En Face Preparazione delle navi sanguigne del mouse

Riepilogo

Viene descritta una procedura per preparare preparazioni in faccia della arteria e dell'arto carotide del topo. Tali preparati, quando vengono colorati immunofluorescenti con anticorpi specifici, ci permettono di studiare la localizzazione delle proteine ​​e l'identificazione dei tipi di cellule nell'intera parete vascolare tramite la microscopia confocale.

Abstract

Sezioni di tessuti embedded di paraffina vengono utilizzati abitualmente per lo studio dell'istologia del tessuto e dell'istopatologia. Tuttavia, è difficile determinare ciò che la morfologia tissutale tridimensionale deriva da tali sezioni. Inoltre, le sezioni dei tessuti esaminati non possono contenere la regione all'interno del tessuto necessaria ai fini dello studio in corso. Questa ultima limitazione ostacola gli studi istopatologici dei vasi sanguigni poiché le lesioni vascolari si sviluppano in modo focalizzato. Ciò richiede un metodo che ci permette di rilevare un'ampia area della parete del vaso sanguigno, dalla sua superficie fino alle regioni più profonde. Una preparazione completa dei vasi sanguigni è in grado di soddisfare questo requisito. In questo articolo dimostreremo come fare preparazioni in faccia dell'arte del topo e dell'arteria carotide e di immunofluorescenziarle per la microscopia confocale e altri tipi di immagini a base di fluorescenza.

Introduzione

Per gli studi istopatologici mediante microscopia leggera, i pezzi tridimensionali di tessuti biologici sono trattati in modo ordinario per l'embedment di paraffina seguito da sezionamento e colorazione. Un campione di tessuto che è stato incorporato in paraffina può essere di parecchi millimetri in tutte e tre le dimensioni. Tuttavia, ai fini della microscopia leggera, deve essere prima sezionato in modo che la luce possa passare e poi venire macchiata in modo che la sezione sottile abbia abbastanza contrasto per l'imaging. Poiché gli esemplari tagliati sono di solito 5-10 μm di spessore, si vede solo una frazione molto piccola dell'intero campione in due dimensioni alla volta. È possibile raccogliere sezioni sequenziali e, dopo l'imaging di ogni sezione singolarmente, eseguire la ricostruzione assistita da computer delle immagini 3D, ma in realtà è un lavoro noioso. L'istopatologia dei vasi sanguigni, specialmente per studiare la patogenesi dell'aterosclerosi, presenta problemi unici. L'aterosclerosi è una malattia focalizzata che si sviluppaLocalmente in aree dove si verifica un flusso sanguigno disturbato. Inoltre, la malattia è iniziata nell'intima, un tessuto sottile costituito da un monostrato di cellule endoteliali e matrice extracellulare, di grandi arterie. Per queste ragioni, è una sfida per individuare e studiare le lesioni precoci utilizzando vasi sanguigni sezionati perché si può facilmente perdere la sezione della lesione. Anche se una sezione comprende un'area malata, si vedrà solo una porzione di 5-10 μm contenente cellule endoteliali e altre cellule della parete vascolare nei media e nell'adventitia.

Il tutto in faccia (pronunciato än fäs) i preparativi ci permettono di esaminare un'ampia area della superficie del vaso sanguigno come l'intero aorta dalla radice aortica fino alla comune arteria iliaca. Utilizzando un simile campione colorato con anticorpi specifici e altre sonde specifiche, si può individuare la localizzazione delle lesioni e anche dove si verificano vari eventi molecolari nelle cellule endoteliali congiuntamente wiAterogenesi come i cambiamenti nell'espressione, localizzazione e modificazioni posttranslazionali delle proteine. Oltre a studiare l'aterogenesi, la forma delle cellule endoteliali osservate nelle preparazioni en faccia viene utilizzata come indicatore del pattern di flusso sanguigno regionale. Tali dati sono importanti per studiare la meccanosignazione delle cellule endoteliali in situ. A questo scopo, non sono utili i vasi sanguigni a sezione trasversale istologica. Pertanto, per la medicina vascolare e la biologia, è particolarmente importante acquisire una tecnica per preparare preparazioni en vena dei vasi sanguigni che consente di osservare un'ampia area della superficie del vascello così come le aree più profonde del sottosuolo.

