En Face Preparación de los vasos sanguíneos del ratón

Resumen

Se describe un procedimiento para preparar preparaciones en la cara de la arteria carótida de ratón y la aorta. Tales preparaciones, cuando se tiñen inmunofluorescentemente con anticuerpos específicos, nos permiten estudiar la localización de proteínas y la identificación de tipos de células dentro de toda la pared vascular por microscopía confocal.

Resumen

Secciones de los tejidos embebidos en parafina se utilizan habitualmente para el estudio de histología de tejidos e histopatología. Sin embargo, es difícil determinar cuál es la morfología tridimensional del tejido de tales secciones. Además, las secciones de los tejidos examinados pueden no contener la región dentro del tejido que sea necesaria para el propósito del estudio en curso. Esta última limitación obstaculiza los estudios histopatológicos de los vasos sanguíneos ya que las lesiones vasculares se desarrollan de manera focalizada. Esto requiere un método que nos permita examinar una amplia área de la pared de los vasos sanguíneos, desde su superficie hasta regiones más profundas. Todo un montaje en la cara preparación de los vasos sanguíneos cumple con este requisito. En este artículo, vamos a demostrar cómo hacer preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida y inmunofluorescentemente mancha para la microscopía confocal y otros tipos de imágenes basadas en fluorescencia.

Introducción

Para los estudios histopatológicos por microscopía óptica, se procesan rutinariamente trozos tridimensionales de tejidos biológicos para la incrustación de parafina seguido de seccionamiento y tinción. Una muestra de tejido que ha sido embebida en parafina puede ser varios milímetros en las tres dimensiones. Sin embargo, para el propósito de la microscopía óptica, debe ser primero seccionado de modo que la luz pueda pasar a través y entonces teñido de modo que la sección delgada produzca bastante contraste para la proyección de imagen. Debido a que las muestras seccionadas suelen tener un espesor de 5-10 μm, se ve sólo una fracción muy pequeña de la muestra entera en dos dimensiones a la vez. Es posible recolectar secciones secuenciales y, después de imaginar cada sección individualmente, realizar reconstrucción asistida por computadora de las imágenes 3D, pero esto es un trabajo tedioso. La histopatología de los vasos sanguíneos, especialmente para estudiar la patogénesis de la aterosclerosis, presenta problemas únicos. La aterosclerosis es una enfermedad focalizada que se desarrollaLocalmente en áreas donde se produce un flujo sanguíneo alterado. Además, la enfermedad se inicia dentro de la íntima, un tejido fino que consiste en una monocapa de células endoteliales y matriz extracelular, de grandes arterias. Por estas razones, es un reto localizar y estudiar las lesiones tempranas usando vasos sanguíneos seccionados porque uno puede faltar fácilmente seccionar la lesión. Incluso si una sección incluye un área enferma, se verá sólo una porción de 5-10 μm que contiene células endoteliales y otras células de pared vascular en los medios y adventicia.

Las preparaciones de montaje completo en la cara (pronunciado än fäs) nos permiten examinar una amplia área de la superficie del vaso sanguíneo tal como la aorta entera de la raíz aórtica hasta las arterias ilíacas comunes. Utilizando una muestra de este tipo teñida con anticuerpos específicos y otras sondas específicas, se puede señalar la ubicación de las lesiones y también donde varios eventos moleculares se producen en las células endoteliales en conjunción conLa aterogénesis tal como cambios en la expresión, localización y modificaciones postraduccionales de proteínas. Además de estudiar la aterogénesis, la forma de las células endoteliales observada en las preparaciones faciales se utiliza como un indicador del patrón regional de flujo sanguíneo promedio en el tiempo. Tales datos son importantes para estudiar la señalización mecánica de células endoteliales in situ. Para este propósito, los vasos sanguíneos histológicos transversales de corte rutinario no son útiles. Por lo tanto, para la medicina vascular y la biología, es especialmente importante adquirir una técnica para fabricar preparaciones en la cara de los vasos sanguíneos que permite observar una amplia área de la superficie del vaso, así como las áreas subsuperficiales más profundas del vaso.

