Vorbereitung der Kräutermedizin: Er-Xian Decoction und Er-Xian-haltiges Serum für<em&gt; In vivo</em&gt; Und<em&gt; In vitro</em&gt; Experimente

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir die Vorbereitung eines Er-Xian-Abkochens (EXD) in vier Stufen - Einweichen, Abkühlen, Filtrieren und Konzentrieren - und zeigen die Verabreichung eines präparierten EXD-haltigen Serums an Ratten. Diese Methoden gelten für die in vivo und in vitro Studie von pflanzlichen Abkochungen wie traditionelle chinesische Medikamente.

Zusammenfassung

Traditionelle Kräutermedizin, eine alternative Medizin in der klinischen Einstellung, hat in den letzten Jahren verstärkte Aufmerksamkeit erhalten. Vor der Auslieferung an den Körper ist ein zusätzliches Extraktionsverfahren üblicherweise erforderlich, um die aktiven Bestandteile aus Rohkräutern freizusetzen. Wasserabkochung ist ein klassisches Extraktionsverfahren, das in den klinischen Einstellungen immer noch weit verbreitet ist. Hier schlagen wir ein detailliertes Protokoll für die Er-xian-Abkochung (EXD) vor, um pflanzliche Abkochungen auf experimentelle Studien anzuwenden. Die Berechnung einer tierrelevanten Dosis wird ebenso beschrieben wie die vier Hauptschritte von EXD: Einweichen, Wasserabkochen, Filtration und Konzentration. Darüber hinaus wird serumhaltiges EXD an Ratten als Mittel der in vitro- Validierung eingeführt. Hier wurden Ratten für drei Tage oral verabreicht. Blutproben wurden dann gesammelt, inaktiviert, zentrifugiert und filtriert. Das mit dem Kulturmedium verdünnte Serum kann zur Behandlung von Zellen oder Geweben in v verwendet werdenItro Beispielsweise wurde EXD sowohl in vivo als auch in vitro untersucht und gezeigt, dass EXD die Osteogenese verstärkt. Dieses Protokoll kann als Referenz für die Vorbereitung und Anwendung von pflanzlichen Arzneimitteln verwendet werden.

Einleitung

Das Interesse an der Studie und Anwendung der traditionellen Kräutermedizin wächst derzeit. Im Gegensatz zu modernen Medikamenten, in denen chemische Bestandteile definitiv sind, haben pflanzliche Formeln einige unbekannte Zutaten und erfordern Extraktionsverfahren, um die Abgabe ihrer Wirkstoffe zu ermöglichen. Obwohl viele Studien versuchen, eine kleine Verbindung mit einer bekannten Struktur als Vertreter der ganzen Kräuter- oder Kräuterformel auszuwählen, können weder die pharmakologischen Wirkungen noch Mechanismen als gleichwertig angesehen werden ^{1 , 2} . Während der Fingerabdruck die Analyse der Bestandteile komplexer pflanzlicher Formeln ermöglicht, werden einige Bestandteile noch nicht klar analysiert, was zu einer Herausforderung führt, wenn alle Extrakte für die Studie ³ kombiniert werden. Die Wechselwirkungen zahlreicher Bestandteile / Extrakte vermitteln die therapeutischen Wirkungen von pflanzlichen Arzneimitteln. Um diesen Vorteil zu behalten, wird der traditionelle Auszugsformular dekodiertIon ist in der Klinik immer noch weit verbreitet. Da das Extraktverfahren einen großen Einfluss auf die therapeutische Wirksamkeit hat, ist ein Standardprotokoll der traditionellen Wasserabkochung notwendig, insbesondere für in vivo Studien ^{4 , 5} .

Auf der anderen Seite ist bei der Erforschung pharmakologischer Mechanismen auch die Verabreichung von Kräuterdekuren während der In-vitro- oder Ex-vivo- Studien eine Herausforderung. Das Konzept eines drogenhaltigen Serums wurde erstmals 1988 von Tashino vorgeschlagen ⁶ . Seitdem haben immer mehr Forscher die Kräutermedizin ^{7 , 8 , 9} angewendet. Obwohl die Methode des Arzneimittel-enthaltenden Serums einige Einschränkungen aufweist, wie der Einfluss bestimmter Bestandteile des Serums, gilt es immer noch als eine Methode, die physiologische Zustände imitiert.

