Подготовка к зачатию кровеносных сосудов мыши

Резюме

Описана процедура приготовления препаратов на лицевой стороне сонной артерии и аорты мышей. Такие препараты, при иммунофлуоресцентном окрашивании специфическими антителами, позволяют нам изучать локализацию белков и идентификацию типов клеток во всей сосудистой стенке с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

Секции парафиновых включенных тканей обычно используются для изучения гистологии тканей и гистопатологии. Однако трудно определить, что представляет из себя трехмерная морфология ткани. Кроме того, участки исследуемых тканей могут не содержать области внутри ткани, которая необходима для целей текущего исследования. Это последнее ограничение препятствует гистопатологическим исследованиям кровеносных сосудов, поскольку сосудистые поражения развиваются фокально. Это требует метода, который позволяет нам исследовать широкую область стенки кровеносного сосуда, от ее поверхности до более глубоких областей. Этого требует выполнение целого подхода к подготовке кровеносных сосудов. В этой статье мы продемонстрируем, как сделать лицевые препараты мышиной аорты и сонной артерии и иммунофлуоресцентно окрасить их для конфокальной микроскопии и других типов изображений на основе флуоресценции.

Введение

Для гистопатологических исследований с помощью световой микроскопии трехмерные куски биологических тканей обычно обрабатывают для встраивания парафинов с последующим разделением и окрашиванием. Образец ткани, который был встроен в парафин, может иметь размеры в несколько миллиметров во всех трех измерениях. Однако для целей световой микроскопии его необходимо сначала срезать так, чтобы свет мог проходить сквозь него, а затем окрашивался, чтобы тонкая секция получала достаточный контраст для получения изображений. Так как срезанные образцы обычно имеют толщину 5-10 мкм, то можно увидеть только очень небольшую часть всего образца в двух измерениях за один раз. Можно собирать последовательные секции и, после визуализации каждой секции индивидуально, выполнить компьютерную реконструкцию трехмерных изображений, но это действительно утомительная работа. Гистопатология кровеносных сосудов, особенно для изучения патогенеза атеросклероза, представляет уникальные проблемы. Атеросклероз является очаговым заболеванием, которое развиваетсяЛокально в местах, где происходит нарушение кровообращения. Кроме того, болезнь начинается в интиме - тонкой ткани, состоящей из монослоя эндотелиальных клеток и внеклеточного матрикса больших артерий. По этим причинам, найти и изучить ранние поражения с использованием секционных кровеносных сосудов - задача непростая, так как можно легко пропустить раздел поражения. Даже если в разрезе имеется больная область, в средах и адвентициях будет наблюдаться только часть размером 5-10 мкм, содержащая эндотелиальные клетки и другие клетки сосудистой стенки.

Препараты с цельной консистенцией (выраженные в фэс) позволяют нам исследовать широкую область поверхности кровеносных сосудов, такую ​​как вся аорта, от корня аорты вплоть до общих подвздошных артерий. Используя такой образец, окрашенный специфическими антителами и другими специфическими зондами, можно точно определить место повреждения, а также, когда в эндотелиальных клетках происходят различные молекулярные события, в сочетании с wiГо атерогенеза, таких как изменения экспрессии, локализации и посттрансляционные модификации белков. В дополнение к изучению атерогенеза, форма эндотелиальных клеток, наблюдаемая в препаратах на лице, используется в качестве индикатора региональной усредненной по времени картины кровотока. Такие данные важны для изучения механосигнального процесса эндотелиальных клеток in situ. Для этой цели обычные гистологические поперечные срезы крови не пригодны. Таким образом, для сосудистой медицины и биологии особенно важно приобрести методику для подготовки лицевых препаратов кровеносных сосудов, которая позволяет наблюдать большую площадь поверхности сосуда, а также более глубокие подповерхностные области сосуда.

В обзоре Jelev and Surchev ¹ , сосудистые биологи разработали различные методы для наблюдения за облицовкой кровеносных сосудов. Некоторые гениальные методы были разработаны в 1940-х и 1950-х годах. Используя эти методы, они Способных изучать фундаментальную организацию эндотелиальных клеток, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов. Однако из-за того, как эти препараты готовятся (так называемый метод Hautchen ^{2 , 3 , 4} или отслоение поверхности сосуда ⁵ ), а также от того, как образец был окрашен, не всегда можно было получить непрерывную морфологию Информацию с поверхности сосуда в более глубокие области стенки кровеносного сосуда. Препарат для всего гомеопатического сосуда в сочетании с иммунофлуоресцентным окрашиванием позволил нам не только изучить морфологию эндотелиальных клеток, экспрессию и локализацию белка в этих клетках, но и распространить такие исследования на субэндотелиальную область стенки сосуда. Ранние исследования с использованием препаратов для подготовки кровеносных сосудов, окрашенных иммунофлюоресцентно, начали появляться в 80-х годах ^{6 ,}F "> 7. С появлением лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и в последнее время многофотонной микроскопии теперь можно получить четкие фокусные изображения структуры стенок кровеносных сосудов в образцах иммунофлуоресцентно окрашенных образцов сосудов, а также сосудистой сети у живых животных ^{8 , 9 , 10 , 11.} Эти компьютерные методы визуализации создают фокусированные оптические секционные изображения, и путем складывания таких изображений можно получить восстановленные трехмерные изображения стенки сосуда и сосудистой сети в тканях. Может генерировать изображения секции, выполненной вдоль оси Z восстановленного изображения ^{12 , 13} .