Como revisado por Jelev y Surchev ¹ , los biólogos vasculares han desarrollado varios métodos para observar el revestimiento de los vasos sanguíneos en la cara. Algunos métodos ingeniosos se desarrollaron en los años 1940 y 1950. Usando estos métodos, fueron Capaz de estudiar la organización fundamental de las células endoteliales que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos. Sin embargo, debido a la forma en que se preparan estas preparaciones de en-face (el denominado método de Hautchen ^{2 , 3 , 4} o desprendimiento de la superficie del recipiente ⁵ ) y la forma en que se tiñe la muestra, no siempre fue posible obtener muestras morfológicas ininterrumpidas Información de la superficie del vaso en las áreas más profundas de la pared de los vasos sanguíneos. La preparación completa de vasos enmarcados combinados con tinción por inmunofluorescencia nos permitió no sólo estudiar la morfología de las células endoteliales y la expresión y localización de proteínas en estas células, sino también extender dichos estudios a la región subendotelial de la pared del vaso. Los primeros estudios que usaban vasos sanguíneos en preparados para la cara manchados con inmunofluorescencia empezaron a aparecer en los años ochenta ^{6 ,}Con el advenimiento de la microscopía confocal de barrido láser y más recientemente la microscopía multifotónica, ahora se pueden obtener imágenes claras en foco de la estructura de la pared de los vasos sanguíneos en muestras de vasos endoblados con inmunofluorescencia así como la red vascular en animales vivos ^{8 , 9 , 10 , 11.} Estas técnicas de formación de imágenes basadas en ordenador crean imágenes seccionadas ópticamente en foco y, apilando dichas imágenes, se pueden obtener imágenes tridimensionales reconstruidas de la pared del vaso y de la red vascular en los tejidos. Puede generar imágenes de una sección hecha a lo largo del eje Z de la imagen reconstruida ^{12 , 13} .

En este artículo, ilustraremos un método para preparar preparaciones en la cara de la aorta de ratón y la arteria carótida para tinción inmunofluorescente. Preparaciones para el rostroPueden hacerse incluso después de que estos vasos hayan sido manipulados experimentalmente. Por ejemplo, una arteria carótida puede ser parcialmente ligada y después una preparación de cara preparada después de tal cirugía. Por esta razón, también describiremos en este artículo cómo realizamos una ligadura parcial en la arteria carótida. En comparación con la fabricación de preparaciones similares de animales más grandes tales como ratas, conejos y seres humanos, los vasos de ratón son de pequeño tamaño y más frágiles, requiriendo así un cuidado adicional durante el aislamiento quirúrgico de los vasos y preparándolos para la tinción de anticuerpos y la microscopía. Debido a que el modelo animal más utilizado para la modificación genética es el ratón, resulta crítico que muchos investigadores manejen los vasos de ratón sin dañarlos. En este manuscrito, vamos a describir cómo manejar los vasos sanguíneos del ratón cuando se hacen preparaciones en la cara de la aorta del ratón y la arteria carótida. Para fines de demostración, se utilizarán ratones C57 / b6 de tipo salvaje.

Protocolo

Los protocolos para la ligación de la arteria carótida parcial de ratón y el aislamiento de la aorta de ratón y la arteria carótida para la inmunotinción en la cara son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IBT 2014-9231).

