草药的制备:洱西汤和含茜素的血清<em&gt;体内</em&gt;和<em&gt;体外</em&gt;实验

摘要

在这里，我们以四个步骤 - 浸泡，煎煮，过滤和浓缩四个步骤介绍了一种呃ian汤（EXD）的制备方法，并且证明了给大鼠制备的含有EXD的血清。这些方法适用于中药等中草药的体内和体外研究。

摘要

传统草药是临床环境中的替代药物，近年来受到越来越多的关注。在运送到身体之前，通常需要额外的提取方法来从原料中释放活性成分。水煎剂是一种经典的提取方法，在临床环境中仍然广泛应用。在这里，我们提出了一个详细的呃ian汤（EXD）方案，以便将草药煎药应用于实验研究。描述了动物适当剂量的计算，以及EXD的四个主要步骤:浸泡，水煎剂，过滤和浓缩。此外，将含有血清的EXD作为体外验证手段引入大鼠。在这里，大鼠经口给予EXD三天。然后收集血液样品，灭活，离心和过滤。用培养基稀释的血清可用于治疗v。中的细胞或组织itro。例如，EXD被应用于体内和体外研究，并且表明EXD增强成骨。该方案可作为草药的制备和应用参考。

引言

对传统草药研究和应用的兴趣目前正在增长。与现代药物相反，化学成分明确，草药配方有一些未知的成分，需要提取过程才能使其活性化合物交付。虽然许多研究尝试选择一种具有众所周知结构的小化合物作为全草药或草药配方的代表，但药理作用和机制均不能等同于^1,2 。虽然指纹图谱能够分析复方草药配方的成分，但一些成分仍未得到清晰分析，结合所有研究提取物³时会带来挑战。许多成分/提取物的相互作用介导中草药的治疗效果。为了保留这个优势，传统的提取物形式 - 煎煮离子 - 仍然广泛应用于诊所。由于提取方法对治疗效果有很大影响，因此传统水煎剂的标准方案是必要的，特别是对于体内研究^4,5 。

另一方面，当探索药理机制时，体外或体外研究中草药煎剂的施用也是一个挑战。药物血清的概念最初由Tashino于1988年提出⁶ 。从那时起，越来越多的研究人员将其应用于草药^7,8,9 。虽然含药血清的方法有一定的局限性，如血清某些成分的影响，但仍被认为是与生理条件密切相关的方法。

二十世纪五十年代初开发的二味汤是为了缓解更年期症状10,11,12,13。它也被应用于治疗再生障碍性贫血¹⁴ ，更年期骨质疏松症^15,16,17 ，早产卵巢功能衰竭¹⁸ ，乳腺癌¹⁹ ，卵巢癌²⁰和延迟青春期²¹ 。在这里，我们提出了制定呃ian汤（EXD）及其含药血清的详细方案。此外，我们描述了含有EXD和EXD的血清对鼠绝经期骨质疏松模型的应用。

一个EXD由9g Curculigo orchioides Gaertn ， Herbaa Epimedii组成 + ， 甘草和当归，每个成年患者每天6g 皮质黄柏和根瘤菌 。基于以下等式^22，小鼠的等效剂量为0.1418EXD / kg /天:dB = dA * RB / RA *（WA / WB） ^1/3 。 dA和dB分别表示人和小鼠每体重的剂量（mg / kg）。剂量（mg / kg）由EXD / kg的数量代替。 RA和RB分别代表（体表面积（m ² ）/体重（kg）） ^2/3 （ 参见表1 ）成比例的人体因子和小鼠体内因子。 WA和WB分别表示人和小鼠的体重（kg）。