Die er-xian Abkochung wurde in den frühen 1950er Jahren entwickelt, um die Wechseljahre Symptome zu entlasten ^{10 , 11 , 12 , 13} . Es wurde auch auf die Behandlung von aplastischen Anämie ¹⁴ , Menopause Osteoporose ^{15 , 16 , 17} , vorzeitige Eierstockversagen ¹⁸ , Brustkrebs ¹⁹ , Eierstockkrebs ²⁰ und verspätete Pubertät angewendet ²¹ . Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Herstellung sowohl des Er-Xian-Abkochens (EXD) als auch seines medikamentenhaltigen Serums vor. Darüber hinaus beschreiben wir die Anwendung von EXD und EXD-haltigem Serum, um menopausale osteoporotische Modelle zu mähen.

Eine EXD besteht aus 9 g Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii , Radix Morindae Officinalis und Radix Angelicae Sinensis und jeweils 6 g Cortex Phellodendri und Rhizoma Anemarrhenae pro erwachsenen Patienten pro Tag. Die äquivalente Dosis für eine Maus ist 0,1418 EXD / kg / Tag, bezogen auf die folgende Gleichung ²² : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) ^1/3 . DA und dB beziehen sich auf die Dosis pro Körpergewicht (mg / kg) des Menschen bzw. der Maus. Die Dosis in mg / kg wird durch die Anzahl der EXD / kg ersetzt. RA und RB repräsentieren den menschlichen Körperfaktor bzw. den Mauskörperfaktor, die proportional zur (Körperoberfläche (m ² ) / Körpergewicht (kg)) ^{2/3 sind} (siehe Tabelle 1 ). WA und WB geben das Körpergewicht (kg) des Menschen bzw. der Maus an.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine und ist von der Tierversuch Shanghai Animal Ethics Committee genehmigt.

1. Protokoll I: Vorbereitung von EXD

1. Berechnung
   1. Verabreichen Sie die EXD einer Behandlungsgruppe von 10 Sechs Monate alten weiblichen Imprinting Control Region (ICR) Mäusen (0,02 kg / Maus), 5 Tage pro Woche für 12 Wochen.
      HINWEIS: Es werden insgesamt 1.702 EXDs benötigt. Da EXDs in diskreten Inkrementen gemessen werden, in realer Praxis 2 EXDs verabreichen.
   2. Berechnen Sie das Volumen der EXD, das pro Maus aufgetragen wird ( dh V = (0,1418 EXD / kg • Tag) * (0,02 kg / Maus) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / Maus • Tag).
2. Einweichen
   1. Setzen Sie alle Rohstoffe von zwei EXDs ( zB Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) und Rhizoma Anemarrhenae (12 g), insgesamt 96 g) in einen Behälter mit Deckel.
      HINWEIS: Ein keramischer Behälter wird empfohlen.
   2. Mischen Sie die rohen Kräuter mit 500 ml destilliertem Wasser für 1 Stunde; Das Wasser sollte die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken. Lass alle Kräuter gründlich einweichen.
3. Erste Wasserabkochung
   1. Die Kräuter mit einem Gaskocher oder einem Induktionsherd bei hoher Leistung erhitzen, bis das Wasser kocht (ca. 5 - 10 min, die Zeitspanne hängt von der Heizleistung, dem Behälter und der Menge an Kräutern und Wasser ab). Schalten Sie die Stromversorgung zu einem schwachen köcheln für 2 h.
4. Erste Filtration
   1. Bedecken Sie ein 500-ml-Glasbecher mit normalem Filterpapier oder mit Gaze und Baumwolle. Die Abkochung vorsichtig in den Becher durch den Filter abgießen. Lassen Sie die Kräuter in den Behälter.
   2. Den restlichen pflanzlichen Rückstand zurückgeben oN das Filterpapier zum Behälter.
5. Zweite Wasserabkochung
   1. Füge dem Behälter mit den Kräutern destilliertes Wasser hinzu. Lass es die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.3.
6. Zweite Filtration
   1. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 und 1.4.2.
   2. Gießen Sie die zweite Abkochung in den gleichen Becher. Mischen Sie die erste und zweite Abkochung zusammen.
7. Konzentration
   1. Setzen Sie den Becher auf einen Gaskocher mit asbestfreien Drahtgaze zwischen ihnen, erhitzen Sie den Abkochung mit einem schwachen köcheln und langsam und kontinuierlich mit einem Glasstab umrühren.
   2. Wenn die Abkochung auf 200 ml reduziert wird, transportiere sie auf ein 500-ml-Becherglas.
   3. Wiederholen Sie Schritt 1.7.1, bis die Abkürzung auf 100 ml reduziert wird.
8. Lagerung und Verwaltung
   1. Übertragen Sie die konzentrierte Abkochung auf eine sterile Glasflasche. Lass es auf Raumtemperatur abkühlenRe (RT). Bei 4 ° C bei einer Verwendung von einer Woche oder bei -70 ° C zur Langzeitlagerung aufbewahren.
   2. Mit einer Spülladel 0,14 ml / Maus des Abkochens an ovariektomierte (OVX) Mäuse einmal pro Tag, 5 Tage pro Woche für 12 Wochen.