1. Ligadura de la arteria carótida parcial izquierda

1. Prepare el espacio quirúrgico colocando una almohadilla calefactora de 12 pulgadas x 14 pulgadas sobre la mesa y cubra la almohadilla y la parte superior de la mesa con un gran paño quirúrgico limpio. Ajuste el brazo del soporte del brazo para que el campo de visión del estereomicroscopio esté en el área central de la almohadilla calefactora.
2. Encienda la almohadilla calefactora de la mesa y ajuste el control de 3 posiciones al nivel de calor medio. A esta temperatura, la superficie de la placa quirúrgica (véase 1.6.1) será de 38-40 ° C.
   1. Coloque una jaula limpia en otra almohadilla de calefacción. Gire la almohadilla de calefacción como en el caso anterior. Esta jaula se utilizará para la recuperación después de la cirugía (véase 1.16), así como la vivienda.
3. En la mesa quirúrgica, coloque una bolsa de esterilización esterilizada en autoclave que contenga tijeras de iris (1 par), pinzas de tejido (1 par), pinzas de agarre súper (2 pares), tijeras de resorte (1 par) (1), sutura de seda 6-0 esterilizada, aplicadores con punta de algodón, mini aplicadores con punta de algodón, cortinas quirúrgicas y esponjas de gasa de 2 "x 2". También coloque una botella de compresión que contenga etanol al 70% y otra que contenga clorexidina en la mesa quirúrgica.
4. Pesar un ratón. El peso corporal es necesario para determinar la cantidad apropiada de analgesia, que se administrará inmediatamente antes de la cirugía.
5. Coloque un ratón en la cámara de inducción.
6. Encienda el tanque de oxígeno y el vaporizador anestésico para anestesiar el ratón en la cámara de inducción. Mantener el nivel de isoflurano al 2%. Tarda 3-5 minutos antes de que el ratón deje de moverse.
   1. Mientras el ratón está siendo anestesiadoColoque una pieza más pequeña de un paño quirúrgico estéril (24 pulgadas x 24 pulgadas) debajo del microscopio estereoscópico para crear una superficie quirúrgica. A continuación, coloque un tablero de cirugía acrílica (que se ha limpiado con alcohol al 70%) en la superficie cubierta. Por lo tanto, la placa quirúrgica debe estar sobre la almohadilla calefactora pero separada por dos capas de cortinas quirúrgicas.
7. Cuando el ratón deje de moverse en la cámara de inducción, transfiera el ratón a un área de preparación prequirúrgica y coloque su nariz en el cono nariz conectado al vaporizador (isoflurano al 2%). Retire el cabello alrededor del área cervical con un recortador eléctrico o una loción depilatoria. Se recomienda la eliminación del vello ya que este método no produce piezas de pelo sueltas, que son difíciles de eliminar por completo de la zona quirúrgica.
8. Con el cono de la nariz en su lugar, mover el ratón a la placa quirúrgica.
   1. Tape hacia abajo las patas delanteras derecha e izquierda en la placa quirúrgica. Tape hacia abajo ambas patas traseras togeEn el lado derecho del ratón. Esto provoca una ligera rotación del cuerpo del ratón de tal manera que el lado izquierdo del área del cuello del ratón se posiciona mejor para la cirugía.
9. Desinfecte el área de la incisión con alcohol al 70%, exfoliante quirúrgico de clorhexidina y otra vez con alcohol al 70%. Cubra el ratón con un paño quirúrgico esterilizado excepto por el área de la incisión cervical.
10. Confirme con un pellizcado que el ratón esté completamente anestesiado y administre analgesia (Caprofen 3-5 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal o subcutánea.
11. Bajo el microscopio de disección, realice una incisión en la línea media ventral alrededor del área cervical usando un scalpel o tijeras de iris.
    NOTA: Utilizamos tijeras porque la distancia de trabajo del estereomicroscopio es limitada, lo que dificulta el uso de un bisturí.
12. Exponer la arteria carótida común izquierda (LCCA) empujando a un lado y reposicionando las glándulas salivales que cubren los vasos sanguíneos al lado izquierdo de la aNimal
13. Identificar todos los vasos sanguíneos en el campo quirúrgico ( Figura 1 ). La LCCA se bifurca en la arteria carótida interna izquierda (ICA) y en la arteria carótida externa izquierda (ECA). La arteria tiroidea superficial (STA) surge de la ECA en el lado medial. La arteria occipital (OA) suele surgir de la ECA, pero en algunos ratones surge de la ICA.
14. Ligado todas las ramas de la arteria excepto la OA utilizando sutura de seda esterilizada 6-0. Para lograr esto, realizar las siguientes dos ligaciones.
    1. Suavemente retire el tejido conectivo alrededor y debajo de la arteria carótida interna izquierda (ICA). Agarrar un trozo de sutura de seda precortada 6-0 (~ 2,5 cm) con pinzas y pasarlo por debajo de la arteria. Usando otro par de pinzas, tire de la sutura aproximadamente 1/3 de su longitud y ligue la arteria.
    2. Quitar el tejido conectivo alrededor de la arteria carótida externa izquierda (ECA) de la misma manera descrita anteriormente y hacer una ligadura proximal a la tiroides superior izquierdaD (STA) ( Figura 1 ). Tenga cuidado de no dañar las fibras nerviosas que corren dentro del campo quirúrgico.
15. Cuando estas ligaduras se han hecho, devolver las glándulas salivales a la posición original e hidratar el campo quirúrgico mediante la colocación de 2-3 gotas de solución salina estéril. Cierre la piel con suturas Vicryl revestidas 6-0.
16. Después de la cirugía, coloque el ratón en la jaula precalentada (ver 1.2.1). El ratón debe despertar en 5 minutos y comenzar a caminar. Una vez confirmado que el ratón se comporta normalmente, traiga la jaula a la sala de alojamiento de animales.
17. Observe el ratón diariamente durante los primeros 3 días de recuperación. El ratón puede mantenerse mientras el experimento requiera bajo las diversas condiciones que el protocolo experimental requiere. Las preparaciones faciales pueden hacerse en cualquier momento después de la cirugía.

