面部制备技术，其允许观察血管表面的广泛区域以及血管的较深的地下区域。

正如Jelev和Surchev ^1所述 ，血管生物学家已经开发了各种观察血管内衬的方法。一些巧妙的方法是在20世纪40年代和50年代开发的。他们使用这些方法能够研究排列血管内表面的内皮细胞的基本组织。然而，由于这些准备工作的准备方法（所谓的Hautchen方法^2,3,4或容器表面^5的剥离）以及样品染色的方式，并不总是可以获得不间断的形态信息从血管表面进入血管壁的较深的区域。全面安装和面部血管制剂联合免疫荧光染色使我们不仅可以研究这些细胞内皮细胞的形态和蛋白质表达和定位，而且还将这些研究扩展到血管壁的内皮下区域。早期研究使用血管，面部免疫荧光染色剂的制剂在20世纪80年代开始出现^{6 ，}随着激光扫描共聚焦显微镜和最近的多光子显微镜的出现，现在可以获得免疫荧光染色的面容器样品中的血管壁结构的清晰的对焦图像以及活体动物中的血管网络这些基于计算机的成像技术创建了对焦光学分割图像，并且通过堆叠这样的图像，可以获得组织中血管壁和血管网络的重建3D图像，另外，一个可以生成沿着重建图像^12,13的Z轴形成的部分的图像。

在本文中，我们将说明一种制备小鼠主动脉和颈动脉免疫荧光染色的方法。面对准备即使在这些容器被实验操作之后也可以制造。例如，可以部分地连接颈动脉，然后在这样的手术之后进行面部制备。因此，我们还将在本文中描述我们如何在颈动脉上进行部分结扎。与大型动物如大鼠，兔子和人类进行类似的制备相比，小鼠血管的尺寸较小且更易碎，因此需要对外科手术分离血管进行处理以及进行抗体染色和显微镜检查。因为最常用的遗传修饰动物模型是老鼠，因此许多研究者在不伤害它们的情况下处理小鼠血管变得至关重要。在本手稿中，我们将介绍如何在小鼠主动脉和颈动脉进行面部准备时处理小鼠血管。为了展示的目的，我们将使用野生型C57 / b6小鼠。