В этой статье мы проиллюстрируем способ подготовки лицевых препаратов мышечной аорты и сонной артерии для иммунофлуоресцентного окрашивания. Подготовка к зачарованиюМогут быть сделаны даже после экспериментального манипулирования этими сосудами. Например, сонную артерию можно частично лигировать, а затем получить лицевую подготовку, сделанную после такой операции. По этой причине мы также опишем в этой статье, как мы выполняем частичную перевязку на сонной артерии. По сравнению с приготовлением подобных препаратов у более крупных животных, таких как крысы, кролики и люди, мышечные сосуды небольшие по размеру и более хрупкие, что требует дополнительной осторожности при обращении во время хирургической изоляции сосудов и их приготовления для окрашивания антител и микроскопии. Поскольку наиболее часто используемой моделью животных для генетической модификации является мышь, для многих исследователей критически важно обрабатывать сосуды мыши, не повреждая их. В этой рукописи мы расскажем о том, как обрабатывать кровеносные сосуды мыши при приготовлении лицевых препаратов мышечной аорты и сонной артерии. Для демонстрации мы будем использовать мышей дикого типа C57 / b6.

протокол

Протоколы перевязки частичной сонной артерии мыши и выделения мышечной аорты и сонной артерии для иммуноокрашивания иммунной системы одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных (IBT 2014-9231).