Come rivisto da Jelev e Surchev ¹ , i biologi vascolari hanno sviluppato diversi metodi per osservare la fodera dei vasi sanguigni in faccia. Alcuni metodi ingegnosi furono sviluppati negli anni '40 e '50. Usando questi metodi, sono stati In grado di studiare l'organizzazione fondamentale delle cellule endoteliali che fanno riferimento alla superficie interna dei vasi sanguigni. Tuttavia, a causa del modo in cui queste preparazioni sono preparate (il cosiddetto metodo Hautchen ^{2 , 3 , 4} o il peeling off della superficie del vaso ⁵ ) e il modo in cui il campione è stato macchiato, non è stato sempre possibile ottenere morfologie ininterrotte Informazioni dalla superficie del vaso nelle zone più profonde della parete del vaso sanguigno. La preparazione completa del vaso di faccia combinata con la colorazione dell'immunofluorescenza ci ha consentito non solo di studiare la morfologia delle cellule endoteliali e l'espressione e la localizzazione delle proteine ​​in queste cellule, ma anche estendere tali studi alla regione subendoteliale della parete del vaso. Studi iniziali che utilizzano vasi sanguigni in faccia preparati macchiati immunoflurezzi cominciarono a apparire negli anni '80 ^,F "> 7. Con l'avvento della microscopia confocale a scansione laser e della microscopia multifotonica di recente, è ora possibile ottenere immagini chiare in focus della struttura della parete dei vasi sanguigni in campioni vascolari immunofluorescenti e vascolari in animali vivi ^{8 , 9 , 10 , 11.} Queste tecniche di imaging basate su computer creano immagini a sezione ottica in focus e, impilando tali immagini, è possibile ottenere immagini ricostruite 3D della parete del vascello e della rete vascolare nei tessuti. Può generare immagini di una sezione realizzata lungo l'asse Z dell'immagine ricostruita ^{12 , 13} .

In questo articolo, illustreremo un metodo per la preparazione delle preparazioni in faccia del aorta del topo e dell'arteria carotide per la colorazione immunofluorescenti. I preparativi per il visoPuò essere fatto anche dopo che queste navi sono state manipolate in modo sperimentale. Ad esempio, un'arteria carotide può essere legata parzialmente e quindi una preparazione in faccia eseguita dopo una tale operazione. Per questo motivo, descriveremo anche in questo articolo come facciamo una legatura parziale sull'arteria carotidea. Rispetto alla fabbricazione di preparati simili da animali di grandi dimensioni, come ratti, conigli e umani, i recipienti del mouse sono di taglia piccola e più fragili, richiedendo così una maggiore cura per la manipolazione durante l'isolamento chirurgico dei vasi e preparandoli per la colorazione degli anticorpi e la microscopia. Poiché il modello animale più comunemente utilizzato per la modifica genetica è il topo, diventa critico per molti investigatori di gestire i vasi del mouse senza danneggiarli. In questo manoscritto descriveremo come gestire i vasi sanguigni del mouse quando facciamo preparazioni in faccia dell'arte del topo e dell'arteria carotidea. Ai fini della dimostrazione, utilizzeremo i topi selvatici tipo C57 / b6.

Protocollo

I protocolli per la legatura parziale dell'arteria carotide del mouse e l'isolamento dell'arte del topo e dell'arteria carotide per l'immunocoltura del viso sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IBT 2014-9231).