2. Protokoll II: Herstellung von EXD-haltigem Serum

1. Berechnung
   1. Berechnen Sie die Ratten-Äquivalent-Dosis (RED) mit 0,15 kg als Körpergewicht jeder Ratte (1 Monat alt): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) ^1/3 = 0,111 EXD / Kg / Tag.
      HINWEIS: Es werden insgesamt 10 ml EXD-haltiges Serum benötigt, um 100 ml Kulturmedium (10% EXD-haltiges Serum) herzustellen. Es wird erwartet, dass jede Ratte 2 ml Serum liefert. So werden 6 Ratten (ein 20% Verlust berücksichtigt) für die EXD-Verabreichung einmal täglich für 3 Tage benötigt. Die Anzahl der EXDs ist: (0,111 EXD / kg • Tag) * (0,15 kg / Ratte) * (6 Ratten) * (3 Tage) = 0,300 EXD. Wiederum, weil EXDs in diskreten Schritten gemessen werden,1 EXD verwenden.
   2. Berechnen Sie das Volumen der aufgetragenen EXD pro Ratte ( dh V = (0,111 EXD / kg • Tag) * (0,15 kg / Ratte) * (50 ml / EXD) = 0,83 ml / Ratte • Tag).
2. Einweichen
   1. Legen Sie die Rohstoffe für 1 EXD in einen Behälter mit einem Deckel. Mischen Sie die rohen Kräuter in destilliertem Wasser für 1 Stunde; Das Wasser sollte die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken. Lass alle Kräuter gründlich einweichen.
3. Erste Wasserabkochung
   1. Die Kräuter mit einem Induktionsherd bei hoher Leistung erhitzen, bis das Wasser kocht (ca. 5 - 10 min, die Zeitspanne hängt von der Wärmeleistung, dem Behälter und der Menge an Kräutern und Wasser ab). Schalten Sie die Stromversorgung für 2 Std.
4. Erste Filtration
   1. Bedecken Sie ein 500-ml-Glasbecher mit normalem Filterpapier oder mit Gaze und Baumwolle. Die Abkochung vorsichtig in den Becher durch den Filter abgießen. Lassen Sie die Kräuter in den Behälter.
   2. Bringen Sie den pflanzlichen Rückstand auf das Filterpapier zum Behälter zurück.
5. Zweite Wasserabkochung
   1. Füge dem Behälter mit den Kräutern destilliertes Wasser hinzu. Lass es die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken.
   2. Wiederholen Sie Schritt 2.4.
6. Zweite Filtration
   1. Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1 und 2.5.2.
   2. Gießen Sie die zweite Abkochung in den gleichen Becher wie in Schritt 2.4.1 und mischen Sie die erste und zweite Abkochung zusammen.
7. Konzentration
   1. Setzen Sie den Becher auf einen Gaskocher mit asbestfreien Drahtgaze zwischen ihnen, erhitzen Sie den Abkochung mit einem schwachen köcheln und langsam und kontinuierlich mit einem Glasstab umrühren.
   2. Wenn die Abkochung auf 100 mL abfällt, übertrage sie in ein 100-ml-Becherglas.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.7.1, bis die Abkürzung auf 50 ml reduziert wird.
8. Lagerung und Verwaltung
   1. Übertragen Sie die konzentrierte Abkochung in ein SterIle Glasflasche Lass es auf RT abkühlen. Bei 4 ° C bei einer Verwendung von einer Woche oder bei -70 ° C zur Langzeitlagerung aufbewahren.
   2. Intragastrisch verabreichen 0,83 ml / Ratte einmal pro Tag für 3 Tage.
9. EXD-haltige Serumzubereitung
   1. Die Ratten durch intraperitoneale Injektion von 300 ml / 100 g 80 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin bei 1 h nach der letzten Verabreichung von EXD anästhesieren. Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch Zehenknecht.
   2. Die Haut und das Bauchfell der Ratte vom Bauch bis zum Boden des Thorax mit einem Skalpell (oder einer geraden Arbeitsschere) aufschneiden. Erstellen Sie einen Schnitt von Länge und Tiefe von etwa 5 cm bzw. 0,5 cm. Verschieben Sie die Bauch-Eingeweide nach links mit Seidenpapier.
   3. Mit Tissue-Papier, entfernen Sie das Bindegewebe der Bauch-Aorta, um deutlich aus dem Gefäß.
   4. Ziehen Sie das Blut langsam aus der Bauchaorta mit einer 10-ml-22-Gauge-Spritze. Übertragen Sie es aufEin 15-ml-steriles Rohr nach dem Entfernen der Nadel; Eine Ratte kann 8-10 ml Blut produzieren.
      ANMERKUNG: Die Ratte sollte am Leben sein ( dh mit der abdominalen Aorta pulsierend) beim Beginn der Blutzeichnung und tot, nachdem die Zeichnung abgeschlossen ist.
   5. Das Blut in einer aufrechten Position für 30 - 60 min bei Raum RT klopfen. Zentrifuge bei 500-600 xg für 20 min. Setzen Sie den Überstand (Serum) sorgfältig in ein 50 ml steriles Röhrchen und mischen Sie das ganze Serum (von verschiedenen Tieren) zusammen.
   6. Durchführen der Hitzeinaktivierung durch Inkubieren des Serums in einem 56 ° C Wasserbad für 30 min. Filtern des Serums unter Verwendung eines Spritzenfilters mit einer hydrophilen Polyethersulfonmembran mit einer Dicke von 0,22 μm. Verwenden Sie das Serum frisch oder lagern Sie es bei -20 ° C.
10. Kontroll-Arzneimittel enthaltende Serumzubereitung (in der Kontrollgruppe verwendet)
    1. Jede Ratte mit dem gleichen Salzgehalt (0,83 ml) einmal pro Tag für 3 Tage verabreichen. Die anderen Schritte sind die gleichen wie in Schritt 2.9.
11. Anwendung
    1. Füge 10 ml EXD-haltiges Serum oder medikamentenhaltiges Serum zu je 100 ml Medium, plus 1% Penicillin-Streptomycin (PS) ²³ hinzu.

