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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous présentons la préparation d'une décoction er-xian (EXD) en quatre étapes, trempage, décoction, filtration et concentration, et démontrons l'administration d'un sérum contenant EXD préparé à des rats. Ces méthodes s'appliquent à l'étude in vivo et in vitro des décoctions à base de plantes telles que les médicaments traditionnels chinois.

Résumé

La médecine traditionnelle à base de plantes, une médecine alternative dans le milieu clinique, a reçu une attention accrue ces dernières années. Avant la livraison au corps, une procédure d'extraction supplémentaire est communément requise pour libérer les constituants actifs des herbes brutes. La décoction de l'eau est une procédure d'extraction classique qui est encore largement utilisée dans les milieux cliniques. Ici, nous proposons un protocole détaillé pour la décoction er-xian (EXD) afin d'appliquer des décoctions à base de plantes à des études expérimentales. On décrit le calcul d'une dose adaptée aux animaux, ainsi que les quatre étapes principales de l'EXD: trempage, décoction de l'eau, filtration et concentration. De plus, l'EXD contenant du sérum est introduit chez les rats comme moyen de validation in vitro . Ici, les rats ont été administrés par voie orale EXD pendant trois jours. Les échantillons de sang ont ensuite été recueillis, inactivés, centrifugés et filtrés. Le sérum, dilué avec le milieu de culture, peut être utilisé pour traiter les cellules ou les tissus dans vItro. Par exemple, EXD a été appliqué à la fois à des études in vivo et in vitro et a démontré que EXD améliore l'ostéogenèse. Ce protocole peut être utilisé comme référence pour la préparation et l'application de plantes médicinales.

Introduction

L'intérêt pour l'étude et l'application de la phytothérapie traditionnelle augmente actuellement. Par opposition aux médicaments modernes, dans lesquels les ingrédients chimiques sont définis, les formules à base de plantes contiennent des ingrédients inconnus et nécessitent des procédés d'extraction pour permettre la distribution de leurs composés actifs. Bien que de nombreuses études tentent de sélectionner un petit composé avec une structure bien connue comme représentant de l'herbe entière ou de la formule à base de plantes, ni les efficacités pharmacologiques ni les mécanismes ne peuvent être considérés comme équivalents 1 , 2 . Bien que les empreintes digitales permettent d'analyser les constituants des formules à base de plantes complexes, certains constituants ne sont toujours pas clairement analysés, ce qui entraîne un défi lors de la combinaison de tous les extraits d'étude 3 . Les interactions de nombreux constituants / extraits mesurent les effets thérapeutiques des plantes médicinales. Pour conserver cet avantage, la forme-décoct traditionnelle d'extraitIon - est encore largement utilisé dans la clinique. Comme la procédure d'extraction a un impact important sur l'efficacité thérapeutique, un protocole standard de décoction traditionnelle d'eau est nécessaire, en particulier pour les études in vivo 4 , 5 .

D'autre part, lors de l'exploration de mécanismes pharmacologiques, l'administration de décoctions à base de plantes lors d'études in vitro ou ex vivo est également un défi. La notion de sérum contenant des médicaments a d'abord été proposée par Tashino en 1988 6 . Depuis lors, un nombre croissant de chercheurs l'ont appliquée à la phytothérapie 7 , 8 , 9 . Bien que la méthode du sérum contenant du médicament présente certaines limites, telles que l'influence de certains composants du sérum, elle est encore considérée comme une méthode qui imite de près les conditions physiologiques.

La décoction er-xian a été développée au début des années 1950 pour soulager les symptômes ménopausiques 10 , 11 , 12 , 13 . Il a également été appliqué au traitement de l'anémie aplasique 14 , l'ostéoporose ménopausique 15 , 16 , 17 , l'insuffisance ovarienne prématurée 18 , le cancer du sein 19 , le cancer de l'ovaire 20 et la puberté retardée 21 . Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour la préparation à la fois de la décoction er-xian (EXD) et de son sérum contenant des médicaments. De plus, nous décrivons l'application de sérum contenant EXD et EXD aux modèles d'ostéoporose ménopausique murine.

Un EXD est composé de 9 g chacun de Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii , Radix Morindae Officinalis et Radix Angelicae Sinensis et 6 g de Cortex Phellodendri et Rhizoma Anemarrhenae par patient adulte par jour. La dose équivalente pour une souris est de 0,1418 EXD / kg / jour selon l'équation suivante 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA et dB font référence à la dose par poids corporel (mg / kg) de l'homme et de la souris, respectivement. La dose, en mg / kg, est remplacée par le nombre d'EXD / kg. La RA et la RB représentent respectivement le facteur corporel humain et le facteur corporel de la souris, qui sont proportionnels à la (surface corporelle (m 2 ) / poids corporel (kg)) 2/3 (voir tableau 1 ). WA et WB indiquent le poids corporel (kg) de l'homme et de la souris, respectivement.

Protocole

Le protocole suit les directives sur les soins des animaux de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai et est approuvé par l'expérimentation animale du Comité d'éthique animale de Shanghai.