研究方案

该协议遵循上海中医药大学动物护理方针，经动物实验上海动物伦理委员会批准。

议定书I:准备EXD

1. 计算
   1. 将EXD给予10名6个月大的雌性印记控制区（ICR）小鼠（0.02kg /小鼠）的治疗组，每周5天，持续12周。
      注意:需要总共1.702个EXD。因为EXD是以离散的增量来衡量的，在实际中，管理2个EXD。
   2. 计算每只小鼠施用的EXD的体积（ 即 V =（0.1418EXD / kg·天）*（0.02kg /小鼠）* 50mL / EXD = 0.14mL /小鼠·天）。
2. 浸水
   1. 将两种EXD（ 即，Curculigo orchioides Gaertn （18 g）， Herbaa Epimedii （18 g））， 甘草 （18 g）， R将当归（18g）， 皮质黄柏 （12g）和黑曲霉 （12g），总共96g）放入具有盖子的容器中。
      注意:建议使用陶瓷容器。
   2. 用500毫升蒸馏水将原始草药切片1小时;水应该覆盖草药约一英寸。让所有的草药彻底浸泡。
3. 第一水煎剂
   1. 用大功率的燃气灶或电磁炉加热草药，直到水沸腾（约5-10分钟;时间间隔取决于加热功率，容器和草药和水量）。将电源降低到低炖煮2小时。
4. 先过滤
   1. 用常规滤纸或纱布和棉布覆盖500 mL玻璃烧杯。通过过滤器小心倒入烧杯中。把草药放在容器中。
   2. 返还剩余的草药残留物o把滤纸放到容器上。
5. 第二汤水
   1. 用草药将蒸馏水加入容器中;让它覆盖草药约一英寸。
   2. 重复步骤1.3。
6. 二次过滤
   1. 重复步骤1.4.1和1.4.2。
   2. 将第二汤匙倒入同一个烧杯中。将第一和第二汤匙混合在一起。
7. 浓度
   1. 将烧杯放在燃气灶之间，用无石棉丝网将它们之间加热，用低温炖煮，并用玻璃棒慢慢地连续搅拌。
   2. 当煎剂减少到200 mL时，将其转移到500 mL烧杯中。
   3. 重复步骤1.7.1，直到煎剂减至100 mL。
8. 储存和管理
   1. 将浓缩汤汁转移到无菌玻璃瓶中。让它凉快到室温re（RT）。如果在一周内或-70°C使用长期储存，请在4°C储存。
   2. 使用管饲针，向卵巢切除（OVX）小鼠施用0.14mL /小鼠煎剂一天，每周5天，持续12周。