2. En Face Immunostaining

1. Eutanasia un ratón con CO ₂ por sobredosis por inhalación.
2. Tape el ratón en una posición supina (lado del vientre hacia arriba) en una tabla de disección.
3. Exponga la cavidad abdominal haciendo una incisión en la línea media usando tijeras de iris.
4. Exponga la cavidad torácica cortando las costillas lateralmente al esternón.
5. Hacer un corte en la vena cava o cortar una de las arterias femorales para drenar la sangre.
6. Insertar una aguja de 26 G unida a una instalación de perfusión por gravedad (120 cm de presión de agua) en el ápice del ventrículo izquierdo y perfundir el sistema circulatorio con solución salina que contiene heparina (40 U / mL). Continúe la perfusión hasta que la solución salina que sale del corte se vuelva clara.
7. Cambiar el sistema de perfusión de solución salina a la solución de fijación que contiene paraformaldehído al 4% en PBS (solución salina tamponada con fosfato) y continuar perfusando durante 5 minutos más.
8. Cosecha de la aorta y las arterias carótidas izquierda y derecha utilizando tijeras de extremo romo y fórceps, y colocar en un tubo cónico de 50 ml que contiene el fijador en hielo.
9. Transfiera el recipiente a una placa de Petri que contenga PBS bajo un microscopio de disección y retire cuidadosamente la grasa y los tejidos conectivos unidos a la aorta y las arterias carótidas. Separar y dividir la aorta y las arterias carótidas longitudinalmente para exponer el endotelio ( Figura 2 ].
10. Se transfiere cada recipiente por separado a un pocillo de una placa de 12 pocillos que contiene 0,5 ml de una solución permeabilizante (0,1% Triton X-100 en PBS) por pocillo. Permeabilizar los vasos sanguíneos durante 10 min con balanceo a temperatura ambiente (RT).
11. Lave brevemente con PBS.
12. Para bloquear los sitios de unión a anticuerpos no específicos, incubar los vasos sanguíneos en suero normal al 10% de la especie animal en la que se han hecho los anticuerpos secundarios, en TTBS (solución salina tamponada con Tris (TBS) con Tween 20 al 2,5%) durante 30 minutos con Balanceándose a la RT.
13. Incubar los vasos con los anticuerpos primarios debidamente diluidos en TTBS con suero normal al 10% (como se ha descrito anteriormente) durante la noche con balanceo a 4 ° C. El nivelDe dilución debe determinarse para cada anticuerpo.
14. Realice la siguiente tinción de control.
    1. Incubar los vasos con TTBS en lugar de un anticuerpo primario seguido de incubación con un anticuerpo secundario.
    2. Incubar los vasos con TTBS que contengan suero no inmune (o preinmunitario) o Ig del mismo animal (especie) en el que se hayan realizado anticuerpos primarios, seguido de incubación con un anticuerpo secundario.
    3. Omitir la incubación con un anticuerpo secundario. Estas muestras de control deben manipularse de la misma manera y al mismo tiempo cuando se realiza la tinción con anticuerpos específicos.
15. Lave los vasos sanguíneos 3 veces con TTBS durante 10 minutos cada uno con balanceo a RT.
16. Incubar con anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente diluidos apropiadamente en TTBS con suero normal al 10% (como se ha descrito anteriormente) durante 1 h con balanceo a RT. La tinción nuclear con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) puede realizarse simultáneamente con unT en esta etapa añadiendo 1/5000 en volumen de una solución madre de DAPI que contiene 5 mg / ml de DAPI en H2O.
17. Lavar 3 veces con TTBS durante 10 min cada uno con balanceo a RT.
18. Enjuague brevemente en PBS.
19. Coloque una gota del reactivo anti-fade en un cristal de cubierta (22 mm x 50 mm) y coloque un vaso sanguíneo en el cristal de la cubierta con el endotelio hacia abajo.
20. Coloque un cristal de diapositivas (22 mm x 75 mm) en el vaso sanguíneo evitando las burbujas de atrapamiento.
21. Coloque la diapositiva en un paño de laboratorio limpio ( por ejemplo, Kimwipe) y cubra la diapositiva con dos piezas de trapo de laboratorio. Coloque suavemente 3,5 kg de peso ( por ejemplo, use una botella de agua en un libro grueso) en la diapositiva durante un máximo de 5 min para aplanar la muestra de vaso sanguíneo en la cara.
22. Retire el peso y limpie el exceso de solución alrededor de la cubreobjetos.
23. Aplique esmalte de uñas en las 4 esquinas de la cubreobjetos, coloque las diapositivas en una caja de diapositivas, con el lado de la tapa hacia arriba y manténgala en la oscuridad a la RT(O 4ºC) durante la noche. Este proceso aplana el tejido más lejos y hace más fácil hacer la microscopía con aumentos grandes.
24. Selle el cubreobjetos completamente usando esmalte de uñas.
25. Realizar la microscopía tan pronto como el esmalte de uñas esté seco.
26. Si es necesario, guarde los portaobjetos a -20 ° C.