1. Protocole I: Préparation de l'EXD

  1. Calcul
    1. Administrer l'EXD à un groupe de traitement de 10 souris de six mois de la région de contrôle d'impression féminine (ICR) (0,02 kg / souris), 5 jours par semaine pendant 12 semaines.
      REMARQUE: un total de 1,702 EXDs est nécessaire. Étant donné que les EXD sont mesurés par incréments discrets, dans la pratique réelle, administrez 2 EXD.
    2. Calculez le volume d'EXD appliqué par souris ( c'est-à-dire V = (0.1418 EXD / kg • jour) * (0.02 kg / souris) * 50 mL / EXD = 0.14 mL / mouse • day).
  2. Trempage
    1. Mettre toutes les matières premières de deux EXD ( c.-à-d., Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) et Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g au total) dans un récipient avec un couvercle.
      REMARQUE: Un récipient en céramique est recommandé.
    2. Macer les herbes brutes avec 500 ml d'eau distillée pendant 1 heure; L'eau devrait couvrir les herbes d'environ un pouce. Laissez toutes les herbes tremper soigneusement.
  3. Première décoction de l'eau
    1. Chauffer les herbes à l'aide d'un cuisinière à gaz ou d'une cuisinière à induction à haute puissance jusqu'à ce que l'eau bouillonne (environ 5 à 10 minutes, la durée dépend de la puissance de chauffage, du récipient et de la quantité d'herbes et d'eau). Mettez l'appareil hors tension pendant 2 h.
  4. Première filtration
    1. Couvrir un gobelet en verre de 500 ml avec du papier filtre ordinaire ou avec de la gaze et du coton. Déposer soigneusement la décoction dans le bécher à travers le filtre. Laissez les herbes dans le récipient.
    2. Renvoyer les résidus de fines herbesN le papier filtre sur le contenant.
  5. Deuxième décoction d'eau
    1. Ajouter de l'eau distillée au récipient avec les herbes; Laissez-le couvrir les herbes d'environ un pouce.
    2. Répétez l'étape 1.3.
  6. Deuxième filtration
    1. Répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2.
    2. Verser la deuxième décoction dans le même bécher. Mélanger ensemble la première et la seconde décoctions.
  7. Concentration
    1. Mettez le bécher sur un cuisinier à gaz avec de la gazine métallique sans amiante entre eux, faites chauffer la décoction à l'aide d'un mijot bas et remuez lentement et continuellement avec une tige de verre.
    2. Lorsque la décoction se réduit à 200 mL, transférez-la à un bécher de 500 ml.
    3. Répétez l'étape 1.7.1 jusqu'à ce que la décoction soit réduite à 100 mL.
  8. Stockage et administration
    1. Transférer la décoction concentrée dans une bouteille en verre stérile. Laissez refroidir à la température ambianteRe (RT). Conserver à 4 ° C si vous utilisez dans une semaine ou à -70 ° C pour un stockage à long terme.
    2. À l'aide d'une aiguille de gavage, administrer 0,14 mL / souris de la décoction à des souris ovariectomisées (OVX) une fois par jour, 5 jours par semaine pendant 12 semaines.