Ergebnisse

Die Wirkung von EXD auf die Knochendichte von OVX-Mäusen

Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) -Färbung des Lendenwirbelabschnitts zeigt erhöhte Knochentrabekel nach der EXD-Behandlung in vivo (Abbildung 1A , rechte Tafel) im Vergleich zu denen in der OVX-Gruppe (Abbildung 1A , linke Tafel). Abbildung 1B zeigt die repräsentativen μCT-Bilder der 4. Lendenwirbelsäule ...

Diskussion

In den letzten Jahren wurde mehr Aufmerksamkeit auf pflanzliche Arzneimittel, eine Art von alternativen Medizin, die in der klinischen Einstellung in der östlichen Welt seit Tausenden von Jahren angewendet wurde bezahlt worden. Anders als das "Bench to Bed" -Muster der modernen Medizin, verlangen traditionelle Kräutermedizin zuerst das "Bett zur Bank" Muster, um ihre Mechanismen zu erklären. Darauf folgt eine Validierung, die im Bankstadium durchgeführt wird und für die Entwicklung von neu optim...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g)	Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN)	160922	EXD components
Filter paper	GElifesciences	99-103-952	Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	In vivo study
Sprague Dawley rats	Shanghai Laboratory Animal Center	SCXK 2007-0005	EXD-containing serum preparation
Syringe filter	Millipore	SLGP033RB	0.22 µm
gavage needles (10 ml)	Shanghai BO Ge trade sales department	59104274	Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)	Fujian Gutian Pharma Co. Ltd	H35020148	Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg)	Sunway Pharma Co. Ltd	CB07591	Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium	Gibco	12800-116	DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin	Sigma	1277	100 µg / ml
Penicillin	Sigma	4687	100 µg / ml