1. Ligation di arteria carotide parziale sinistra

1. Preparare lo spazio chirurgico mettendo un tavoletta da 12 pollici da 14 pollici sul tavolo e coprire il tappetino e la tavola con un grande teli chirurgici puliti. Regolare il braccio del basamento del braccio in modo che il campo visivo dello stereomicroscopio sia nell'area centrale del piano di riscaldamento.
2. Accendere il riscaldatore sul tavolo e impostare la ghiera di controllo a 3 livelli al livello di calore medio. A questa impostazione della temperatura, la superficie della scheda chirurgica (vedi 1.6.1) sarà di 38-40 ° C.
   1. Mettere una gabbia pulita su un altro tappetino. Ruotare il riscaldamento come sopra. Questa gabbia sarà utilizzata per il recupero dopo l'intervento chirurgico (vedi 1.16) e l'alloggiamento.
3. Sul tavolo chirurgico inserire una sacca per sterilizzazione autoclavata contenente forbici iride (1 paio), pinze per tessuti (1 coppia), pinze super grip (2 paia), forbici a molla (1 coppia), retrattore sbattuto (1 coppia, larghezza 2,5 mm) (1), sutura di seta sterilizzata 6-0, applicatori a cotone, applicatori in miniatura di cotone, drappi chirurgici e 2 spugne di garze da 2 "x 2". Inoltre mettere una bottiglia di spremitura contenente il 70% di etanolo e un altro contenente cherheidina chirurgica chirurgica il tavolo chirurgico.
4. Pesare un mouse. Il peso corporeo è necessario per determinare l'adeguata quantità di analgesia, che verrà somministrata immediatamente prima dell'intervento.
5. Inserire un mouse nella camera di induzione.
6. Accendere il serbatoio dell'ossigeno e il vaporizzatore anestetico per anestetizzare il topo nella camera di induzione. Mantenere il livello di isoflurano al 2%. Ci vogliono 3-5 minuti prima che il mouse smetta di muoversi.
   1. Mentre il mouse è in anestesia, Mettere un piccolo pezzo di sterile chirurgico (24 pollici x 24 pollici) sotto lo stereomicroscopio per creare una superficie chirurgica. Quindi posizionare una tavola chirurgica acrilica (che è stata pulita con alcol al 70%) sulla superficie drappeggiata. La tavola chirurgica dovrebbe quindi essere sul piano di riscaldamento, ma separata da due strati di teli chirurgici.
7. Quando il topo smette di muoversi nella camera di induzione, trasferire il mouse in un'area di preparazione pre-chirurgica e posizionare il naso nel cono conico collegato al vaporizzatore (2% isoflurano). Rimuovi i capelli intorno all'area cervicale usando un trimmer elettrico o una lozione rimozione dei capelli. Raccomandiamo la rimozione dei capelli perché questo metodo non produrrà pezzi di capelli allentati, che sono difficili da rimuovere completamente dall'area chirurgica.
8. Con il cono in posizione, spostare il mouse sulla scheda chirurgica.
   1. Tape giù le zampe anteriori destra e sinistra alla scheda chirurgica. Tape giù entrambe le gambe posterioriSul lato destro del mouse. Ciò provoca una leggera rotazione del corpo del topo in modo tale che il lato sinistro dell'area del collo del mouse diventa meglio posizionato per la chirurgia.
9. Disinfettare l'area di incisione con l'alcool al 70%, la chirurgia cherheidina, e ancora con l'alcool al 70%. Coprire il mouse con un drappo chirurgico sterilizzato tranne per l'area di incisione cervicale.
10. Confermare con il pizzico del piede che il mouse è completamente anestetizzato e dare analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) tramite iniezione intraperitoneale o sottocutanea.
11. Sotto il microscopio di dissezione, effettuare un'incisione midline ventrale attorno all'area cervicale usando una forbice da scalpello o da iride.
    NOTA: usiamo forbici perché la distanza di lavoro dello stereomicroscopio è limitata, rendendo difficile l'uso di un bisturi.
12. Esporre l'arteria carotide comune sinistra (LCCA) spingendo da parte e riposizionando le ghiandole salivari che coprono i vasi sanguigni sul lato sinistro dellaNimal.
13. Identificare tutti i vasi sanguigni nel campo chirurgico ( Figura 1 ). L'LCCA si biforcera nell'arteria carotide interna sinistra (ICA) e nell'arteria carotide esterna sinistra (ECA). L'arteria tiroidea superficiale (STA) nasce dall'ECA dal lato mediale. L'arteria occipitale (OA) di solito sorge dalla ECA, ma in alcuni topi deriva dall'ICA.
14. Legare tutti i rami d'arteria tranne l'OA usando la sutura di seta sterilizzata 6-0. Per raggiungere questo obiettivo, fare le due seguenti legazioni.
    1. Rimuovere delicatamente il tessuto connettivo attorno e sotto l'arteria carotide interna sinistra (ICA). Prendi un pezzo di sutura di seta 6-0 (~ 2,5 cm) con le pinze e lo passa sotto l'arteria. Utilizzando un'altra coppia di pinze, tirare la sutura circa 1/3 della sua lunghezza e legare l'arteria.
    2. Rimuovere il tessuto connettivo attorno all'arteria carotide esterna sinistra (ECA) allo stesso modo sopra descritto e fare una legatura prossimale al tiro superiore superiore sinistroD arteria (STA) ( figura 1 ). Fare attenzione a non danneggiare le fibre nervose che corrono all'interno del campo chirurgico.
15. Quando queste legazioni sono state fatte, riportare le ghiandole salivari nella posizione originale e idratare il campo chirurgico collocando 2-3 gocce di salina sterile. Chiudere la pelle usando le suture con vernice 6-0 rivestite.
16. Dopo l'intervento, posizionare il mouse nella gabbia pre-riscaldata (vedere 1.2.1). Il mouse dovrebbe svegliarsi entro 5 minuti e cominciare a camminare. Una volta confermato che il mouse si comporta normalmente, portare la gabbia nella stanza di alloggiamento animale.
17. Osservare il mouse ogni giorno per i primi 3 giorni di recupero. Il mouse può essere mantenuto fino a quando l'esperimento richiede le varie condizioni richieste dal protocollo sperimentale. Le preparazioni in faccia possono essere fatte in qualsiasi momento dopo l'intervento chirurgico.