2. Protocole II: Préparation du Sérum contenant EXD

  1. Calcul
    1. Calculez la dose d'équivalent de rat (ROUGE) en utilisant 0,15 kg comme poids corporel de chaque rat (1 mois): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / Kg / jour.
      REMARQUE: Un total de 10 ml de sérum contenant EXD est nécessaire pour préparer 100 ml de milieu de culture (10% de sérum contenant EXD). Chaque rat devrait fournir 2 mL de sérum. Ainsi, 6 rats (une perte de 20% est pris en compte) sont nécessaires pour l'administration EXD une fois par jour pendant 3 jours. Le nombre d'EXD est: (0.111 EXD / kg • jour) * (0.15 kg / rat) * (6 rats) * (3 jours) = 0.300 EXD. Encore une fois, parce que les EXD sont mesurés par incréments discrets,Utilisez 1 EXD.
    2. Calculer le volume d'EXD appliqué par rat ( c.-à-d., V = (0.111 EXD / kg • jour) * (0.15 kg / rat) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rat • jour).
  2. Trempage
    1. Mettez les matières premières pour 1 EXD dans un récipient avec un couvercle. Macerer les herbes brutes dans de l'eau distillée pendant 1 heure; L'eau devrait couvrir les herbes d'environ un pouce. Laissez toutes les herbes tremper soigneusement.
  3. Première décoction de l'eau
    1. Chauffer les herbes à l'aide d'une cuisinière à induction à haute puissance jusqu'à ce que l'eau bouillonne (environ 5 à 10 minutes, la durée dépend de la puissance de la chaleur, du récipient et de la quantité d'herbes et d'eau). Mettez l'alimentation hors tension à feu doux pendant 2 h.
  4. Première filtration
    1. Couvrir un gobelet en verre de 500 ml avec du papier filtre ordinaire ou avec de la gaze et du coton. Déposer soigneusement la décoction dans le bécher à travers le filtre. Laissez les herbes dans le récipient.
    2. Retournez les résidus d'herbes sur le papier filtre sur le récipient.
  5. Deuxième décoction d'eau
    1. Ajouter de l'eau distillée au récipient avec les herbes; Laissez-le couvrir les herbes d'environ un pouce.
    2. Répétez l'étape 2.4.
  6. Deuxième filtration
    1. Répétez les étapes 2.5.1 et 2.5.2.
    2. Verser la deuxième décoction dans le même bécher comme à l'étape 2.4.1 et mélanger ensemble la première et la seconde décoctions.
  7. Concentration
    1. Mettez le bécher sur une cuisinière à gaz avec une gaze de fil sans amiante entre eux, faites chauffer la décoction à l'aide d'un mijot bas et remuez lentement et continuellement avec une tige en verre.
    2. Lorsque la décoction se réduit à 100 mL, transférez-la à un bêcher de 100 ml.
    3. Répétez l'étape 2.7.1 jusqu'à ce que la décoction se réduise à 50 mL.
  8. Stockage et administration
    1. Transférer la décoction concentrée en une stérileBouteille en verre. Laissez refroidir à la RT. Conserver à 4 ° C si vous utilisez dans une semaine ou à -70 ° C pour un stockage à long terme.
    2. Administrer intragastriquement 0,83 ml / rat une fois par jour pendant 3 jours.
  9. Préparation de sérum contenant EXD
    1. Anesthésier les rats par injection intraperitoneale de 300 mL / 100 g de 80 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine à 1 h après la dernière administration d'EXD. Confirmer une anesthésie appropriée par pincement.
    2. Incitez la peau et le péritoine du rat de l'abdomen au bas du thorax à l'aide d'un scalpel (ou des ciseaux à action directe). Créez une incision de longueur et de profondeur d'environ 5 cm et 0,5 cm, respectivement. Déplacez les viscères abdominaux vers la gauche en utilisant du papier de soie.
    3. À l'aide de papier de soie, retirer le tissu conjonctif de l'aorte abdominale pour exposer clairement le vaisseau.
    4. Dessinez lentement le sang de l'aorte abdominale en utilisant une seringue de calibre 22 de 10 ml. Transférer àUn tube stérile de 15 ml après avoir retiré l'aiguille; Un rat peut produire 8 à 10 ml de sang.
      REMARQUE: Le rat doit être vivant ( c.-à-d. Avec l'impulsion de l'aorte abdominale) lorsque vous commencez le dessin du sang et que vous avez décroché après la fin du dessin.
    5. Incorporer le sang dans une position verticale pendant 30 à 60 min à la RT de la pièce. Centrifuger à 500-600 xg pendant 20 min. Placez soigneusement tout le surnageant (sérum) dans un tube stérile de 50 ml et mélangez ensemble le sérum (de différents animaux).
    6. Effectuer l'inactivation de la chaleur en incubant le sérum dans un bain d'eau à 56 ° C pendant 30 min. Filtrer le sérum en utilisant un filtre à seringue avec une membrane de polyéthersulfone hydrophile de taille de pores de 0,22 μm. Utiliser le sérum frais ou le conserver à -20 ° C.
  10. Préparation de sérum contenant un médicament témoin (utilisé dans le groupe témoin)
    1. Administrer chaque rat avec le même volume de solution saline (0,83 ml) une fois par jour pendant 3 jours. Les autres étapes sont identiques à celles de l'étape 2.9.
  11. Application
    1. Ajouter 10 ml de sérum contenant un excès de SOR ou de médicament contenant EXD à chaque 100 ml de milieu, plus 1% de pénicilline-streptomycine (PS) 23 .

Résultats

L'effet d'EXD sur la densité osseuse des souris OVX

La coloration de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) de la colonne vertébrale lombaire montre des trabécules osseuses accrues après traitement EXD in vivo ( figure 1A , panneau droit) par rapport à celles du groupe OVX ( figure 1A , panneau de gauche). La figure 1B montre les images μCT rep...

Discussion

Au cours des dernières années, on a accordé plus d'attention aux médicaments à base de plantes, un type de médicament alternatif appliqué dans le milieu clinique dans le monde oriental depuis des milliers d'années. Différente du modèle de la médecine moderne "banc à lit", la médecine traditionnelle à base de plantes nécessite d'abord le modèle "lit à banc" pour expliquer leurs mécanismes. Cela peut être suivi d'une validation effectuée au niveau du banc et du trait...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81573992). Nous remercions Emily K. Lo et Kathleen DiNapoli pour leur aide à l'édition de langue.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)160922EXD components
Filter paperGElifesciences99-103-952Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) miceShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005In vivo study
Sprague Dawley ratsShanghai Laboratory Animal CenterSCXK 2007-0005EXD-containing serum preparation
Syringe filterMilliporeSLGP033RB0.22 µm
gavage needles (10 ml)Shanghai BO Ge trade sales department59104274Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg) Fujian Gutian Pharma Co. LtdH35020148Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)Sunway Pharma Co. LtdCB07591Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture mediumGibco12800-116DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
StreptomycinSigma1277100 µg / ml
PenicillinSigma4687100 µg / ml

Références

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