2.议定书二:含EXD的血清的制备

1. 计算
   1. 计算每只大鼠（1个月大）体重0.15 kg的大鼠当量（RED）:dB =（1/60）*（90/100）*（60 / 0.15） ^1/3 = 0.111 EXD / kg /天。
      注意:需要总共10ml的含EXD血清以制备100mL培养基（含10％含EXD的血清）。预计每只大鼠提供2mL的血清。因此，每天一次，需要6只大鼠（20％的损失被考虑在内）3天。 EXD的数量是:（0.111EXD / kg•天）*（0.15kg /大鼠）*（6只大鼠）*（3天）= 0.300EXD。再次，因为EXD以离散增量测量，使用1 EXD。
   2. 计算每只大鼠施用的EXD体积（ 即 V =（0.111EXD / kg·天）*（0.15kg /大鼠）*（50mL / EXD）= 0.83mL /大鼠·天）。
2. 浸水
   1. 将1 EXD的原料放入带盖的容器中。将原料在蒸馏水中浸泡1小时;水应该覆盖草药约一英寸。让所有的草药彻底浸泡。
3. 第一水煎剂
   1. 用高功率的电磁炉加热草药，直到水沸腾（约5 - 10分钟;时间间隔取决于热量，容器和草药和水量）。将电源切换到低炖煮2小时。
4. 先过滤
   1. 用常规滤纸或纱布和棉布覆盖500 mL玻璃烧杯。通过过滤器小心倒入烧杯中。把草药放在容器中。
   2. 将滤纸上的草药残渣送回容器。
5. 第二汤水
   1. 用草药将蒸馏水加入容器中;让它覆盖草药约一英寸。
   2. 重复步骤2.4。
6. 二次过滤
   1. 重复步骤2.5.1和2.5.2。
   2. 将第二汤匙倒入与步骤2.4.1中相同的烧杯中，并将第一和第二汤匙混合在一起。
7. 浓度
   1. 将烧杯放在燃气灶之间，用无石棉丝网将它们之间加热，并用低温炖煮，并用玻璃棒慢慢连续搅拌。
   2. 当煎剂降至100 mL时，将其转移到100 mL烧杯中。
   3. 重复步骤2.7.1，直到煎煮至50 mL。
8. 储存和管理
   1. 将浓缩汤汁转移至灭菌剂中ile玻璃瓶。让它凉爽到RT。如果在一周内或-70°C使用长期储存，请在4°C储存。
   2. 腹腔内给予0.83mL /天，每天一次，持续3天。
9. 含EXD的血清制剂
   1. 在最后一次给药后1小时腹腔注射300 mL / 100g 80 mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪麻醉麻醉大鼠。通过脚趾捏捏确认适当的麻醉。
   2. 使用手术刀（或直接操作的剪刀）将大鼠的皮肤和腹膜从腹部切除到胸部的底部。创建长度和深度分别为5厘米和0.5厘米的切口。使用薄纸将腹部内脏移至左侧。
   3. 使用薄纸，去除腹主动脉的结缔组织，以清楚地暴露血管。
   4. 使用10 mL，22号注射器从腹主动脉缓慢吸取血液。转移到取出针后取出15 mL无菌管;一只大鼠可以产生8-10毫升血液。
      注意:开始抽血时，大鼠应该活着（ 即腹部主动脉脉动），完成后，死亡。
   5. 在室温下将血液凝固在直立位置30-60分钟。以500-600 xg离心20分钟。将所有上清液（血清）小心地放入一个50mL无菌管中，并将所有血清（来自不同动物）混合在一起。
   6. 通过在56℃水浴中孵育血清30分钟来进行热灭活。使用具有0.22μm孔径的亲水性聚醚砜膜的注射器过滤器过滤血清。使用新鲜血清或将其储存在-20°C。
10. 对照药物血清制剂（用于对照组）
    1. 用相同体积的盐水（0.83mL）每天施用每只大鼠一次，持续3天。其他步骤与步骤2.9相同。
11. 应用
    1. 向每100mL培养基加上1％的青霉素 - 链霉素（PS） ²³加入含有EXD的血清或含药血清。

结果

EXD对OVX小鼠骨密度的影响

腰椎椎体部分的苏木精和伊红（H＆E）染色显示体外EXD处理后增加的骨小梁（ 图1A ，右图）与OVX组相比（ 图1A ，左图）。 图1B显示OVX小鼠（ 图1B ，左图）和EXD处理12周的OVX小鼠的代表性μCT图像（ 图1B ，右图）。在EXD治疗的小鼠的腰椎椎弓?...

讨论

近年来，更多的关注草药，一种在东方世界临床环境中应用了数千年的替代药物。传统草药与现代医学的"长凳式"床不同，首先需要"床到凳"的模式来解释他们的机制。这可以在后台进行验证，并进行开发新优化药物的处理。到目前为止，已经报道了从整个配方或草药释放活性成分的几种提取方法。其中，水提取是最广泛使用的。

中草药的提取有四个基本步骤。第一步是浸泡?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)	Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)	160922	EXD components
Filter paper	GElifesciences	99-103-952	Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	In vivo study
Sprague Dawley rats	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	EXD-containing serum preparation
Syringe filter	Millipore	SLGP033RB	0.22 µm
gavage needles (10 ml)	Shanghai BO Ge trade sales department	59104274	Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)	Fujian Gutian Pharma Co. Ltd	H35020148	Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)	Sunway Pharma Co. Ltd	CB07591	Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium	Gibco	12800-116	DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin	Sigma	1277	100 µg / ml
Penicillin	Sigma	4687	100 µg / ml