1. Перевязка левой части сонной артерии

1. Подготовьте хирургическое пространство, поместив на стол нагревательную подушку размером 12 дюймов x 14 дюймов и накройте подушку и верхнюю часть стола большой чистой хирургической драпировкой. Отрегулируйте кронштейн стойки стрелы так, чтобы поле зрения стереомикроскопа находилось в центральной области грелки.
2. Включите грелку на столе и установите 3-позиционный диск управления на средний уровень тепла. При такой настройке температура поверхности хирургической панели (см. 1.6.1) будет 38-40 ° C.
   1. Поместите чистую клетку на другую грелку. Поверните грелку, как описано выше. Эта клетка будет использоваться для восстановления после операции (см. 1.16), а также для жилья.
3. На хирургическом столе поместите стерилизационный автоклавированный автоклав, содержащий ножницы для ирисовой диафрагмы (1 пара), щипцы для тканей (1 пара), щипцы для суперсжима (2 пары), пружинные ножницы (1 пара), тупой втягиватель (1 пара, ширина 2,5 мм) (1), стерилизованный шелковый шов 6-0, аппликаторы с хлопковым наконечником, аппликаторы с мини-хлопковым наконечником, хирургические шторы и 2 "x 2" марлевые губки. Также поместите выжимку, содержащую 70% этанола, а другую, содержащую хирургический скраб хлоргексидина, - хирургический стол.
4. Взвешивание мыши. Вес тела необходим, чтобы определить соответствующее количество обезболивания, которое будет вводиться непосредственно перед операцией.
5. Поместите мышь в индукционную камеру.
6. Включите кислородный баллон и анестезирующий испаритель, чтобы обезболивать мышь в индукционной камере. Поддерживайте уровень изофлурана в 2%. Это займет 3-5 минут, прежде чем мышь перестанет двигаться.
   1. Пока мышь находится под наркозомПоместите меньший кусочек стерильной хирургической драпы (24 дюйма х 24 дюйма) под стереомикроскоп для создания хирургической поверхности. Затем поместите на драпированную поверхность акриловую хирургическую доску (которая была очищена 70% -ным спиртом). Поэтому хирургический щит должен находиться на грелке, но разделен двумя слоями хирургических штор.
7. Когда мышь перестает двигаться в индукционной камере, перенесите мышь в область предварительной подготовки и поставьте нос в носовой конус, соединенный с испарителем (2% изофлурана). Удалите волосы вокруг шейного отдела с помощью электрического триммера или лосьона для удаления волос. Мы рекомендуем лосьон для удаления волос, потому что этот метод не даст сыпучих кусочков волос, которые трудно полностью удалить из хирургической области.
8. С носовым конусом на месте переместите мышь к хирургической доске.
   1. Слейте правую и левую передние лапы на хирургическую доску. Намотайте ленту на обе задние ногиTher с правой стороны мыши. Это приводит к небольшому вращению тела мыши, так что левая сторона области шеи мыши становится лучше расположенной для операции.
9. Продезинфицируйте область разреза 70% -ным спиртом, хирургическим скрабом хлоргексидина и снова 70% -ным спиртом. Закройте мышь стерилизованной хирургической драпировкой, кроме области разреза шейки матки.
10. Подтвердите с ног, что мышь полностью обезболивается и дает обезболивание (Капрофен 3-5 мг / кг) через внутрибрюшинную или подкожную инъекцию.
11. Под рассекающим микроскопом сделайте разрез вентральной средней линии вокруг шейного отдела с помощью либо ножниц скальпеля, либо ирисовых диафрагм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мы используем ножницы, потому что рабочее расстояние стереомикроскопа ограничено, что затрудняет использование скальпеля.
12. Выставьте левую общую сонную артерию (LCCA), оттолкнув и переставив слюнные железы, которые закрывают кровеносные сосуды в левой стороне аНимал.
13. Определите все кровеносные сосуды в хирургическом поле ( рис. 1 ). LCCA разветвляется в левую внутреннюю сонную артерию (ICA) и левую наружную сонную артерию (ECA). Поверхностная щитовидная артерия (СТА) возникает из ЭКА на медиальной стороне. Затылочная артерия (ОА) обычно возникает из ЭКА, но у некоторых мышей она возникает из ИКА.
14. Перевяжите все ветви артерии, кроме ОА, с помощью стерильного шелого шва 6-0. Для этого сделайте следующие две перевязки.
    1. Аккуратно удалите соединительную ткань вокруг и под левой внутренней сонной артерии (ICA). Возьмите кусок шелухи 6-0 (6 см) с помощью щипцов и пропустите его под артерию. Используя другую пару щипцов, потяните шов примерно на 1/3 его длины и перевяжите артерию.
    2. Удалите соединительную ткань вокруг левой внешней сонной артерии (ЭКА) таким же образом, как описано выше, и сделайте перевязку проксимальной к левой верхней тиреоидеD артерии (STA) ( рисунок 1 ). Будьте осторожны, чтобы не повредить нервные волокна, которые проходят в пределах хирургического поля.
15. Когда эти лигации были сделаны, вернуть слюнные железы в исходное положение и гидратировать хирургическое поле, поместив 2-3 капли стерильного физиологического раствора. Закройте кожу, используя шовные нити visryl 6-0.
16. После операции поместите мышь в предварительно подогретую клетку (см. 1.2.1). Мышка должна проснуться в течение 5 минут и начать ходить. После подтверждения, что мышь ведет себя нормально, принесите клетку в комнату для животных.
17. Наблюдайте за мышью ежедневно в течение первых 3 дней восстановления. Мышь может храниться столько времени, сколько требует эксперимент при различных условиях, к которым призывает экспериментальный протокол. Подготовка к зачатию может быть сделана в любое время после операции.