2. En Face Immunostaining

1. Eutanizzare un topo con CO ₂ per overdose di inalazione.
2. Nastro il mouse in posizione supina (pancia verso l'alto) su una scheda di dissezione.
3. Esporre la cavità addominale facendo un'incisione midline usando le forbici dell'iride.
4. Esporre la cavità toracica tagliando le nervature lateralmente allo sterno.
5. Fare un nick nella vena cava o tagliare una delle arterie femorali per scaricare il sangue.
6. Inserire un ago da 26 G attaccato ad una configurazione di gravità (120 cm di pressione dell'acqua) nell'apice del ventricolo sinistro e perfezionare il sistema circolatorio con soluzione salina contenente eparina (40 U / mL). Continuare la perfusione fino a quando la salina che scorre dal taglio diventa chiara.
7. Passare il sistema di perfusione dalla soluzione salina alla soluzione di fissazione contenente 4% di paraformaldeide in PBS (salina tampone fosfato) e continuare a perfusione per altri 5 min.
8. Raccogliere l'aorta e le arterie carotide sinistra e destra usando forbici e pinze a punta liscia e collocare in un tubo conico da 50 mL contenente il fissativo sul ghiaccio.
9. Trasferire la vaschetta in un piatto di Petri contenente PBS sotto un microscopio di dissezione e rimuovere con cura i tessuti connettivi e legati all'arte e alle arterie carotide. Separare e suddividere l'aorta e le arterie carotide longitudinalmente per esporre l'endotelio ( Figura 2 ).
10. Trasferire separatamente ciascuna vasca in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti contenente 0,5 mL di una soluzione permeabilizzante (0,1% Triton X-100 in PBS) per pozzetto. Permeabilizzare i vasi sanguigni per 10 minuti con il dondolo a temperatura ambiente (RT).
11. Lavare brevemente con PBS.
12. Per bloccare i siti di legame non specifici dell'anticorpo, incubare i vasi sanguigni nel 10% di siero normale della specie animale in cui sono stati prodotti gli anticorpi secondari, in TTBS (Tris-tamponato salina (TBS) con 2,5% Tween 20) per 30 minuti con Dondolando a RT.
13. Incubare le vasi con gli anticorpi primari opportunamente diluiti in TTBS con 10% di siero normale (come sopra descritto) durante la notte con il dondolo a 4 ° C. Il livelloDi diluizione deve essere determinato per ogni anticorpo.
14. Eseguire la seguente colorazione di controllo.
    1. Incubare le vasi con TTBS anziché un anticorpo primario seguito da incubazione con un anticorpo secondario.
    2. Incubare le navi con TTBS contenenti siero o immunogeno non immunitario (o pre-immunitario) dello stesso animale (specie) in cui sono stati effettuati anticorpi primari, seguiti da incubazione con un anticorpo secondario.
    3. Omettere l'incubazione con un anticorpo secondario. Questi esemplari di controllo devono essere trattati nello stesso modo e nello stesso tempo in cui viene eseguita la colorazione con anticorpi specifici.
15. Lavare i vasi sanguigni 3 volte con TTBS per 10 minuti ciascuno con il dondolo a RT.
16. Incubare con anticorpi secondari a fluorescenza diluiti opportunamente in TTBS con 10% di siero normale (come sopra descritto) per 1 h con il dondolo a RT. La colorazione nucleare con DAPI (4 ', 6-diammino-2-fenilindolo) può essere eseguita simultaneamenteT questa fase aggiungendo 1/5000 in volume di una soluzione di riserva DAPI che contiene 5 mg / mL di DAPI in H ₂ O.
17. Lavare 3 volte con TTBS per 10 minuti ciascuno con il dondolo a RT.
18. Sciacquare brevemente in PBS.
19. Mettere una goccia del reagente antifumo su un vetro di copertura (22 mm x 50 mm) e posizionare un vaso sanguigno sul vetro di copertura con l'endotelio rivolto verso il basso.
20. Posizionare un vetrino (22 mm x 75 mm) sul vaso sanguigno evitando le bolle di cattura.
21. Posizionare la diapositiva su una pulizia pulita del laboratorio ( es. Kimwipe) e coprire la diapositiva con due pezzi di pulizia del laboratorio. Mettere delicatamente 3,5 kg di peso ( ad es. Usare una bottiglia d'acqua su un libro spesso) sullo scivolo per un massimo di 5 minuti per appiattire il campione del vaso sanguigno.
22. Rimuovere il peso e togliere la soluzione in eccesso da tutto il coperchio.
23. Applicare uno smalto ai 4 angoli della copertura, posizionare le diapositive in una scatola di scorrimento, rivestimento rivolto verso l'alto e tenere al buio a RT(O 4 ° C) durante la notte. Questo processo appiattisce ulteriormente il tessuto e rende più facile eseguire la microscopia ad alti ingrandimenti.
24. Sigillare completamente il coperchio con smalto.
25. Eseguire la microscopia non appena il lucido per unghie è asciutto.
26. Se necessario, conservare le diapositive a -20 ° C.