研究方案

小鼠部分颈动脉结扎和分离小鼠主动脉和颈动脉用于面部免疫染色的方案由机构动物护理和使用委员会（IBT 2014-9231）批准。

左侧部分颈动脉结扎

1. 通过在桌子上放置一个12英寸x 14英寸的加热垫来准备手术空间，并用大的干净的手术罩盖住垫子和桌面。调整吊架的臂，使立体显微镜的视野位于加热垫的中心区域。
2. 打开桌面上的加热垫，并将3设置控制拨盘设置为中等热位。在此温度设置下，外科手术板表面（见1.6.1）将为38-40°C。
   1. 将一个干净的笼子放在另一个加热垫上。如上所述打开加热垫。这种笼子将用于手术后的恢复（见1.16）以及房屋。
3. 在手术台上放置包含虹膜剪刀（1对），组织钳（1对），超级夹钳（2对），弹簧剪刀（1对），钝头牵开器（1对; 2.5 mm宽）的高压灭菌消毒袋， （1），消毒6-0丝线缝合线，棉花贴片机，迷你棉花贴纸机，手术用纱和2"×2"纱布海绵。还放置一个含有70％乙醇的挤压瓶，另一个装有洗必太洗手液的外科手术台。
4. 称重一只老鼠需要体重来确定适当的镇痛量，这将在手术前立即进行。
5. 将鼠标放入感应室。
6. 打开氧气罐和麻醉剂蒸发器，以便在感应室中麻醉鼠标。维持2％的异氟烷​​水平。鼠标停止移动前需要3-5分钟。
   1. 鼠标正在麻醉时在立体显微镜下放置一小块无菌手术罩（24英寸×24英寸）以创建手术表面。然后将丙烯酸手术板（已用70％酒精清洗）放在悬垂的表面上。因此，手术板应该在加热垫上，但是由两层手术包装隔开。
7. 当鼠标停止在感应室中移动时，将鼠标移动到手术前准备区域，并将其鼻子定位到与蒸发器（2％异氟烷）连接的鼻锥中。使用电动修剪器或脱毛剂洗剂去除颈部周围的头发。我们推荐脱毛乳液，因为这种方法不会产生松散的头发片，难以从外科手术区域彻底清除。
8. 将鼻锥放在适当的位置，将鼠标移动到手术板上。
   1. 将左右前爪向下拉到手术板。将两腿后腰缠住在鼠标的右侧。这导致鼠标体的轻微旋转，使得鼠标的颈部区域的左侧变得更好地定位用于手术。
9. 用70％酒精，氯己定手术擦洗，再用70％酒精消毒切口区域。用除了颈部切口区域的灭菌手术盖子盖住鼠标。
10. 通过脚趾确认通过腹膜内或皮下注射完全麻醉并给予镇痛（卡洛芬3-5mg / kg）。
11. 在解剖显微镜下，使用手术刀或虹膜剪刀在颈部周围进行腹侧中线切口。
    注意:我们使用剪刀，因为立体显微镜的工作距离是有限的，这使得难以使用手术刀。
12. 将左颈总动脉（LCCA）推开，将覆盖血管的唾液腺重新放置在左侧nimal。
13. 识别手术领域的所有血管（ 图1 ）。 LCCA分叉到左内颈动脉（ICA）和左外颈动脉（ECA）。浅层甲状腺动脉（STA）来自内侧ECA。枕叶动脉（OA）通常来自ECA，但在一些小鼠中，它起源于ICA。
14. 使用灭菌的6-0丝线缝合除OA外的所有动脉分支。要做到这一点，做以下两个连接。
    1. 轻轻取出左颈内动脉（ICA）周围和下方的结缔组织。用镊子抓住一条预切线6-0丝缝合（约2.5厘米），并将其通过动脉。使用另一对镊子，将缝合线拉长约1/3的长度并连接动脉。
    2. 以与上述相同的方式去除左外颈动脉（ECA）周围的结缔组织，并在左上甲状腺上进行结扎d动脉（STA）（ 图1 ）。注意不要损伤外科手术领域的神经纤维。
15. 当进行这些连接时，将唾液腺返回原来的位置，并放置2-3滴无菌盐水使手术区水合。使用6-0涂层的维克罗缝线缝合皮肤。
16. 手术后，将鼠标置于预热笼内（见1.2.1）。鼠标应该在5分钟内醒来，开始走动。一旦确认鼠标的行为正常，将笼子带到动物房间。
17. 在恢复前3天每天观察小鼠。只要实验要求在实验协议要求的各种条件下，鼠标就可以保持。可以在手术后的任何时间进行面部准备。