2. En Face Immunostaining

1. Эвтаназию мыши с CO ₂ путем передозировки при вдыхании.
2. Лента мышь в лежачем положении (живот вверх) на рассекающую доску.
3. Выставьте брюшную полость, сделав срединный разрез с помощью ножниц диафрагмы.
4. Выставьте грудную полость, разрезая ребра латерально на грудную клетку.
5. Сделайте ник в полой вене или вырежьте одну из бедренных артерий для слива крови.
6. Вставьте иглу 26 G, прикрепленную к установке для гравитационной перфузии (давление воды 120 см), в верхнюю часть левого желудочка и перфузируйте систему кровообращения солевым раствором, содержащим гепарин (40 Ед. / Мл). Продолжайте перфузию, пока солевой раствор, вытекающий из разреза, не станет прозрачным.
7. Переключите перфузионную систему из солевого раствора в раствор для фиксации, содержащий 4% параформальдегида в PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор), и продолжайте перфузию еще на 5 мин.
8. Уплотните аорту и левую и правую сонные артерии с помощью тупоконечных ножниц и пинцет и поместите в коническую пробирку на 50 мл, содержащую фиксатор на льду.
9. Переместите сосуд в чашку Петри, содержащую PBS под рассекающим микроскопом, и осторожно удалите жир и соединительные ткани, прикрепленные к аорте и сонной артерии. Разделить и разделить аорту и сонные артерии продольно, чтобы обнажить эндотелий ( рис. 2 ).
10. Переведите каждый сосуд отдельно в лунку 12-луночного планшета, содержащего 0,5 мл проницаемого раствора (0,1% Triton X-100 в PBS) на лунку. Проницаемость кровеносных сосудов в течение 10 мин с качанием при комнатной температуре (RT).
11. Мойте коротко с PBS.
12. Чтобы блокировать сайты неспецифического связывания антител, инкубируйте кровеносные сосуды в 10% нормальной сыворотке из видов животных, в которых были получены вторичные антитела, в TTBS (забуференный трис физиологический раствор (TBS) с 2,5% Tween 20) в течение 30 мин с Качаясь в RT.
13. Инкубируйте сосуды с первичными антителами, соответственно разбавленными TTBS 10% нормальной сывороткой (как описано выше) в течение ночи с качанием при 4 ° C. УровеньРазведения должны быть определены для каждого антитела.
14. Выполните следующее контрольное окрашивание.
    1. Инкубируйте сосуды с TTBS вместо первичного антитела с последующей инкубацией со вторичным антителом.
    2. Инкубируйте сосуды с TTBS, содержащие неиммунную (или преиммунную) сыворотку или Ig одного и того же животного (вида), в котором были сделаны первичные антитела, с последующей инкубацией со вторичным антителом.
    3. Опустите инкубацию со вторичным антителом. Эти контрольные образцы должны обрабатываться таким же образом и в то же время, когда проводится окрашивание специфическими антителами.
15. Промойте кровеносные сосуды 3 раза TTBS в течение 10 мин с качанием при комнатной температуре.
16. Инкубируйте с флуоресцентно мечеными вторичными антителами, разведенными соответствующим образом в TTBS с 10% нормальной сывороткой (как описано выше) в течение 1 часа с качанием при комнатной температуре. Ядерное окрашивание DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом) может быть одновременно выполненоT эта стадия добавлением 1/5000 об. Основного раствора DAPI, который содержит 5 мг / мл DAPI в H ₂ O.
17. Промывают 3 раза TTBS в течение 10 мин с качанием при комнатной температуре.
18. Промыть кратко в PBS.
19. Поместите одну каплю антизатухающего реагента на покровное стекло (22 мм х 50 мм) и поместите кровеносный сосуд на покровное стекло с эндотелием вниз.
20. Поместите стеклянное стекло (22 мм x 75 мм) на кровеносный сосуд, избегая образования пузырьков.
21. Поместите слайд на чистую лабораторную салфетку ( например, Kimwipe) и закройте слайд двумя частями лабораторной салфетки. Аккуратно поместите 3,5 кг веса ( например , используйте бутылку воды в толстую книгу) на слайде в течение максимум 5 минут, чтобы сгладить образец кровеносного сосуда.
22. Удалите вес и вытрите лишний раствор из покровного стекла.
23. Нанесите лак для ногтей на 4 угла покровного стекла, поместите слайды в ползунок, покровное покрытие вверх и держите в темноте при комнатной температуре(Или 4 ° С) в течение ночи. Этот процесс еще больше выравнивает ткань и облегчает проведение микроскопии при высоких увеличениях.
24. Покройте покровное стекло полностью, используя лак для ногтей.
25. Проведите микроскопию, как только лак для ногтей высохнет.
26. При необходимости храните слайды при -20 ° C.

Результаты

Типичное изображение иммунофлуоресцентного изображения эндотелия показано на рисунке 3 . На этом снимке изображен одиночный оптический участок аорты мыши, взятый вблизи отверстия межреберной артерии (большая темная область в форме яйца). Аорта была дважды о...

Обсуждение

При обработке мышечных кровеносных сосудов важно помнить, что эндотелий является хрупким и что любая чрезмерная механическая сила повредит эндотелиальные клетки. Например, эндотелиальные клетки разрушаются или отсоединяются от стенки сосуда, если сосуд слишком интенсивно перфузиру...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag	Fisher Scientific	NC9788429
12-well plates	Fisher Scientific	12556005
6-0 coated vicryl suture	Ethicon	J833G
AF488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24x24in	Cardinal Health	4024
Blunt retractors, 2.5mm wide	Fine Science Tools	18200-10
Caprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2x2	Cardinal Health	KC2146
Electric heating pad, 12X14	Fisher Scientific	NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Micro cover glass 22x50mm	VWR	48393059
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-18
normal goat serum	Equitech-Bio	GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Petri Dishes 100x15mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI	Life Technologies	P-36935
Puritan cortton swabs	VWR	10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators	VWR	82004-050
Round handled Needle Holder	Fine Science Tools	12076-12
Silk Suture 6/0	Fine Science Tools	18020-60
Spring scissors	ROBOZ	RS-5601
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-09
Super Grip Forceps	Fine Science Tools	00649-11
Transparent Dressing	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000