Resultados

En la Figura 3 se muestra una imagen típica de inmunofluorescencia en cara del endotelio. Esta imagen muestra una única sección óptica de una aorta del ratón tomada cerca de la abertura de una arteria intercostal (el área oscura grande en forma de huevo). La aorta se tiñó doblemente con anti-VE-cadherina (verde) y anti-VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular-1) (rojo). Cada célula endotelial se delinea con una tinción lineal verde en la unión de adhere...

Discusión

Al manejar los vasos sanguíneos del ratón, es importante recordar que el endotelio es frágil y que cualquier fuerza mecánica excesiva dañará las células endoteliales. Por ejemplo, las células endoteliales se rompen o se separan de la pared del vaso si el vaso es perfundido con demasiada fuerza, lo cual puede suceder fácilmente cuando la vasculatura se perfunda usando una jeringa manual.

Para obtener una presión de perfusión constante, utilizamos un sistema de perfusión por graved...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride injection solution USP 500ml bag	Fisher Scientific	NC9788429
12-well plates	Fisher Scientific	12556005
6-0 coated vicryl suture	Ethicon	J833G
AF488 goat anti-rat IgG	Life Technologies	A11006
AF546 goat anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Rabbit polyclonal IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoclave Wrap. 24x24in	Cardinal Health	4024
Blunt retractors, 2.5mm wide	Fine Science Tools	18200-10
Caprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Chlorhexidine Scrub, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Curity gauze sponges 2x2	Cardinal Health	KC2146
Electric heating pad, 12X14	Fisher Scientific	NC0667724
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Iris Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Micro cover glass 22x50mm	VWR	48393059
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-18
normal goat serum	Equitech-Bio	GS05
Paraformaldehyde Solution 4% in PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Petri Dishes 100x15mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Antifade mountant with DAPI	Life Technologies	P-36935
Puritan cortton swabs	VWR	10806-005
Puritan Mini cotton tipped aplicators	VWR	82004-050
Round handled Needle Holder	Fine Science Tools	12076-12
Silk Suture 6/0	Fine Science Tools	18020-60
Spring scissors	ROBOZ	RS-5601
Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14075-09
Super Grip Forceps	Fine Science Tools	00649-11
Transparent Dressing	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000