面部免疫染色

1. 通过吸入过量安乐死小鼠CO ₂ 。
2. 将鼠标放在仰卧位（腹侧向上）位置到解剖板上。
3. 通过使用虹膜剪刀进行中线切口暴露腹腔。
4. 通过将胸骨横向切割到胸骨来暴露胸腔。
5. 在腔静脉中切口或切断股动脉以排出血液。
6. 将插入重力灌注装置（120厘米水压）的26 G针插入左心室的顶点，并用含有肝素（40 U / mL）的盐水溶液灌注循环系统。继续灌注，直到从切口中流出的盐水变得清晰。
7. 将灌注系统从生理盐水切换到PBS（磷酸盐缓冲盐水）中含有4％多聚甲醛的固定溶液，并继续灌注5分钟。
8. 使用平头剪刀和镊子收获主动脉和左颈动脉和右颈动脉，并置于含有固定在冰上的50mL锥形管中。
9. 在解剖显微镜下将血管转移到含有PBS的培养皿中，小心地取出附着于主动脉和颈动脉的脂肪和结缔组织。将主动脉和颈动脉纵向分离并分离以暴露内皮（ 图2 ）。
10. 将每个容器分别转移到含有0.5mL渗透溶液（PBS中0.1％Triton X-100）的12孔板的孔中。在室温（RT）摇动下使血管渗透10分钟。
11. 用PBS短暂洗涤。
12. 为了阻断非特异性抗体结合位点，在TTBS（含有2.5％吐温20的Tris缓冲盐水（TBS））中，将来自已经制备了二次抗体的动物物种的10％正常血清中的血管孵育30分钟，在RT摇摆。
13. 孵育具有在10％正常血清（如上所述）的TTBS中适当稀释的初级抗体的血管在4℃下摇摆过夜。水平必须确定每种抗体的稀释度。
14. 进行以下对照染色。
    1. 用TTBS而不是一级抗体孵育血管，然后与第二抗体一起孵育。
    2. 孵育含TTBS的血管，其中含有一级抗体的相同动物（物种）的非免疫（或预免疫）血清或Ig，然后与第二抗体一起孵育。
    3. 省略与二级抗体孵育。必须以相同的方式处理这些对照样品，同时进行用特异性抗体染色的同时。
15. 用TTBS洗涤血管3次，每次10分钟，在室内摇摆。
16. 用在10％正常血清（如上所述）的TTBS中适当稀释的荧光标记的二次抗体孵育1小时，在室温下摇动。可以同时进行DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）的核染色通过在H ₂ O中加入1 / 5,000体积的含有5mg / mL DAPI的DAPI储备溶液。
17. 用TTBS洗涤3次，每次10分钟，摇匀。
18. 在PBS中短暂冲洗。
19. 将一滴防褪色试剂放在玻璃罩（22 mm x 50 mm）上，并将血管置于玻璃上，使内皮朝下。
20. 在血管上放置载玻片（22 mm x 75 mm），同时避免陷入气泡。
21. 将幻灯片放在干净的实验室擦拭物（ 例如 Kimwipe）上，并用两块实验室擦拭物盖住幻灯片。在载玻片上轻轻放置3.5公斤重量（ 例如使用一瓶水放在厚厚的书上），最多5分钟，以使平面血管样本平坦化。
22. 取出重量，擦去盖玻片周围的多余溶液。
23. 在盖玻片的四个角落涂抹指甲油，将幻灯片放在幻灯片中，盖玻片朝上，并保持在黑暗中（或4℃）过夜。该过程使组织进一步变平，并使得更容易以高放大倍率进行显微镜检查。
24. 使用指甲油完全密封盖玻片。
25. 指甲油干燥后立即进行显微镜检查。
26. 如果需要，将载玻片存放在-20°C。

结果

图3中显示了内皮的典型的面部免疫荧光图像。该图像显示了在肋间动脉（大暗蛋形区域）的开口附近获取的小鼠主动脉的单个光学部分。主动脉用抗VE-钙粘蛋白（绿色）和抗VCAM-1（血管细胞粘附分子-1）（红色）进行双重染色。每个内皮细胞在粘附连接处用绿色线性染色来概括。由于样本的微小不均匀，一些粘附点在该光学部分之外。在已知发生扰动血流的?...

讨论

当处理小鼠血管时，重要的是记住内皮是脆弱的，并且任何过量的机械力将损伤内皮细胞。例如，如果容器被强力灌注，则血管壁破裂或分离，当使用手动注射器灌注脉管系统时，这可能容易发生。

为了获得恒定的灌注压力，我们使用120厘米水柱压力的重力灌注系统。据报道，不同于应变的小鼠的平均动脉压在130和170厘米H ₂ O ^14之间 。因此，我们使...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag	Fisher Scientific	NC9788429
12-well plates	Fisher Scientific	12556005
6-0 coated vicryl suture	Ethicon	J833G
AF488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24x24in	Cardinal Health	4024
Blunt retractors, 2.5mm wide	Fine Science Tools	18200-10
Caprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2x2	Cardinal Health	KC2146
Electric heating pad, 12X14	Fisher Scientific	NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Micro cover glass 22x50mm	VWR	48393059
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-18
normal goat serum	Equitech-Bio	GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Petri Dishes 100x15mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI	Life Technologies	P-36935
Puritan cortton swabs	VWR	10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators	VWR	82004-050
Round handled Needle Holder	Fine Science Tools	12076-12
Silk Suture 6/0	Fine Science Tools	18020-60
Spring scissors	ROBOZ	RS-5601
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-09
Super Grip Forceps	Fine Science Tools	00649-11
Transparent Dressing	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000