Risultati

Un'immagine immunofluorescenza tipica dell'endotelio è mostrata in Figura 3 . Questa immagine mostra una singola sezione ottica di un aorta di topi prese vicino all'apertura di un'arteria intercostale (la grande zona di uovo scuro). L'aorta è stato duplicato con anti-VE-cadherina (verde) e anti-VCAM-1 (molecola adesione cellulare vascolare-1) (rosso). Ogni cellula endoteliale è delineata con una colorazione lineare verde alla giunzione aderente. A ...

Discussione

Quando si manipolano con i vasi sanguigni del mouse, è importante ricordare che l'endotelio è fragile e che qualsiasi eccessiva forza meccanica danneggerà le cellule endoteliali. Ad esempio, le cellule endoteliali si rompono o si staccano dalla parete del vaso se la vasca viene perfusa troppo forte, cosa che può accadere facilmente quando la vasculatura viene perfusa usando una siringa a mano.

Per ottenere una pressione costante di perfusione, usiamo un sistema di perfusione gravitaz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag	Fisher Scientific	NC9788429
12-well plates	Fisher Scientific	12556005
6-0 coated vicryl suture	Ethicon	J833G
AF488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24x24in	Cardinal Health	4024
Blunt retractors, 2.5mm wide	Fine Science Tools	18200-10
Caprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2x2	Cardinal Health	KC2146
Electric heating pad, 12X14	Fisher Scientific	NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Micro cover glass 22x50mm	VWR	48393059
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-18
normal goat serum	Equitech-Bio	GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Petri Dishes 100x15mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI	Life Technologies	P-36935
Puritan cortton swabs	VWR	10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators	VWR	82004-050
Round handled Needle Holder	Fine Science Tools	12076-12
Silk Suture 6/0	Fine Science Tools	18020-60
Spring scissors	ROBOZ	RS-5601
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-09
Super Grip Forceps	Fine Science Tools	00649-11
Transparent Dressing	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000